伍曉麗，潘 媛，趙 曉，譚 均，陳大霞

(1.重慶市中藥研究院中藥種植研究所，重慶 400065；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3.中藥資源學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；4.重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 400065)

【研究意義】玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)為玄參科玄參屬植物，以干燥根莖入藥，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主治骨蒸、癆咳、津傷便秘、溫毒發(fā)斑、目赤、咽痛、臃腫等[1]。生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)，玄參會(huì)發(fā)生明顯的連作障礙，連作的玄參爛根率、病害發(fā)生率、死苗率均高于非連作地塊。造成連作障礙的因素很復(fù)雜，主要是土壤中微生物種群失調(diào)、理化性質(zhì)改變、化感自毒物質(zhì)積累及這三者之間的相互作用[2]。生產(chǎn)實(shí)踐和大量研究表明，不同植物輪作是克服連作障礙的有效手段[3-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】林孝培等發(fā)現(xiàn)，在厚樸林下輪作玄參、大黃，比對(duì)照增產(chǎn)玄參藥材320 kg/667 m2[8]；黎妍妍等發(fā)現(xiàn)，萬壽菊—煙草輪作可提高煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度，促使生防菌、功能菌、降解菌、根際促生菌比例上升，有利于改善土壤微生態(tài)環(huán)境、緩解連作障礙[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】重慶武隆是玄參主要產(chǎn)區(qū)之一，同時(shí)也是煙草主要產(chǎn)區(qū)，二者的輪作，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。研究玄參-煙草輪作，對(duì)克服玄參連作障礙，增加當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入有積極意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】設(shè)計(jì)玄參和煙草的不同輪作模式，觀察其對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物種群結(jié)構(gòu)的影響，為生產(chǎn)上克服玄參連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

試驗(yàn)用玄參、煙草均為重慶市武隆區(qū)大田生產(chǎn)用種。

試驗(yàn)地位于重慶市武隆區(qū)仙女山鎮(zhèn)荊竹村。設(shè)煙草—玄參—玄參(A)、煙草—玄參—煙草(B)、煙草—玄參(C)三種輪作模式，每種模式3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，共計(jì)9個(gè)小區(qū)。試驗(yàn)地概況和玄參栽培方法參考陳大霞等[10]。煙草苗5月1日移栽，行株距為110 cm×55 cm。每個(gè)小區(qū)面積36 m2。按照常規(guī)施肥，其中施純氮為100 kg/hm2，氮、磷、鉀重量比為1∶1∶3。

在最后一茬作物收獲時(shí)收集根際土壤樣本。采用“抖根法”，將植株根系從土壤中挖出并抖掉與根系松散結(jié)合的土體，然后采集與根系緊密結(jié)合的土壤，裝自封袋，小區(qū)內(nèi)按照五點(diǎn)法取樣，五個(gè)樣混合為一個(gè)樣品。共計(jì)9個(gè)樣品。用車載冰箱帶回存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 土壤養(yǎng)分檢測 有效鉀：火焰光度法；有效磷：比色法；有效氮(水解性氮)：堿解擴(kuò)散法；有機(jī)質(zhì)：重鉻酸鉀法；pH：酸度計(jì)法[11]。

1.2.2 土壤酶活性檢測 土壤過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶分別使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司Solid-Catalase、Solid-Urease、Solid-Sucrase、S-AKP/ALP試劑盒檢測，檢測方法參照說明書。

1.2.3 土壤微生物檢測 土壤真菌和細(xì)菌檢測由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行，采用CTAB法提取土壤微生物基因組DNA。將純化后的基因組DNA作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)。使用引物：515F，GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R，GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min；真菌擴(kuò)增ITS1區(qū)域。使用引物：ITS5-1737F，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG；ITS2-2043R，GCTGCGTTCTTCATCGATGC。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。

目的條帶用Qiagen公司生產(chǎn)的QIA quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒切膠回收。測序平臺(tái)為Illumina NovaSeq。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

通過高通量測序分析，從9個(gè)土壤樣品中共檢測到細(xì)菌79門176綱370目503科788屬342種，共檢測到真菌15門50綱120目265科470屬594種。

2.1 不同輪作模式對(duì)根際土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

不同輪作模式對(duì)土壤養(yǎng)分的影響不大，僅對(duì)pH有顯著影響(P<0.05)，其中煙草—玄參—煙草的土壤pH顯著低于煙草—玄參—玄參和煙草—玄參?？梢?，煙草和玄參輪作一次后，再種植玄參對(duì)pH沒有顯著影響，但如果再種植煙草會(huì)降低土壤pH。不同輪作模式對(duì)土壤蔗糖酶和堿性磷酸酶活性有極顯著影響(P<0.01)，對(duì)過氧化氫酶和脲酶活性無顯著影響。蔗糖酶活性煙草—玄參輪作最高，比煙草—玄參—玄參增加24.46%，比煙草—玄參—煙草增加173.99%。堿性磷酸酶活性還是煙草—玄參輪作最高，比煙草—玄參—玄參增加24.93%，比煙草—玄參—煙草增加124.38%(表1)。

2.2 不同輪作模式對(duì)根際土壤微生物的影響

2.2.1 不同輪作模式對(duì)根際土壤真菌和細(xì)菌α-多樣性的影響 由表2可見，不同輪作模式對(duì)根際土壤真菌和細(xì)菌α-多樣性沒有顯著影響。

2.2.2 根際土壤真菌和細(xì)菌種類比較 ①細(xì)菌。土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢屬是RB41、乳酸桿菌屬 (Lactobacillussp.)、苔蘚桿菌屬(Bryobactersp.)等。屬水平Terrimonassp.、Bryobactersp.、Ramlibactersp.等差異顯著，如：Terrimonassp.A、C大約是B的2～3倍；亞硝化桿菌屬(Candidatusnitrosotaleasp.)B大約是A、C的20多倍；Dongiasp.A、C大約是B的2倍(圖1、表3)。根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢種是Lactobacillusmurinus、爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)等。鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)A大約是B、C的2倍；蒂莫內(nèi)馬賽菌(Massiliatimonae)B、C大約是A的2倍；ParaburkholderiacaribensisB大約是A、C的4倍；Rhodospirillaceae bacterium B分別是A、C的3、5倍(圖2、表4)。②真菌。根際土壤真菌優(yōu)勢屬是Pseudotricharinasp.、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、被孢霉屬(Mortierellasp.)，優(yōu)勢種是Pseudotricharinaintermedia、Coprinopsistrispora等。不同輪作模式根際土壤屬水平前30的真菌OTUs 絕對(duì)豐度僅赤霉屬±90.42 Bb、749.33±117.74 ABa、932.00±362.37 Aa；種水平前30的真菌OTUs 絕對(duì)豐度僅錯(cuò)綜赤霉Gibberella_intricans有顯著性差異，A、B、C分別是 240.67±85.41 Bb、742.00±109.82A Ba、925.33±355.13 Aa，B和C分別是A的3、4倍左右(圖3～4)。

表1 不同輪作模式對(duì)根際土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

表2 不同輪作模式對(duì)根際土壤真菌和細(xì)菌α-多樣性的影響

圖1 根際土壤屬水平前10的細(xì)菌(不含其他)Fig.1 Top 10 bacteria in rhizosphere soil at genus level (not containing ‘others’)

表3 根際土壤屬水平前30的細(xì)菌OTUs 絕對(duì)豐度比較

續(xù)表3 Continued table 3

圖2 根際土壤種水平前10的細(xì)菌(不含其他)Fig.2 Top 10 bacteria in rhizosphere soil at species level (not containing ‘others’)

圖3 根際土壤屬水平前10的真菌(不含其他)Fig.3 Top 10 fungi in rhizosphere soil at genus level (not containing ‘others’)

Gibberellasp.有顯著性差異，A、B、C分別是245.00

圖4 根際土壤種水平前10的真菌(不含其他)Fig.4 Top 10 fungi in rhizosphere soil at species level (not containing ‘others’)

2.3 各因素相關(guān)性分析

過氧化氫酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶活性和土壤pH值均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，真菌多樣性和脲酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，細(xì)菌多樣性和有效氮呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。幾種酶活性之間也有顯著或極顯著相關(guān)性(表5)。

根際土壤細(xì)菌、真菌在種水平相互之間具有相關(guān)性，與土壤養(yǎng)分、酶活也具有相關(guān)性，有的呈負(fù)相關(guān)，有的呈正相關(guān)。過氧化氫酶對(duì)微生物種類影響較大，影響細(xì)菌Paraburkholderiacaribensis和硝化螺旋菌Nitrospirajaponica等3種微生物的數(shù)量。反過來看，與細(xì)菌Paraburkholderiacaribensis和硝化螺旋菌Nitrospirajaponica相關(guān)的因素最多，尤其受土壤理化因素影響很大。土壤微生物中，Paraburkholderiacaribensis只與Nitrospirajaponica呈極顯著正相關(guān)，Nitrospirajaponica和Paraburkholderiacaribensis、真菌Humicolasp.呈顯著或極顯著相關(guān)。爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)受土壤理化性質(zhì)影響不大，但和鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus4)、芽單孢菌門的Gemmatimonadetesbacterium、酸桿菌科的AcidobacteriaceaebacteriumKBS 96、鞘脂桿菌綱的SphingobacteriiabacteriumWF20、未知真菌GS08 sp.等具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(表6)。

表4 根際土壤種水平前30的細(xì)菌OTUs 絕對(duì)豐度比較

表5 根際土壤養(yǎng)分、酶活與微生物多樣性間的相關(guān)性

3 討 論

玄參和煙草的3種輪作模式對(duì)土壤pH、蔗糖酶活性、堿性磷酸酶活性有顯著影響。蔗糖酶可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能夠被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖，其活性反映了土壤有機(jī)碳累積與分解轉(zhuǎn)化的規(guī)律。堿性磷酸酶對(duì)土壤有機(jī)磷的礦化及植物的磷素營養(yǎng)有重要影響?？梢?，煙草玄參輪作一季較好，后面無論再輪作一茬煙草或連作一茬玄參都對(duì)會(huì)減低土壤酸堿度和酶活。

3種輪作模式對(duì)真菌和細(xì)菌的多樣性均沒有顯著影響。輪作模式雖然沒有改變微生物多樣性，但改變了細(xì)菌和真菌的種群結(jié)構(gòu)，二者的種類在屬、種水平均有顯著差異。而細(xì)菌差異顯著的種類遠(yuǎn)多于真菌，因?yàn)橥寥乐屑?xì)菌種類和數(shù)量比真菌多，也說明輪作模式對(duì)細(xì)菌種群的影響比真菌更大。從屬水平看，與土壤碳循環(huán)相關(guān)的苔蘚桿菌屬(Bryobactersp.)[12]、硝化作用相關(guān)的亞硝化桿菌屬(CandidatusNitrosotalea)[13]、分解有機(jī)質(zhì)和利用碳源相關(guān)的CandidatusSolibacter屬[12]的數(shù)量，煙草—玄參—煙草遠(yuǎn)多于煙草—玄參和煙草—玄參—玄參。從種水平看，固氮菌埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)[14]的數(shù)量，煙草—玄參—煙草多于煙草—玄參(C)；生防菌蒂莫內(nèi)馬賽菌(Massiliatimonae)[15]的數(shù)量，煙草—玄參—煙草多于煙草—玄參—玄參，可見煙草—玄參—煙草有利于提高土壤中部分有益微生物的數(shù)量。

表6 排名前10的根際土壤細(xì)菌、真菌種水平與土壤養(yǎng)分和酶活性的相關(guān)性分析

土壤養(yǎng)分、酶活與微生物多樣性有顯著或極顯著相關(guān)性。pH與過氧化氫酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶有極顯著正相關(guān)，劉瑩等[16]發(fā)現(xiàn)遼藁本(LigusticumjeholenseNakai et Kitag)根際土壤pH與蔗糖酶、過氧化氫酶活性呈極顯著正相關(guān)，孫永磊等也發(fā)現(xiàn)pH與蔗糖酶活性呈顯著正相關(guān)[17]；而蔗糖酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶彼此之間也呈顯著或極顯著正相關(guān)，汪子微等[18]發(fā)現(xiàn)土壤蔗糖酶和堿性磷酸酶之間呈顯著正相關(guān)；脲酶與真菌多樣性呈顯著正相關(guān)。土壤脲酶在培肥土壤方面具有重要的作用，它能把高分子化合物水解成為植物和微生物易吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，從而培肥土壤，提高營養(yǎng)物的利用率[19]。脲酶活性強(qiáng)，土壤肥力高，有利于真菌生長；同理，土壤有效氮含量也顯著影響細(xì)菌的多樣性。

根際土壤養(yǎng)分、酶活與細(xì)菌、真菌在種水平也具有相關(guān)性。如過氧化氫酶對(duì)細(xì)菌種水平的影響較大，與Nitrospirajaponica呈極顯著負(fù)相關(guān)，Nitrospirajaponica參與土壤硝化作用，它的含量與土壤pH、過氧化氫酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶等多種土壤理化因素呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明這幾種理化因素除了直接影響硝化作用，也通過影響相關(guān)微生物種類和數(shù)量間接影響硝化作用。

而根際土壤細(xì)菌、真菌在種水平相互之間具有相關(guān)性。如植物根際抗逆促生細(xì)菌爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)受土壤理化性質(zhì)影響不大，但和多種細(xì)菌和真菌具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[20-22]。

土壤理化性質(zhì)和微生物種群結(jié)構(gòu)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系可以解釋為什么單純的微生物農(nóng)藥應(yīng)用于根部病害效果不穩(wěn)定，因?yàn)樗幕钚猿耸芷渥陨頂?shù)量和活力的影響外，土壤理化性質(zhì)、土著微生物數(shù)量或活性等多種因素都會(huì)對(duì)它造成直接或間接影響。

這種聯(lián)系也可以預(yù)測化學(xué)農(nóng)藥模式不可持續(xù)，長時(shí)間大劑量應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥在殺滅有害菌的同時(shí)，也會(huì)殺滅生防菌、有益菌或與有益菌、病原菌有顯著相關(guān)關(guān)系的菌群，造成用藥劑量越來越大，效果卻越來越差的局面。

此外，為了單純追求產(chǎn)量和效益，化學(xué)肥料、除草劑等的大范圍使用改變了土壤的理化性質(zhì)，直接或間接造成土壤菌群失調(diào)，使作物的病害日益嚴(yán)重。

4 結(jié) 論

煙草—玄參—煙草輪作比煙草—玄參—玄參連作和煙草—玄參輪作一季土壤微生物構(gòu)成稍有改善，但并不明顯，還對(duì)土壤酶活和pH有不良影響，因此，煙草與玄參輪作并非最佳的選擇，需要用其他作物與玄參輪作，做進(jìn)一步的比較。

提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，防治病害最根本的方法還是通過優(yōu)化栽培制度、改良栽培措施、提升施肥技術(shù)等手段來恢復(fù)土壤活力，從而達(dá)到“治未病”的效果。