肖 敏,奚燕萍,雷彩霞

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心,中國(guó) 上海 200011)

纖毛的運(yùn)動(dòng)在身體中起著許多重要的作用[1]。以纖毛帶動(dòng)的黏液運(yùn)動(dòng)是呼吸道多纖毛上皮細(xì)胞表面協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),形成黏液纖毛清除的主要宿主防御機(jī)制。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,腦脊液的流動(dòng)是由位于腦室的纖毛調(diào)節(jié)的。在生殖系統(tǒng)中,輸卵管纖毛幫助卵子向子宮推進(jìn);精子鞭毛在結(jié)構(gòu)上與纖毛高度相關(guān),驅(qū)動(dòng)雄性配子運(yùn)動(dòng)。在胚胎發(fā)生早期,纖毛在左右不對(duì)稱發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用,它對(duì)于在側(cè)板中胚層誘導(dǎo)不對(duì)稱基因表達(dá)級(jí)聯(lián)是必要的,決定了人體內(nèi)臟器官在位置及形態(tài)上呈左右不對(duì)稱分布[2]。

原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(primary ciliary dyskinesia,PCD,MIM:244400)是一種遺傳異質(zhì)性常染色體隱性遺傳為主的罕見纖毛病[3],發(fā)病率約1/20 000[4～7]。其特點(diǎn)是纖毛運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和功能異常,這種纖毛功能障礙可導(dǎo)致黏液纖毛清除缺陷,從而導(dǎo)致慢性上、下氣道感染(如支氣管炎和鼻竇炎),且近一半的病例會(huì)出現(xiàn)內(nèi)臟轉(zhuǎn)位。男性不育和女性生育能力降低在PCD中也很常見。PCD由于缺乏表征特異性,很難通過臨床表型直接診斷。結(jié)合透射電子顯微鏡、高速視頻顯微鏡和免疫熒光診斷工具分析患者纖毛形態(tài)和功能,是目前PCD診斷的主趨勢(shì)。同時(shí),基因檢測(cè)也逐步被應(yīng)用,因?yàn)槠駷橹辜s有40個(gè)基因被鑒定與PCD有關(guān)[8]。中國(guó)人群關(guān)于PCD致病基因的研究報(bào)道開始于2007年,現(xiàn)在總約12篇涉及17例中國(guó)PCD患者基因突變的相關(guān)報(bào)道[9～11]。Kartagener綜合征是PCD最常見的一種亞型,占PCD的40%～55%[4,6],因伴有內(nèi)臟轉(zhuǎn)位而歸類命名。

CCDC151(coiled-coil domain containing 151),別名 MGC20983、ODA10(outer dynein arms 5),其編碼的纖毛蛋白參與外動(dòng)力蛋白臂組裝和所需的運(yùn)動(dòng)纖毛功能,該基因是PCD致病基因之一,但國(guó)際范圍內(nèi)其突變的報(bào)道較少,中國(guó)人群僅發(fā)現(xiàn)1 例 CCDC151 c.167delG(p.G56Dfs*26)純合突變[12]。本研究檢測(cè)到中國(guó)人群純合子CCDC151 c.1059C＞A(p.Tyr353*)致病性變異1例,且首次報(bào)道了CCDC151基因變異導(dǎo)致無精子癥不育表型;同時(shí),總結(jié)了CCDC151基因突變譜,以利于后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 患者資料

患者,男,29歲,夫妻雙方染色體核型均正常,自述性生活規(guī)律,未避孕,未孕?；颊呒抑歇?dú)子,內(nèi)臟反位,無精子癥,AZF(azoospermia factor,Y chromosome gene)無缺失。外院診斷為梗阻性無精子癥,考慮Kartagener綜合征,患者父母為姨表親。行睪丸切開取精術(shù)+輸精管探查術(shù)+附睪取精術(shù),精子冷凍保存?zhèn)溆糜谳o助生殖。本研究通過上海集愛遺傳與不育診療中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署了相關(guān)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提和外顯子捕獲測(cè)序

按照凱杰DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程從患者外周靜脈血中分離基因組DNA(gDNA),采用Covaris技術(shù)將質(zhì)控合格的gDNA樣本隨機(jī)打斷成150～250 bp片段,并對(duì)DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加尾、連接接頭及純化。采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)對(duì)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用安捷倫Clear-Seq遺傳性疾病試劑盒和SBS試劑盒進(jìn)行外顯子組雜交捕獲。在Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行全外顯子測(cè)序。與人類參考基因組序列比對(duì),95%的目標(biāo)捕獲區(qū)域的測(cè)序深度大于20X。醫(yī)學(xué)相關(guān)外顯子及上下游20 bp序列的平均測(cè)序深度≥94X,其中97%的目標(biāo)序列的測(cè)序深度達(dá)20X以上。對(duì)所有測(cè)序片段進(jìn)行堿基識(shí)別。二級(jí)分析流程主要采用Sentieon軟件套裝進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)分析。測(cè)序片段通過Sentieon BWA與UCSC hg19參考基因組進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 變異注釋和篩選流程

變異采用VEP(Variant Effect Predictor)軟件進(jìn)行注釋。每個(gè)堿基的測(cè)序深度及變異預(yù)測(cè)均從所有基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得。三個(gè)主要的收錄已知或疑似致病變異的數(shù)據(jù)庫(kù),包括ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、人類孟德爾遺傳在線(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org/)和人類遺傳疾病突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gene Mutation Database,HGMD,http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php),用于篩選已知的致病變異,同時(shí)采用多種工具預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異的功能以及非編碼調(diào)控序列的注釋等?；谌巳旱拇笠?guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)用于排除在正常人群中具有較高頻率的變異。需注意的是,變異注釋過程使用的各公共或私有數(shù)據(jù)庫(kù)定期進(jìn)行更新,因此分析本例數(shù)據(jù)時(shí),存在最新的文獻(xiàn)證據(jù)未同步到相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中的可能。拷貝數(shù)變異分析是基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析測(cè)序,采用NextGENe軟件(version 2.4.2.3)。變異致病性分類主要參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)和美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)(Association for Molecular Pathology,AMP)、ClinGen(Clinical Genome Resource)變異解讀工作組等發(fā)布的相關(guān)序列變異分類指南進(jìn)行解讀?；蛎捎脟?guó)際人類基因組組織基因命名委員會(huì)(HUGO Gene Nomenclature Committee,HGNC)的命名規(guī)范。變異命名采用人類基因組變異學(xué)會(huì)(Human Genome Variation Society,HGVS)的命名規(guī)范。人類基因組參考序列版本為GRCh37/hg19。

1.2.3 Sanger驗(yàn)證

提取患者的外周血樣本DNA。使用自動(dòng)測(cè)序儀(3500XL Genetic Analyzer,Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA,U.S.A.)從正向和反向兩個(gè)方向?qū)颊叩淖儺愡M(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。按照參考序列NM_145045.5(13個(gè)外顯子)進(jìn)行外顯子編號(hào)。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。Sanger測(cè)序的序列分析采用FinchTV軟件(version 1.4.0)。Sanger測(cè)序所用引物為CCDC151-chr19-11534603-F1:AAACTGAACGGTAGCTGGAGGG和CCDC151-chr19-11534603-R1:CTTCCCTCCAGTTTGAGCCCTG。

2 結(jié)果與分析

2.1 先證者全外顯子組測(cè)序及驗(yàn)證

基于患者的臨床表型,選用以下人類表型標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(Human Phenotype Ontology,HPO)以篩選合適候選致病基因:HP:0012262:abnormal ciliary motility、HP:0001696:situs inversus totalis和 HP:0000027:azoospermia。經(jīng)篩選,全外顯子組測(cè)序結(jié)果顯示,患者CCDC151(NM_145045.5)基因第8外顯子 c.1059C＞A(p.Tyr353*)純合突變(圖1),該突變可導(dǎo)致PCD 30型(ciliary dyskinesia,primary,30)[MIM:616037]:一種以運(yùn)動(dòng)纖毛異常為特征的疾病。由于呼吸道纖毛的缺陷,呼吸道感染導(dǎo)致慢性炎癥和支氣管擴(kuò)張經(jīng)常發(fā)生。由于胚胎淋巴結(jié)的纖毛功能障礙,患者可能表現(xiàn)出左右身體不對(duì)稱和位置反轉(zhuǎn)的隨機(jī)化。經(jīng)Sanger反向引物測(cè)序驗(yàn)證,該純合變異真實(shí)存在(正向引物檢測(cè)失敗)(圖2)。

圖1 全外顯子組測(cè)序點(diǎn)突變的可視化展示(Integrative Genomics Viewer,IGV)第一行是染色體位置坐標(biāo),標(biāo)黃列表示突變位置。Fig.1 Integrative Genomics Viewer(IGV)for whole exome sequencing mutationsThe first row is the chromosome position coordinates,and the yellow column represents the mutation position.

圖2 患者CCDC151基因突變家系圖及Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果M表示攜帶c.1059C＞A突變,N表示不攜帶c.1059C＞A突變,藍(lán)色柱狀標(biāo)記Sanger測(cè)序結(jié)果中變異所在位置。Fig.2 The family map of CCDC151 gene mutation of the patient and the Sanger sequencing verificationThe results show that M is carrying c.1059C＞A mutation and N is not.The blue bar marks the location of the mutation in the Sanger sequencing results.

2.2 變異位點(diǎn)致病性解讀

患者CCDC151基因在第8號(hào)外顯子1 059位置的堿基從C轉(zhuǎn)變到A,三聯(lián)體密碼由原來編碼酪氨酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子,閱讀框被一個(gè)過早的終止密碼子打斷,產(chǎn)生的mRNA將作為無義介導(dǎo)的mRNA被降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)(圖3)。根據(jù)ACMG指南,該致病性分類為致病(pathogenic,P)變異,證據(jù)如下:PVS1_Very Strong:在CCDC151基因中,功能喪失(loss-of-function,LOF)是一種已知的疾病機(jī)制(該基因有12個(gè)致病性的功能喪失變體),并且與PCD 30型(ciliary dyskinesia,primary,30)[MIM:616037]相關(guān),完全符合當(dāng)一個(gè)疾病的致病機(jī)制為功能喪失時(shí),檢出變異為無功能變異(無義突變、移碼突變、經(jīng)典±1或2的剪接突變、起始密碼子變異、單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失);PM2_Supporting:隱性基因CCDC151在gnomAD外顯子組數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)該變異(gnomAD外顯子組覆蓋率=76.3),在gnomAD基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也未發(fā)現(xiàn)該變異(gnomAD基因組覆蓋率=29.9),符合正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異(或隱性遺傳病中極低頻位點(diǎn));PP3_Supporting:基于 BayesDel_addAF、DANN、EIGEN、FATHMM-MKL和MutationTaster等 5種致病性預(yù)測(cè)軟件的分析均顯示其是致病性的,無良性預(yù)測(cè)結(jié)果,符合多種統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測(cè)出該變異會(huì)對(duì)基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響;PP4:患者基因型與表型高度吻合,變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。

圖3 使用Mutalyzer軟件(Mutalyzer 2.0.34,https://mutalyzer.nl)預(yù)測(cè)突變前后蛋白質(zhì)編碼的變化情況上圖表示參考蛋白質(zhì)序列的編碼情況,紅色氨基酸序列標(biāo)記突變位置的參考氨基酸序列,下圖是預(yù)測(cè)突變后的氨基酸編碼情況,紅色*號(hào)表示終止密碼子。Fig.3 Changes in protein coding before and after mutation predicted by Mutalyzer software(Mutalyzer 2.0.34,https://mutalyzer.nl)The figure above shows the coding situation of the reference protein sequence.The red amino acid sequence marks the reference amino acid sequence from the mutation position.The figure below shows the coding situation of the predicted amino acid after mutation,and the red*represents the stop codon.

基于以上分析,我們認(rèn)為c.1059C＞A(p.Tyr-353*)純合突變是患者Kartagener綜合征伴無精子癥的遺傳學(xué)病因。

3 討論

CCDC151基因位于19號(hào)染色體p13.2區(qū)域,編碼一種螺旋-螺旋軸突蛋白質(zhì),可確保外動(dòng)力蛋白臂復(fù)合體正確連接到微管卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域[13]。在需要纖毛活動(dòng)的物種中,該蛋白質(zhì)高度保守。CCDC151是衣藻ODA10基因的脊椎動(dòng)物同源體,ODA10基因在ODA相關(guān)的保守基因組裝中發(fā)揮作用[14～15]。果蠅、斑馬魚和小鼠的功能分析表明,CCDC151參與IFT(intraflagellar transport)依賴的動(dòng)力蛋白臂組裝的調(diào)節(jié)[14,16]。CCDC151-depleted斑馬魚的前腎和Kupffer’s囊的運(yùn)動(dòng)纖毛功能存在缺陷,并顯示腎囊腫和隨機(jī)左右不對(duì)稱[13～14]。CCDC151在小鼠胚胎淋巴結(jié)中也有表達(dá),且CCDC151缺陷可能導(dǎo)致小鼠纖毛不動(dòng)或運(yùn)動(dòng)障礙,以及側(cè)性缺陷[13]。Varsome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://varsome.com)查詢結(jié)果顯示,目前CCDC151基因上報(bào)道過的可能致病以及明確致病性變異約12個(gè)(表1),其中已報(bào)道的明確致病性變異均為無功能變異(c.325G＞T,p.E109*[17];c.167delG,p.G56Dfs*26[12];c.925G＞T,p.E309*[16,18];c.244+1G＞A[19];c.583_595dup13[20];c.229_233delins32[21])。

表1 Varsome在線數(shù)據(jù)庫(kù)查詢CCDC151基因已收錄變異情況Table 1 The included mutations of CCDC151 gene obtained from the Varsome online database

本研究通過先證者臨床全外顯子組測(cè)序技術(shù),在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)了CCDC151基因c.1059C＞A(p.Tyr353*)純合突變。該先證者為獨(dú)生子,父母為近親結(jié)婚,家系中僅先證者1名患者,臨床表現(xiàn)為不育、內(nèi)臟反位以及梗阻性無精子癥,其中無精癥是現(xiàn)有CCDC151基因變異中尚未描述過的表型。c.1059C＞A變異位于CCDC151基因氨基酸高度保守區(qū)域,單個(gè)位點(diǎn)變異使原來編碼酪氨酸的密碼子改變?yōu)榻K止密碼子。功能喪失是CCDC151基因(NM_145045.5)已知的疾病機(jī)制,該基因共13個(gè)外顯子,而c.1059C＞A變異位于第8號(hào)外顯子,這種情況可導(dǎo)致NMD的發(fā)生,從而導(dǎo)致該基因編碼蛋白質(zhì)的過程提前終止。根據(jù)ACMG等指南,c.1059C＞A突變可評(píng)估為致病性變異。總的來講,本研究發(fā)現(xiàn)了1個(gè)Kartagener綜合征家系的CCDC151基因新的無義突變,豐富了CCDC151基因突變譜,同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCDC151基因純合變異是導(dǎo)致患者不育及其梗阻性無精子癥的可能遺傳學(xué)病因,為后續(xù)輔助生殖治療方案提供了重要指導(dǎo)。

纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng)障礙是誘發(fā)Kartagener綜合征的根本原因[22],本研究中患者Kartagener綜合征的診斷來自于外院,且患者不愿提供詳細(xì)檢查報(bào)告,僅為口述病情,故本研究可能有一定的局限性,對(duì)于梗阻性無精子癥的診斷,缺乏睪丸體積、性激素、CT以及病理數(shù)據(jù)等梗阻性無精癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果描述,導(dǎo)致不能分析更詳細(xì)的基因型-表現(xiàn)型關(guān)系。聯(lián)合診斷有助于更詳細(xì)的PCD診斷,并可能有助于診斷病理分型。