孫 薇， 榮 娜， 簡思杰， 晁 嘉， 劉 祥,2*， 丁 銳， 陳 銳

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 中德天然產(chǎn)物研究所， 陜西 漢中 723000)

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescents)為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于水體和土壤中，是危害魚類和水產(chǎn)軟體動(dòng)物的常見病原菌，可感染鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚(Rassiusaumtus)、草魚 (Ctenopharyngodonidellus)、青魚(Mylopharyngdonpiceus)等多種淡水魚類引發(fā)敗血病和赤皮病[1]；病魚的主要癥狀為口鼻出血，鱗片脫落并伴有血絲；解剖可見其肝臟腫大、出血，腎臟和腸道充血等癥狀[2]。目前，該病原菌的治療主要依賴于抗生素，而抗生素濫用易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性提高、藥物殘留和水體污染[3-4]。疫苗是抵御該菌感染的有效途徑，然而該菌的亞單位疫苗尚未開發(fā)。

外膜蛋白位于細(xì)菌的最外層，在疾病的診斷和疫苗的開發(fā)上有重要作用[5],同時(shí)也是細(xì)菌在復(fù)雜環(huán)境中生存和致病不可或缺的毒力因子；感染途徑主要為細(xì)菌定殖、入侵、逃避宿主防御和影響宿主免疫系統(tǒng)等，直接參與病原菌的多種致病機(jī)制[6]。研究顯示，熒光假單胞菌的OprE和OprQ孔蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的滲透性，增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的能力[7]；重組的外膜蛋白TdrA免疫比目魚(Flounder)，能夠激發(fā)比目魚的特異性和非特異性免疫功能，從而有效抵御熒光假單胞菌感染[8]。SlyB蛋白是革蘭氏陰性細(xì)菌的一個(gè)主要外膜脂蛋白，與菌體細(xì)胞膜的完整性有關(guān)[9]。目前，對于熒光假單胞菌SlyB蛋白的免疫保護(hù)功能尚未見報(bào)道。

本研究選取熒光假單胞菌主要外膜脂蛋白SlyB為研究對象，原核表達(dá)、純化SlyB蛋白，探究其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，免疫小鼠制備多克隆抗血清并探究SlyB抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌的相互識別作用，以及抵抗魚血漿殺菌的作用，結(jié)合SlyB生物信息學(xué)分析，為熒光假單胞菌SlyB亞單位疫苗的研究提供理論參考。

1 試驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株及供試動(dòng)物

熒光假單胞菌ATCC 13525、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、Escherichiacoli(E.coli) DH5α、BL21菌株及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存；4～5周齡昆明鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周，每日定量喂食供水。

1.1.2 主要試劑

rTaq聚合酶、T4-DNA連接酶、內(nèi)切酶BamH Ι和XhoΙ來自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工公司；IPTG、TMB顯色液購自西安赫特生物科技有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自Sigma公司；引物合成、基因測序由天潤奧科生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取不同種類的細(xì)菌的SlyB蛋白序列相關(guān)信息如表1所示。通過GeneDoc軟件和MEGA軟件序列比對和構(gòu)建發(fā)育樹；采用ProParam數(shù)據(jù)庫預(yù)測SlyB的氨基酸數(shù)、分子量大小、等電點(diǎn)、穩(wěn)定指數(shù)等參數(shù)，并從ProScale analysis數(shù)據(jù)庫中獲取親水性圖譜；采用軟件TMHMM 2.0和Signal P3.0預(yù)測SlyB的跨膜區(qū)域和信號肽位置，并利用軟件SOPMA和SWISS-MODEL分別進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。最后使用STRING軟件在線構(gòu)建SlyB與其他蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

表1 不同細(xì)菌SlyB蛋白的信息

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑取SlyB表達(dá)菌單菌落于試管中過夜培養(yǎng)，以1∶100轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為0.6，加入0.1 mol/L的IPTG，搖床誘導(dǎo)6 h，取1 mL菌液收集菌體，加入300 μL 2×SDS吹打混勻，高溫變性蛋白5 min，離心取上清10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測SlyB的表達(dá)情況，結(jié)合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳切膠法純化SlyB蛋白。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

以L9(34)模型(表2)進(jìn)行SlyB的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件研究。以1∶100將過夜培養(yǎng)的SlyB飽和菌液轉(zhuǎn)接至600 mL培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至設(shè)定的不同OD600值，按照不同試驗(yàn)組合要求加入不同終濃度的IPTG并在規(guī)定條件下誘導(dǎo)，每個(gè)組合進(jìn)行3組重復(fù)。收取1 mL誘導(dǎo)菌液，沉淀加入300 μL 2×SDS，高溫變性蛋白5 min，樣品通過SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下SlyB蛋白的表達(dá)圖譜。使用軟件Phoretix 1D和SPSS 13.0分別進(jìn)行表達(dá)圖譜光密度和不同因子的顯著性分析。

表2 SlyB表達(dá)條件試驗(yàn)的因子與水平

1.2.5 蛋白免疫小鼠抗血清的制備及特異性檢測

利用蛋白免疫小鼠制備多克隆抗血清。選取昆明鼠試驗(yàn)組和對照組各5只，試驗(yàn)組每只取純化的SlyB蛋白100 μg混合100 μL弗氏完全佐劑，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐劑，二次免疫小鼠。7 d后，進(jìn)行第三次免疫；對照組免疫PBS。第三次免疫7 d后眼球取血，靜置待血清自然析出后于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集抗血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Western blotting驗(yàn)證SlyB抗血清特異性。SDS-PAGE電泳嗜水氣單胞菌全蛋白，恒壓80 V轉(zhuǎn)NC膜1 h，NC膜充分封閉2 h后與不同稀釋倍數(shù)(1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800)的SlyB抗血清于37 ℃輕搖孵育40 min，對照為陰性抗血清。用TNT緩沖液沖洗3次，再與1∶3000倍稀釋的二抗于37 ℃輕搖孵育1 h，洗滌后通過DAB顯色法確定SlyB抗血清的特異性。

1.2.6 體外模擬蛋白抗血清與魚類主要病原菌的相互作用

ELISA方法檢測蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌的相互作用：培養(yǎng)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌分別至OD600約1.0，菌體用體積分?jǐn)?shù)1%的甲醛生理鹽水85 ℃滅活，生理鹽水調(diào)整菌液OD600=0.2，分裝為1 mL/管(菌量108cfu)，小管菌分別與100 μL不同稀釋倍數(shù)的蛋白抗血清(1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400)孵育90 min，對照為陰性血清，再與200 μL 1∶3000倍稀釋的二抗孵育1 h，洗滌菌體并混合20 μL PBS至酶標(biāo)板中，加入200 μL TMB顯色液，避光顯色10 min，加入終止液2 mol/L H2SO450 μL，450 nm讀數(shù)。

1.2.7 SlyB蛋白抵抗魚血漿的殺菌作用

熒光假單胞菌經(jīng)30 ℃過夜培養(yǎng)，以1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL新培養(yǎng)液中,培養(yǎng)至OD600為0.5，菌體用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的生理鹽水洗滌并調(diào)整OD600為1.0，收取8管1 mL菌液離心獲取菌體,小管菌分別與600 μL不同稀釋倍數(shù)的魚血漿(未稀釋血漿，與生理鹽水按體積比1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64稀釋，生理鹽水)于30 ℃、200 r/min孵育5 h。孵育后菌體用生理鹽水洗滌3次，SDS-PAGE分離全蛋白并轉(zhuǎn)NC膜，NC膜充分封閉后依次與一抗、二抗孵育,通過DAB顯色液進(jìn)行顯色。對比特異性條帶的亮度，分析SlyB的差異表達(dá)以評價(jià)其抵抗魚血漿的殺菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 SlyB同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過GeneDoc軟件繪制不同細(xì)菌SlyB氨基酸同源性分析(圖1A)，結(jié)果顯示，SlyB蛋白在假單胞菌屬、桿菌屬間同源性較好。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1B)，發(fā)現(xiàn)魚類主要致病菌(熒光假單胞菌、鮭魚氣單胞菌、副溶血性弧菌)的親緣關(guān)系較近?？梢?，SlyB免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體可能對不同種類的魚類致病菌具有交叉免疫保護(hù)作用。

圖1 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.2 SlyB理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與蛋白互作預(yù)測

ProtParam數(shù)據(jù)庫分析顯示：SlyB含有308個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為32 331.53 u，等電點(diǎn)為9.33，半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為34.88，歸類為穩(wěn)定蛋白；親水性圖譜分析得出SlyB親水性平均值為-0.353，屬于親水性蛋白(圖2A)；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測圖譜(圖2B)顯示，分別在7-29、44-66、87-109存在跨膜區(qū)域，表明全序列中預(yù)測到的跨膜域可信度較高，該蛋白屬于外膜蛋白；信號肽預(yù)測結(jié)果(圖2C)顯示，SlyB的N端1-29位氨基酸組成了信號肽序列，29-30位氨基酸之間存在切割位點(diǎn)，可信度達(dá)到0.655；SOPMA軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，α-螺旋占全序列57.47%，延伸鏈占全序列5.84%，無規(guī)則卷曲占36.69%(圖2D)；SWISS-MODEL軟件預(yù)測結(jié)果顯示，SlyB的三維結(jié)構(gòu)為異二聚體(圖2E)；通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)有5種蛋白可與SlyB相互作用，其中蛋白gloA和ompX與ExbB作用關(guān)系最為緊密(圖2F)。

A.親水性預(yù)測; B.跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測; C.信號肽預(yù)測; D.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測; E.三級結(jié)構(gòu)預(yù)測; F.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2 SlyB重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化

利用引物F-SlyB、R-SlyB擴(kuò)增slyB基因，電泳顯示在約900 bp處存在單一條帶(圖3A)，大小與理論值927 bp相符。重組質(zhì)粒pET-32a-slyB經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，獲得一條約900 bp的條帶，大小符合預(yù)期(圖3B)。目的基因經(jīng)測序比對后與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的slyB基因序列一致，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21獲得SlyB表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，電泳顯示目標(biāo)蛋白成功表達(dá)，分子量大小約54 kDa；利用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得SlyB蛋白(圖3C)。

A.PCR擴(kuò)增slyB基因; B.重組質(zhì)粒pET-32a-slyB雙酶切; C.SlyB蛋白表達(dá)純化 M1.DNA Marker; M2.蛋白Marker; 1.slyB基因; 2.重組質(zhì)粒pET-32a-slyB;3.BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切; 4.未誘導(dǎo)菌株; 5.誘導(dǎo)菌株; 6.純化的SlyB蛋白

2.3 SlyB蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

利用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化SlyB蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件。誘導(dǎo)菌經(jīng)SDS-PAGE獲得不同誘導(dǎo)條件下SlyB的表達(dá)量存在差異，如圖4所示。圖譜光密度值見表3，所得極差和方差分析見表4、表5。從表4可得出，在誘導(dǎo)SlyB菌株表達(dá)時(shí)，最佳組合為A3B2C3D2，即在菌液OD600為1.0的時(shí)候加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，32 ℃誘導(dǎo)12 h。表5分析結(jié)果顯示，不同誘導(dǎo)條件下均未達(dá)到顯著性，表明菌液OD600值、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對于SlyB蛋白的高效表達(dá)影響不大。

表3 SlyB蛋白表達(dá)圖譜光密度分析

A、B、C為3次重復(fù); M.蛋白marker; 1.未誘導(dǎo)菌株; 2—4.OD600值為0.5，誘導(dǎo)溫度分別為28、37、32 ℃;5—7.OD600值為0.8,誘導(dǎo)溫度分別為28、32、37 ℃; 8—10. OD600值為1.0,誘導(dǎo)溫度分別為37、32、28 ℃

表4 SlyB表達(dá)圖譜光密度數(shù)值的極差分析

表5 SlyB表達(dá)圖譜光密度數(shù)值的方差分析

2.4 SlyB蛋白抗血清的特異性與效價(jià)檢測

Western blotting結(jié)果顯示SlyB抗血清與SlyB蛋白特異性結(jié)合，呈現(xiàn)出明顯的單一條帶，陰性對照無條帶，表明SlyB具有良好的免疫原性，效價(jià)達(dá)到1∶12 800(圖5)。

M為蛋白Maker; 1—4.抗血清稀釋倍數(shù)分別為1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800; 5.陰性血清(1∶1600倍稀釋)

2.5 體外模擬蛋白抗血清與魚類主要病原菌

ELISA體外模擬SlyB抗血清與魚類主要病原菌——嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌的免疫識別作用。結(jié)果為隨著抗血清稀釋倍數(shù)的增大，SlyB抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌的結(jié)合能力逐漸減弱，當(dāng)抗體滴度達(dá)1∶12 800時(shí)，仍可檢測到SlyB抗血清與3種菌的相互作用(圖6)?？梢?，SlyB抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌存在體外相互作用，表明SlyB具有良好的抗原性。

(a)SlyB抗血清與嗜水氣單胞菌 (b)SlyB抗血清與熒光假單胞菌

2.6 SlyB蛋白抵抗魚血漿的殺菌作用

采用Western blotting方法檢測SlyB與魚血漿作用后的差異表達(dá)情況，體外模擬SlyB抵抗魚血漿對熒光假單胞菌的殺菌作用。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對照組SlyB均檢測到特異性條帶，而隨著血漿濃度的降低，SlyB的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(圖7)，推測SlyB蛋白對抗血漿殺菌具有一定的作用。

M.蛋白Marker;1.未稀釋血漿; 2—7.血漿稀釋倍數(shù)分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64;8.陽性對照(生理鹽水)

3 結(jié)論與討論

熒光假單胞菌主要引起熱帶魚、鮭科魚類和多種魚類的敗血病和赤皮病，多是魚類體表受傷后在損傷之處產(chǎn)生潰瘍性紅斑，進(jìn)而誘發(fā)疾病的發(fā)生，死亡率大，發(fā)病后期難以治愈[10]。外膜脂蛋白是外膜蛋白中重要的一類蛋白，在疾病的診斷和蛋白疫苗開發(fā)上有重要的作用[6,11]。本研究對SlyB的理化參數(shù)、保守功能域、信號肽、亞細(xì)胞定位、親/疏水性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlyB蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，并且存在3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主。α-螺旋區(qū)負(fù)責(zé)與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，從而促進(jìn)了膜結(jié)構(gòu)的完整性，極有可能成為B細(xì)胞抗原表位的優(yōu)勢區(qū)域[12-13]。同源性分析顯示SlyB蛋白在假單胞菌屬、桿菌屬間同源性較好，系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)魚類主要致病菌(熒光假單胞菌、鮭魚氣單胞菌、副溶血性弧菌)的親緣關(guān)系較近。由此推測，SlyB免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體可能對不同種類的魚類致病菌具有交叉免疫保護(hù)作用。通過分子克隆、原核表達(dá)及純化，成功構(gòu)建SlyB蛋白表達(dá)菌株，將純化獲得的蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體。

目前多克隆抗體的制備因操作簡單、靈敏度高被廣泛應(yīng)用[14]。吳鋼濤等[15]采用A族毒素人工抗原3-Ac-NEOS-HS-BSA免疫新西蘭長耳白兔，分離血清制備A型單族毒素多克隆抗體。徐逍等[16]以Balb/C小鼠為受免動(dòng)物，采用優(yōu)化的免疫抗原和檢測抗原合成技術(shù)及免疫方式獲得高滴度、強(qiáng)特異性和高親和力的多克隆抗體。本研究采用SlyB蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，Western blotting測定效價(jià)為1∶12 800，為SlyB的免疫功能研究奠定基礎(chǔ)。

進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)。榮娜等[17]利用分子克隆構(gòu)建P5表達(dá)菌株并確定其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：誘導(dǎo)時(shí)菌液濃度OD600=1.0，IPTG濃度0.5 mmol/L，32 ℃誘導(dǎo)8 h；Chen C等[18]探究溶藻弧菌FlaC蛋白的最佳表達(dá)條件包括菌株OD600值0.8，IPTG濃度0.1 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)8 h。劉祥等[19]通過構(gòu)建大腸埃希菌外膜蛋白OmpA原核表達(dá)載體，優(yōu)化其表達(dá)條件：菌OD600值達(dá)0.5時(shí)加入終濃度0.3 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)12 h。本研究以熒光假單胞菌外膜蛋白SlyB為研究對象，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳誘導(dǎo)條件為在菌液OD600為1.0時(shí)加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，32 ℃誘導(dǎo)12 h，為后續(xù)的大批量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持以及SlyB的功能研究奠定基礎(chǔ)。

酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)具有良好的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性以及簡便等特點(diǎn)，在免疫學(xué)試驗(yàn)中廣泛運(yùn)用[20-21]。趙凱等[14]通過小麥蛋白單抗、多抗及雙抗夾心ELISA快速定性檢測技術(shù)的研究，檢測限最低達(dá)到10 ng/mL，滿足食品中微量過敏原的檢測需求；HUET等[22]介紹了一種基于免疫化學(xué)的多殘留篩選方法(ELISA)的開發(fā)，測定食品中的(氟)喹諾酮?dú)埩?。?shí)驗(yàn)室前期使用免疫酶聯(lián)法模擬P5抗血清對嗜水氣單胞菌的體外識別，證實(shí)存在識別作用；LIU Xiang等[23]使用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CM-TEP抗體與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在直接的相互作用。本實(shí)驗(yàn)在使用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SlyB抗血清與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌存在體外免疫識別作用，表明SlyB蛋白對這3種菌的感染可能具有免疫保護(hù)作用。此外，前期通過體外模擬嗜水氣單胞菌P5蛋白抵抗魚血漿對嗜水氣單胞菌的殺菌作用，結(jié)果顯示P5蛋白的表達(dá)呈上調(diào)趨勢；本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬魚血漿殺菌作用，發(fā)現(xiàn)隨著血漿濃度的降低，SlyB蛋白的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，表明SlyB蛋白對抗血漿殺菌可能存在一定的作用。

本研究獲得熒光假單胞菌SlyB蛋白表達(dá)菌株，純化SlyB蛋白，制備SlyB多克隆抗血清，檢測其特異性，優(yōu)化發(fā)酵條件，并綜合其抗血清與菌體外識別作用以及抗血漿殺菌作用。結(jié)果獲得特異性較好的抗血清，并與嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和溶藻弧菌存在體外識別作用，而且可能抵抗魚血漿對熒光假單胞菌的殺菌作用。因此，SlyB蛋白的研究有望為熒光假單胞菌免疫功能學(xué)奠定基礎(chǔ)。