魏月娟

滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 滄州 061000

強心湯是滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院心內科治療慢性心力衰竭的經驗方，源于真武湯，由附子、補骨脂、淫羊藿、豬苓、茯苓等藥物組成，臨床治療效果已被證實，但作用機制尚不明確。血清鈣調磷酸酶（calcineurin，CaN）是一種受Ca2+及鈣調素（calmodulin，CaM）調節(jié)的多功能信號酶。CaN的活化能夠使心肌活化T細胞核因子（nuclear factor activated T3，NFAT3）脫磷酸化，脫磷酸化的NFAT3能夠與心肌細胞核內的轉錄因子相互作用，活化心肌肥大的相關基因，如調節(jié)心臟中腦利尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、心房利尿鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）等肥大基因特異性表達，導致心肌細胞蛋白核酸合成增加，進而出現(xiàn)心肌肥厚、心腔擴大、心室重構等病理過程［1］。研究［2］顯示，CaN-NFAT3的持續(xù)激活可導致心肌嚴重肥大并迅速進展為心力衰竭或死亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇正常清潔級雄性SD大鼠64只，每只體質量約200 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SYXK（滬）2006-001：0069937。飼養(yǎng)條件：觀察室溫度23～25℃，濕度50%～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.2 試藥及儀器強心湯，藥物組成：黃芪20 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，甘草10 g，熟附子3 g，豬苓15 g，茯苓15 g，白術20 g，白芍15 g，鹿角9 g，骨碎補15 g，由滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房完成制劑；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，國藥準字H20040217，批號：X1066，規(guī)格：號：80 mg/粒）。PCR試劑盒Thermo（F-415xl，批K1622）；cDNA合成試劑盒（MBI公司）；改良的小動物呼吸機（奧爾科特科技生物有限公司）；MLT1050/D型高精度壓力換能器（澳大利亞ADI公司）。PowerLab/4SP型生物信號處理分析系統(tǒng)；Chart v 5.0記錄和分析軟件。

1.3 實驗方法

1.3.1 試藥制備 藥物劑量按大鼠與人體表面積轉換系數(shù)計算，纈沙坦膠囊制成1.6 mg/mL濃度的纈沙坦懸濁液，強心湯制成含生藥濃度2.56 g/mL的制劑。

1.3.2 分組及造模［3］將64只SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后備術，隨機分為對照組10只，模型組、纈沙坦組、強心湯組各18只，除對照組大鼠行假手術外，其余各組制備慢性心衰大鼠模型，具體方法為：參照《藥理實驗方法學》［4］采用結扎左冠狀動脈結扎法制備慢性心衰大鼠模型，喂養(yǎng)SD雄性大鼠1周備術，術前1天禁食不禁水，用氯胺酮行腹腔麻醉，固定大鼠，于手術部位脫毛，經口氣管插管，連接呼吸機和心電監(jiān)護。沿左前第3、4肋間切開皮膚，長1.5 cm左右，逐層分離，打開胸腔，暴露心臟，在左心耳下2～3 mm處，用絲線穿過左冠狀動脈前降支進行結扎，結扎后左室壁的顏色變白，同時會出現(xiàn)室壁運動減弱，心電監(jiān)護顯示Ⅱ導聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后ST段亦明顯抬高，證實造模成功。待穩(wěn)定后，關閉胸腔并逐層縫合。對照組大鼠穿線后不行結扎術。所有大鼠術后均連續(xù)抗感染治療3天。

1.3.3 給藥方法 術后8周開始灌胃給藥治療，模型組和對照組予蒸餾水灌胃；纈沙坦組予纈沙坦懸濁液灌胃，給藥劑量為8 mg/kg；強心湯組予強心湯水溶液灌胃，給藥劑量為0.9 g/kg。連續(xù)給藥4周，每天給藥1次。

1.4 觀察指標

1.4.1 血流動力學測定［5］灌胃治療4周后，采用PowerLab/4SP生物信號處理分析系統(tǒng)測定大鼠血流動力學，術前禁食不禁水，稱體質量后先用肝素鈉（1200 u/kg）抗凝30 min，用3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）行腹腔麻醉。將大鼠仰臥固定在手術臺上，切開其頸部皮膚，找到右側頸動脈，分離頸動脈和神經，結扎動脈遠心端，在近心端插入PE-50型聚乙烯心導管，通過PowerLab生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄血流動力學參數(shù)；當心導管在頸總動脈中時觀測心率，心率穩(wěn)定后，將心導管推入左心室，再待心率穩(wěn)定后，記錄大鼠左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力上升和下降變化最大速度的參數(shù)值（±LVdp/dtmax）。

1.4.2 血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平測定1）在完成血流動力學測定后，采集腹主動脈血，將抽取的血液分成兩部分，一部分置于抗凝管內，用來分離血漿；另一部分置于普通EP管內，用來分離血清。采用酶聯(lián)法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）分別測定血漿血管緊張素Ⅱ（plasma angiotensinⅡ，AngⅡ）含量、大鼠鈣調磷酸酶（calcineurin，CaN）的含量，步驟按照試劑盒使用說明書進行操作。2）提取心肌組織，采用Western blot法測定NFAT3蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學與模型組比較，纈沙坦組、強心湯組LVEDP水平降低（P＜0.05），纈沙坦組+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平降低（P＜0.01），強心湯組LVSP、+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平均升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠左室血流動力學指標比較（±s）

表1 各組大鼠左室血流動力學指標比較（±s）

注：1 mm Hg≈0.133 kPa；與對照組比較，*表示P＜0.01；與模型組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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2.2 血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠血漿血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，強心湯組、纈沙坦組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平均明顯下降（P＜0.01），且強心湯組中上述指標下調程度均大于纈沙坦組（P＜0.01）。見表2 。

表2 各組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠血漿AngⅡ、血清CaN、心肌NFAT3蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*表示P＜0.01；與模型組比較，◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01

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3 討論

心肌重構是慢性心衰發(fā)生、發(fā)展的基本病理病機，當各種原因導致細胞內鈣離子濃度升高時，能夠激活鈣調神經磷酸酶-活化的T細胞核因子（calcineurin-nuclear factor activated T，CaNNFAT）信號通路，該通路的活化是心室重構最重要的信號轉導通路之一［6］。

心力衰竭屬于中醫(yī)學“喘證”“水腫”等范疇，病機常為心腎為本，五臟相因，水飲瘀血，相兼為患。中醫(yī)治療慢性心力衰竭的原則中，多采用溫腎利水、補氣活血之法［7-8］。強心湯組方中附子能補火助陽，溫腎通脈，黃芪補氣利水，兩藥相伍，共為君藥；鹿角片、豬苓、茯苓、白術、骨碎補共為臣藥，有健脾滲濕，利水消腫，溫腎助陽之效，既能使?jié)駨男”愣?，減輕心臟前負荷，又可以輔助君藥增強溫腎功能；川芎、桃仁、紅花行氣活血化瘀為佐藥；白芍與甘草共為使藥。全方通補并施，共奏溫腎助陽、化氣利水、活血化瘀之效。

CaN由一個催化亞基（CnA）和一個調節(jié)亞基（CnB）組成，可以受Ca2+及鈣調素（calmodulin，CaM）的調節(jié)。其中，CnA分為4個不同的結構域，包括催化域、CnB結合域、CaM結合域及自身抑制域。CnB和CaM上均有4個Ca2+結合點位，Ca2+/CaM與CaN結合后，可以使CaN的結構發(fā)生改變，活化CaN［9］?？梢?，CaN為Ca2+下游因子，其蛋白表達水平的改變要早于心肌重構的發(fā)生［10］，活化的T細胞核因子（nuclear factor Activated T，NFAT）為CaN的下游因子，在其介導的心肌重構中發(fā)揮著重要作用，對心肌肥大、心肌細胞凋亡均有一定的調節(jié)作用［11］?？傊?，Ca2+-CaN-NFAT信號通路能夠誘導多種與心肌肥大相關的基因表達，最終導致心肌重構，發(fā)展為心衰。眾多實驗表明RAS系統(tǒng)中的效應分子AngⅡ與心臟擴大參數(shù)、心肌肥厚參數(shù)呈正相關［12］。有研究顯示，CaN的蛋白表達及其酶的活性與AngⅡ水平有著密切關系［13］；而ARB類藥物如替米沙坦能夠下調CaN和NFAT3的蛋白表達及CaN酶活性，其作用機制是通過抑制AngⅡ激活下游的心肌肥大信號從而影響CaN的活性及表達，最終減少NFAT3的表達［14-15］。

本研究結果顯示，強心湯組、纈沙坦組大鼠血漿CaN活性、AngⅡ含量、NFAT3的蛋白質表達量下降，其中，強心湯組下調水平優(yōu)于纈沙坦組，其治療慢性心衰的作用機制可能與抑制CaN-NFAT3信號通路有關。