王梓塨 邱 華 朱玟霜 李 旺 蒙蔭杰 王倩倩

細胞外囊泡在肝纖維化進展中的作用機制及臨床意義

王梓塨1邱 華2朱玟霜1李 旺1蒙蔭杰1王倩倩1

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

細胞外囊泡是多種細胞釋放的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱，囊括了外泌體、微囊泡、凋亡小體及腫瘤小泡，介導著細胞間物質(zhì)交換及信號交流。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟和影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)，其中以肝星狀細胞的活化為該環(huán)節(jié)的核心。文章具體綜述了細胞外囊泡在不同層面參與肝纖維化的調(diào)控，主要是能通過傳遞核酸、蛋白質(zhì)等參與調(diào)控肝星狀細胞活化與遷移。

細胞外囊泡；外泌體；肝纖維化；肝星狀細胞；生物標志物

引言

細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是多種細胞釋放的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱，包括外泌體、微囊泡、凋亡小體和腫瘤小泡等不同細胞亞群，在多種體液中分離出來，如血清/血漿、尿液、唾液、腹腔積液、羊水等[1]。起初EVs被視為細胞代謝后廢物排泄途徑[2]，且因此被嚴重低估，但如今EVs已被證實是一種全新的細胞間信號交流方式。在生理或病理狀態(tài)下，不同的細胞分泌攜帶不同組分的EVs，這些EVs最終被受體細胞吸收，通過物質(zhì)交換或釋放內(nèi)含物實現(xiàn)物質(zhì)和信號的交流[3,4]。

肝纖維化（Liver fibrosis，LF）是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟和影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)，其典型特征是多種膠原蛋白及細胞外基質(zhì)（ECM）的沉積。由于肝纖維化是一種可逆的病理過程，肝纖維化作為減少肝硬化、肝癌等危重癥發(fā)病率的突破點一直被高度關(guān)注。長期以來，學者針對ECM產(chǎn)生進行了大量溯源研究，最終確定肌成纖維細胞（MFB）是ECM的主要來源細胞[5]。MFB是來源于肝臟自身的活化肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）經(jīng)歷表型分化產(chǎn)生的，HSC的活化為ECM的沉積奠定了基礎(chǔ)，因此HSC活化是肝纖維化進展“通道”的核心地位已基本達成共識[6]，并由此催生了針對HSC活化機制的研究探索，以尋求開發(fā)肝纖維化的新療法。最近，一種新的肝臟內(nèi)外源性信號網(wǎng)絡(luò)被發(fā)現(xiàn)，肝臟內(nèi)外不同細胞間涉及依賴細胞外囊泡傳遞核酸、蛋白質(zhì)等信號分子，靶向HSC，通過影響HSC的活化與遷移對肝纖維化演變起雙向調(diào)控作用[7-9]。因此，圍繞EVs信號網(wǎng)絡(luò)展開探索不同細胞分泌的EVs在肝纖維化發(fā)病及進展中的作用機制及潛在的診療價值，有助于拓寬肝纖維化的診療策略，提高肝纖維化的診療水平。

1 EVs定義及分類

細胞外囊泡是指從多種細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑在40 nm～1000 nm之間[10]。根據(jù)胞外囊泡直徑不同，可分為外泌體、微囊泡、凋亡小體和腫瘤小泡四種亞群：一類是EVs由多囊泡體與質(zhì)膜融合后包裹親本細胞中的核酸，蛋白質(zhì)等物質(zhì)釋放到細胞外，稱為外泌體，直徑在30 nm～150 nm之間；一類則是直接從質(zhì)膜上脫落，稱為微囊泡（microvesicle），直徑在150 nm～1 μm之間；一類是在細胞凋亡過程中產(chǎn)生的，通過自噬體形成及發(fā)芽脫落至胞外，稱為凋亡小體（apoptotic body，ApoBDs），直徑為1 μm～5 μm；一類是腫瘤小泡（large oncosomes），在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，直徑為1 μm～10 μm[11]。長期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，EVs不同亞群中以外泌體與肝纖維化關(guān)系最為緊密，因此，本文EVs除外特殊交代，均指外泌體。

2 EVs介導肝星狀細胞的活化和遷移

2.1 EVs介導肝星狀細胞活化

目前認為，HSC活化分為啟動階段和持續(xù)階段。啟動階段表現(xiàn)為肝損傷時，TGFβ1通過絲氨酸/絡(luò)氨酸激酶途徑激活Smad2和Smad3并磷酸化，TGFβ1受體復合物轉(zhuǎn)運進入靜息型HSC胞質(zhì)，與Smad4形成異源三聚體復合物異位進入細胞核，與DNA結(jié)合后，通過和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，上調(diào)α-平滑肌動蛋白（α-SMA）及膠原相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，活化HSC，產(chǎn)生ECM。活化HSC又可作用于靜止HSC促使更多HSC激活，此為HSC活化的持續(xù)階段。整個過程有多條信號通路的參與，如TGFβ/Smad3、JAK-STAT、Wnt/β-catenin等[12,13]。HSC活化后，會朝向炎癥損傷部位遷移，參與損傷肝組織的修復，加重瘢痕沉積和肝功能損傷[14]。通過總結(jié)前人的實驗成果發(fā)現(xiàn)，損傷肝細胞、活化的HSC及肝外細胞均可釋放EVs參與HSC活化。

2.1.1 損傷的肝細胞釋放EVs誘導HSC活化

JAK-STAT信號通路的激活與HSC活化及轉(zhuǎn)分化相關(guān)[15]，受SOCS3蛋白嚴格調(diào)節(jié)。SOCS3蛋白能阻斷JAK與STAT相結(jié)合并靶向蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)來沉默該途徑[16]。有相關(guān)報道記載[17]，經(jīng)丙肝病毒感染而損傷的肝細胞，會高度表達miR-19a并經(jīng)由外泌體靶向靜止HSC，miR-19a在靜止HSC被內(nèi)化，通過結(jié)合HSC內(nèi)SOCS3的3′未翻譯區(qū)域（UTR），下調(diào)SOCS3表達量，激活JAK-STAT下游信號通路傳導，誘導靜息HSC活化及轉(zhuǎn)分化，同時增加TGF-β1基因表達，加速Smad3磷酸化，增強纖維化標志物基因表達；之后，利用具有阻斷JAK-STAT通路激活的化學抑制劑Stattic處理經(jīng)miR-19a處理的LX2細胞，TGF-β1、CTGF和TIMP1基因的表達顯著減弱。PPAR-γ過表達與人類HSCs失活及肝纖維化消退呈現(xiàn)正相關(guān)[18]。Davide[19]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精脂肪性肝纖維的患者，體內(nèi)脂毒性肝細胞衍生的EVs（hp-evs）能顯著誘導HSC從靜止型到活化型的轉(zhuǎn)化，其可能的原因是脂毒性肝細胞通過衍生hp-evs轉(zhuǎn)移脂毒性肝細胞miR-128-3p至靜止HSC，靶向靜止HSC內(nèi)過氧化物酶體增殖劑激活受體PPAR-γ并誘導其表達的下調(diào)，促進了HSC的活化、遷移和增殖。

2.1.2 活化HSC分泌EVs促進靜息型HSC的活化

經(jīng)研究，不僅受損肝細胞相關(guān)EV可誘導HSC激活，活化后的HSC-EV亦有促進靜息型HSC活化的作用，此途徑可能依賴于HSC的旁分泌機制。Li等[20]觀察發(fā)現(xiàn)，活化LX-2細胞旁分泌HSC-EV，HSC-EV會主動靶向靜止HSC，釋放FN1纖連蛋白，之后，F(xiàn)N1蛋白將以細胞表面整合素α5β1為受體，二者相結(jié)合，促使靶細胞靜止HSC激活，并促使活化HSC細胞的遷移，同時上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶或I型膠原的表達，肝纖維化呈正向發(fā)展。另據(jù)M.A[21]、Yuan O[22]報道，EV FN1也可能直接參與了HSC-EV的下游促纖維化作用。

2.1.3 來源于肝外細胞EVs可誘導HSC活化

研究[9]表明，在荷肺癌瘤小鼠骨髓來源細胞（BMDCs）來源的EVs中，miR-92a被大量表達，EVs miR-92a可直接抑制其靶標Smad7，導致轉(zhuǎn)化生長因子-β信號轉(zhuǎn)導增強，激活小鼠HSC及上調(diào)Ⅰ型膠原的表達；該團隊在臨床上也發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中循環(huán)miR-92a水平升高，從這些患者骨髓來源細胞分離的EV具有類小鼠BMDCs EVs的能力，可過表達miR-92a而促進人HSC的活化?？梢?，多類細胞促HSC活化作用主要是通過EVs轉(zhuǎn)導miRNAs及蛋白實現(xiàn)的，并且在實驗階段證實了阻斷EV-miRNA及蛋白誘導的HSC激活可能延緩肝纖維化的進展。

2.2 LSEC-EVs介導肝星狀細胞的遷移

在肝組織損傷時，活化的HSCs會朝著損傷部位遷移，參與組織修復及ECM重塑，此過程的發(fā)生可能與鄰近肝血竇內(nèi)皮細胞（LSEC）分泌的因子調(diào)控有關(guān)[23]。肝纖維化發(fā)生時，LSEC內(nèi)高度表達SK1，過表達的SK1衍生HSC趨化因子S1P，并經(jīng)由LSECs-EVs包裝，LSEC-EVs轉(zhuǎn)導信號通路SK1/S1P到病理性的HSC，通過誘導AKT磷酸化，促進HSC的信號轉(zhuǎn)導與遷移，加重肝纖維化[24]。另據(jù)報道[14]，應(yīng)用中藥紅景天提取物紅景天苷則能通過減少肝竇內(nèi)皮細胞來源的胞外體SK1誘導的HSC活化和遷移，顯著抑制CCl4誘導的小鼠肝纖維化，這提示，部分中藥提取物可能通過外泌體途徑干預(yù)HSC的次級細胞反應(yīng)來發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

3 EVs介導促肝纖維化因子CTGF調(diào)控纖維化進程

CTGF是一種高度促纖維化的分子，在許多纖維化疾病中，CTGF與TGF-β的表達同步增高。然而，TGF-β主要在組織纖維化病變的早期表達，而CTGF在肝纖維化整個進程中均持續(xù)表達，因此部分學者將調(diào)控CTGF的表達視作為理解肝纖維化的新手段[25]。有研究團隊就發(fā)現(xiàn)[20,26]，在肝纖維化起始或下游事件中，CTGF濃度會隨著HSC的激活而顯著上升，而miR-214、miR-199a-5p等抑制CTGFmRNA轉(zhuǎn)錄的miRs含量則下降，纖維化表現(xiàn)為遞進式發(fā)展。這完全相反的兩種結(jié)果，與HSC-EV轉(zhuǎn)移EV-CTGF/CTGFmRNA有關(guān)?；罨腍SC通過外泌體途徑，轉(zhuǎn)移HSC EV-CTGF/CTGFmRNA至靜止型HSC并促進其活化，其最終結(jié)果是以αSMA mRNA或蛋白過表達，纖維化信號被放大；同時，兩種通過Twist-1-miR-199a-miR-214外泌體途徑靶向CTGF非翻譯區(qū)而抑制CTGF表達翻譯的miRNA表達受抑制。

4 EVs——肝纖維化發(fā)生及預(yù)后評估潛在生物標志物

目前，肝活檢組織病理學檢查仍是臨床上診斷肝纖維化的“金標準”。但由于肝活檢屬于創(chuàng)傷性檢查，少數(shù)病例可能會發(fā)生并發(fā)癥，如疼痛、出血、感染甚至死亡，不易被患者接受，且費用較高，應(yīng)用推廣受限[27]。因此，一種無創(chuàng)且安全的肝纖維化檢查手段呼聲較高。EVs由多種細胞分泌并存在于生物體液中，使EVs在體液檢測中具有吸引力。此前，張辰宇教授報道了miRNA可在人類和動物的血清和血漿中穩(wěn)定存在[28]，此報道更是將EV-miRNA作為生物標志物的研究推向頂峰。EV-miRNA之所以能穩(wěn)定存在于不同體液中，與EVs雙層膜結(jié)構(gòu)以及自身擁有的核糖核酸酶類抗性有關(guān)，憑借這一特性，EV-miR具有高穩(wěn)定性、存在于多種生物體液標本等優(yōu)點。Li等[20]的實驗不僅證實EXo-miR-19a的促纖維化作用，該團隊還發(fā)現(xiàn)，HCV感染的肝細胞和慢性HCV肝纖維化患者與健康志愿者和非HCV相關(guān)肝病肝纖維化患者血清中EX-miR-19a含量存在表達差異。其他EVs-miRNA如血清EXo-miR122水平的降低與非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）患者嚴重纖維化的發(fā)生有關(guān)[29]。從這些報道中可以看到，血清中存在涉及肝纖維化病因及分期的EV-miR，提取并檢驗出不同類別的miRNA，分析其含量變化，則可能知曉肝纖維化的成因、分期及預(yù)后。因此，越來越多學者傾向于將EV-miRNA視作是無創(chuàng)肝纖維化活檢極具潛力的一類新靶標。不過，研究者們也注意到了，EVmiRNA在釋放至血清前，大多數(shù)已被受體細胞攝取利用，導致體液EV中的固有核酸量較低[30]；更糟糕的是，在抽取的血清樣本中，不僅有EV-miRNA，還含有數(shù)量不等的諸如RNA復合物等非囊泡大分子結(jié)構(gòu)，這可能會對EV-miRNA提純、分離及檢測產(chǎn)生較大干擾。因此，開發(fā)有效的提取程序和靈敏的檢測策略非常重要，特別是在微量液體中找尋稀有分子靶標。

目前，傳統(tǒng)的手段有沉淀和自旋柱、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）選擇性地擴增靶序列，這兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用可以獲得所提取RNA的質(zhì)量、大小及定量驗證[31]，具有提純度高、定量準確、反復讀取利用的優(yōu)點，然而，操作起來卻費時費力，通量、靈敏度有限[31,32]。為了實現(xiàn)更高效、快速檢測，新興檢測手段“飛沫聚合酶鏈反應(yīng)［液滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)[33]］、離子交換奈米探測器[34]”應(yīng)運而生。該方法具有檢測時間短、靈敏度高、更高的裂解速率等優(yōu)勢，但仍存在樣品丟失量大、費用昂貴等不足。因此，如何進一步改進EV-miR檢測手段尤為重要，如開發(fā)一種用于單一EVs分析的技術(shù)，建立EVs生物標志物的參考數(shù)據(jù)庫[35]等。另外，由于操作者操作水平高低不同，還應(yīng)將人為操作因素作為統(tǒng)計分析時的生物變量。

5 EVs——逆轉(zhuǎn)肝纖維化潛在“方向標”

EV蛋白、核酸載物可以有效地運輸?shù)绞荏w細胞并由受體細胞吸收，以在體外和體內(nèi)引發(fā)有效的細胞反應(yīng)，因此它們常被用于遞送納米級調(diào)節(jié)性RNA、蛋白質(zhì)等成為免疫調(diào)節(jié)[36]與組織修復[37]的治療劑，成為了基因治療的理想載體。此外，有研究者還利用EVs的靶向性，將EVs設(shè)計成在其表面上存在靶向配體，并在其內(nèi)封裝藥物，精準靶向病變部位[38]。然而，長期實驗卻發(fā)現(xiàn)，EVs的給藥方式，存在半衰期短[39]，靶向有限，有效載荷不足和施用后快速清除的缺陷[40]。因此，EVs—藥物—靶器官的給藥系統(tǒng)距離臨床的推廣使用仍有較長的路要走。

肝纖維化病因，可大致分為感染性、慢性酒精中毒、自身免疫性肝病等。目前治療肝纖維化首選方法是去除病因，如有效抑制和清除慢性肝炎病毒（HBV和HCV）等。然而，有效的病因治療雖可以減緩甚至逆轉(zhuǎn)部分肝纖維化，但僅少部分患者肝硬化可逆轉(zhuǎn)。深入研究后發(fā)現(xiàn)，一旦HSC被激活，即使有效病因治療仍不能阻止肝纖維化的進展，因此，圍繞HSC活化開展的治療才是抗纖維化的特異性手段[41]。有研究報道了間充質(zhì)干細胞（MSCs）及源性EVs可以顯著減輕肝纖維化，其主要作用機制就是抑制了HSC的活化與增殖，其中，MSCs-EVs無細胞療法較親本MSCs細胞移植具有小分子、高安全性、低免疫原型等優(yōu)勢[42,43]，因此，MSC-EVs已成為當下學者研究治療肝纖維化的焦點。MA等[44]發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs可抑制LX-2細胞的激活，阻滯細胞增殖周期，并誘導其凋亡，同時減少纖維化標記α-SMA和膠原蛋白的表達。此外，當將CircDIDO1（抑瘤環(huán)狀RNA）轉(zhuǎn)染MSC-EVs后，MSC-EVs能將CircDIDO1遞送至LX-2細胞中，內(nèi)化后的LX-2 CircDIDO1海綿化Lx2細胞的miR-143-3p，上調(diào)Lx2細胞PTEN蛋白水平，降低p-AKT/AKT比值，以此弱化了LX-2細胞的激活與增殖。Wnt/β-catenin信號通路被證實與HSC增殖、轉(zhuǎn)移和ECM形成關(guān)系密切[13]。Rong等[45]實驗發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細胞（HBM-MSCs）及其來源的外泌體（HBM-MSC-Ex）通過抑制Wnt/β-catenin信號通路（PPARγ、WNT3a、WNT10b、β-連環(huán)蛋白），下調(diào)該通路下游基因（WISP1、Cyclin D1）的表達，并降低α-SMA+，從而減少肝星狀細胞活化、增殖、遷移與I型膠原表達，且HBM-MSCs-Ex效果優(yōu)于HBM-MSCs；此外，HBM-MSCs-Ex還能影響損傷肝組織內(nèi)IL-1、IL-6等炎癥因子表達，減輕炎癥反應(yīng)，修復受損肝組織。這些報告表明MSC-EV對抗肝纖維化收效較佳；同時，MA等[44]的實驗結(jié)果也從側(cè)面印證了利用MSC-EV對HSC的靶向作用，將功能性RNA封裝后精準靶向HSC的想法是可行的，但仍需要更多的研究支持。

6 結(jié)束語

細胞外囊泡尤其是外泌體在肝纖維化的發(fā)病、進展及診治方面意義非凡，通過轉(zhuǎn)運蛋白、核酸等組分干預(yù)HSC活化、增殖與遷移，調(diào)控肝纖維化進程；此外，間充質(zhì)干細胞相關(guān)EV，在改善肝纖維化上效果顯著。但目前EVs對抗肝纖維化尚無標準化的治療策略，且存在半衰期短、施用后快速清除和有效載荷不足等問題，作為診斷手段，EV-miRNA亦存在固有核酸量較低、檢測手段不統(tǒng)一的遺憾。因此，短期內(nèi)很難將基于EVs的肝纖維化診斷及治療應(yīng)用于臨床實踐。盡管如此，基于EVs探索肝纖維化的無細胞診斷及療法仍是未來的研究熱點和發(fā)展趨勢。此外，紅景天苷借用外泌體踏板干預(yù)HSC的遷移來牽制肝纖維化這一結(jié)果也格外矚目。中醫(yī)藥作為我國醫(yī)學國粹，在疾病治療方面具有多層次、多途徑、多靶點的綜合藥理特點，不僅是紅景天苷，水飛薊素、柴胡皂甙等抗肝纖維化作用也在實驗階段獲得認可，扶正化瘀方、鱉甲軟肝片更是在臨床上被廣泛用于治療或緩解肝纖維化。目前關(guān)于EVs與中藥聯(lián)合應(yīng)用治療肝纖維化的研究寥寥無幾，因此加大研究EVs與中藥的作用機制，明確中醫(yī)藥對抗肝纖維化的作用靶點，利用EVs為抗纖維化的中藥有效成分構(gòu)建作用通道，精準給藥，發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合優(yōu)勢，為肝纖維化診治開拓新方向。

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Mechanism and Clinical Significance of Extracellular Vesicles in the Progression of Hepatic Fibrosis

Extracellular vesicle is a general term for vesicles with double membrane structure released by various cells, including exosomes, microbubbles, apoptotic bodies and tumor vesicles, which mediate the material exchange and signal exchange between cells. Hepatic fibrosis is a key step in the development of various chronic liver diseases to cirrhosis and an important link affecting the prognosis of chronic liver diseases. The activation of hepatic stellate cells is the core of this link. More and more studies have shown that extracellular vesicles are involved in the regulation of liver fibrosis at different levels, mainly through the transfer of nucleic acids, proteins, etc. to participate in the regulation of hepatic stellate cell activation and migration.

extracellular vesicles; exosomes; hepatic fibrosis; hepatic stellate cells; biomarkers

R575

A

1008-1151(2022)12-0061-05

2022-05-25

國家自然科學基金項目（No.81860889）；廣西自然科學基金資助項目（2020GXNSFAA297113）。

王梓塨（1996－），男，廣西中醫(yī)藥大學在讀碩士研究生，研究方向為中醫(yī)藥（壯醫(yī)藥）防治慢性肝病的基礎(chǔ)與臨床研究。