付瑩瑩，張 萍，鄭大威，林太鳳，王惠琴，吳西浩，宋佳宸

北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124

引 言

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術(shù)是基于被測分子吸附在某些經(jīng)特殊處理、具有納米結(jié)構(gòu)的金屬表面，并且有極強拉曼散射增強效應(yīng)的分子振動光譜技術(shù)[1]，其廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、分析化學(xué)等領(lǐng)域。SERS活性基底的制備是SERS研究領(lǐng)域的熱點，高活性SERS基底的發(fā)展不僅可以拓寬其應(yīng)用范圍，還可以作為SERS理論模型，不斷推動該技術(shù)的發(fā)展。為了獲得最佳SERS信號，對具有特殊性能的SERS活性基底的需求一直很大[2]。SERS活性納米結(jié)構(gòu)可以分為兩種類型的基底：膠體基底和固體表面基底。目前，針對于金屬膠體主要通過合成各種形貌和尺寸的貴金屬納米結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)對待測物的SERS檢測[3]。剛性SERS固體活性基底一般采用化學(xué)刻蝕法[4]、電子束刻蝕[5]等方法刻蝕納米陣列，可以獲得很高的增強因子和光譜重復(fù)性，但通常造價昂貴，制備工藝較復(fù)雜。

目前，SERS納米基底的研究已逐漸從傳統(tǒng)的基于剛性基板的SERS轉(zhuǎn)移到了新興的柔性SERS技術(shù)上[6]，柔性的SERS固體活性基底采用物理氣相沉積法[7]等制備，但此類基底制備復(fù)雜操作繁瑣，不適合在實際檢測中的應(yīng)用。紙基作為最常見的柔性SERS活性基底[8]，其表面具有分級多孔交錯排列的3D結(jié)構(gòu)，金屬納米粒子可附著在表面，保持基底有足夠的“熱點”，從而形成SERS活性基底[9]。紙基SERS活性基底制備過程簡單，易操作，有良好的柔韌性可剪裁成各種形狀進行檢測，并且紙基的成本低廉，可大批量制備。常見的制備方法包括浸泡法[10,14]、噴墨打印法和絲網(wǎng)印刷法[11-13]等。He[13]等利用靜電紡絲技術(shù)在鏈狀排列的聚乙烯醇納米纖維中組裝高SERS活性的銀二聚體或定向聚集體，成功設(shè)計并合成了一種獨立的柔性SERS基底，從而顯著提高了SERS對4-巰基苯甲酸(4-MBA)分子的高敏感性，其增強因子高達109。Dalla[14]等用浸涂法將Au和Ag附著在濾紙上，探索一系列參數(shù)(膠體溶液濃度、濾紙孔隙度、聚合劑存在)的改變對紙基SERS活性基底性能的影響結(jié)果。Wang[15]等在聚乙烯醇吡咯烷酮(PVP)的作用和輔助下，利用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)對AgNO3的還原，制備了銳邊為20 nm的三角形Ag納米顆粒，然后將Ag納米三角形附著到濾紙上，獲得了具有良好活性和重復(fù)性的柔性SERS基底，實現(xiàn)了對10-8mol·L-1濃度的對氨基噻吩酚(PATP)的超痕量檢測。但上述方法耗時長，對原輔料的加工有嚴(yán)格的要求把控，并且對于實際應(yīng)用的操作也較為復(fù)雜及繁瑣。Nylon柔性膜與紙類似，其表面也具有分層、多孔結(jié)構(gòu)，Nylon柔性膜具有性質(zhì)穩(wěn)定，可長期儲存等優(yōu)點，納米顆?？梢粤己玫馗街贜ylon柔性膜表面，另外Nylon柔性膜的親水性、大通量、流速快等性能，使得在制備過程中操作簡單并且流暢；在SERS活性基底的檢測過程中，Nylon柔性膜中溶劑殘留少和蛋白吸附力低的特點，可減少其他物質(zhì)對實驗的影響。本研究以 Nylon柔性膜作為柔性材料，利用固相萃取過濾裝置，將金納米顆粒均勻地附著在Nylon柔性膜上，制備Au-Nylon柔性膜基底。同時，以結(jié)晶紫CV作為探針分子，研究了Au-Nylon柔性膜基底的SERS活性、均勻性及檢測限，并對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)進行SERS檢測，驗證其在生物樣品SERS檢測的適用性，為SERS活性基底的研究提供新穎的思路與方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

便攜式激光拉曼光譜儀(RamTracer-200，歐普圖斯光學(xué)納米科技有限公司)，激發(fā)波長785 nm，激發(fā)功率250 mW；紫外-可見-近紅外分光光度計(UH4150，日本日立公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(F50，日本電子公司)；恒溫震蕩培養(yǎng)箱(NB-205V，韓國 N-BIOTEK公司)；集熱式恒溫加熱攪拌器(DF-101S，上海邦西儀器科技有限公司)。

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、硝酸(HNO3)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7)購自美國Alfa Aesar公司；鹽酸(HCl)購自北京化工廠；Nylon柔性膜來自艾杰爾公司；S.aureus購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soy broth,TSB)和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth,NB)購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；結(jié)晶紫(crystal violet,CV)和羅丹明(R6G)購自Amresco公司；實驗用水均為Millipore (Direct-Q 8UV-R)所制超純水(18.2 mΩ)。

1.2 金溶膠的制備

采用Lee和Meisel[16]的合成方法，以檸檬酸鈉為還原劑制備金溶膠溶液于100 mL三口圓底燒瓶中。首先吸取50.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液中加熱攪拌至微沸20 min，然后再加入0.20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌并保持微沸30 min，當(dāng)溶液變?yōu)榫萍t色時，停止加熱，自然冷卻至室溫，避光儲存于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3 Au-Nylon柔性膜基底的制備

將注射器連接裝有單位面積1 cm2的Nylon柔性膜的過濾頭，另一端連接在固相萃取裝置，注射器中加入金溶膠，抽濾，控制流速為1 mL·min-1，然后將Nylon柔性膜取出，置于冷凍干燥機中，冷凍干燥1 h，取出備用(圖1)。依據(jù)上述操作，按表1處理1～2次，制備不同條件的Au-Nylon柔性膜基底。

表1 Au-Nylon柔性膜基底的制備條件Table 1 Preparation conditions of Au-Nylon flexible film substrate

圖1 Au-Nylon柔性膜基底的制備流程Fig.1 Preparation process of Au-Nylon flexible film substrate

1.4 樣品

S.aureus菌液樣品制備：將S.aureus接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃，110 r·min-1震蕩培養(yǎng)約4 h，使用紫外-可見-近紅外分光光度計測定OD(600 nm)為1時，停止培養(yǎng)，備用，此時細(xì)菌數(shù)量約為109。

結(jié)晶紫溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.02 g結(jié)晶紫(CV)，用去離子水配制成濃度為1×103mol·L-1的儲備液，再逐級稀釋到濃度為1×10-3，2.5×10-5，1×10-5，1×10-6，5×10-7及1×10-7mol·L-1的CV使用液，備用。

羅丹明溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.02 g羅丹明(R6G)，用去離子水配制成濃度為1×103mol·L-1的儲備液，再將濃度稀釋到1×10-6的羅丹明使用液，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au-Nylon柔性膜基底的表征

利用掃描電子顯微鏡對按表1中不同條件制備的Au-Nylon柔性膜基底進行表征，探究金納米顆粒在Nylon柔性膜上的分布情況。不同金納米顆粒的附著量和與膜結(jié)合次數(shù)對金納米顆粒在Nylon柔性膜分布呈規(guī)律性的變化，由圖2(a)所示?？瞻譔ylon柔性膜是多孔交錯排列的結(jié)構(gòu)，其表面沒有球形顆粒物，而Cond A—D的SEM圖可以看出Nylon表面均有附著不同數(shù)量的金納米顆粒，Nylon附著金顆粒的量隨著金溶膠過濾量增加而增加(見Cond A和Cond B)，其較均勻地分布在纖維上。從Cond A與Cond C之間、Cond B與Cond D之間的SEM圖可以看出，Cond C和Cond D表面有大量的金納米顆粒，隨著與膜結(jié)合次數(shù)的增加Nylon表面的金顆粒明顯增多，通過SEM觀察出大量的金納米顆粒覆蓋在Nylon柔性膜的表面，并且Cond C表面的金納米顆粒比Cond D分布更均勻，Cond D表面的金納米顆粒出現(xiàn)較為明顯的團聚現(xiàn)象。同時，研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)金溶膠總量一定時，與膜結(jié)合次數(shù)增加，附著在Nylon柔性膜表面的金納米顆粒也明顯增加(Cond B和Cond C)。由此可見，前一次處理后的Nylon纖維和其表面附著的金納米顆粒形成了新的活性截留層，能使再次結(jié)合的溶膠中金顆粒更好地附著在表面。由于SERS檢測主要針對表面進行，所以在Nylon柔性膜表面附著更多的金顆粒更有利于待測物的SERS檢測。

圖2 Au-Nylon柔性膜基底的SEM(a)、EDS(b)及紫外-可見-近紅外光譜圖(c)Fig.2 SEM (a),EDS (b)and UV-Vis-NIR (c)spectra of Au-Nylon flexible film substrate

為驗證Au-Nylon柔性膜基底主要成分和含量，選擇金納米顆粒附著較為均勻的Cond C樣品進行光電子能譜(EDS)測試，如圖2(b)可知，Au-Nylon柔性膜基底表面覆蓋了大量金納米顆粒，Au的相對含量為75.41%，其他O，N和C元素相對含量低。

圖2(c)是金溶膠溶液及Au-Nylon柔性膜基底的紫外-可見-近紅外光譜圖，從圖中可以看出金溶液的等離子共振吸收峰在535 nm，而Au-Nylon柔性膜基底的最強等離子共振吸收峰發(fā)生了藍移，出現(xiàn)在512 nm。這可能是由于金納米顆粒所處的環(huán)境發(fā)生變化，金納米顆粒與Nylon柔性膜發(fā)生了耦合反應(yīng)，金納米顆粒受到一定的束縛造成的。Au-Nylon柔性膜基底的最大吸收高于金溶膠，這是主要由于在Au-Nylon柔性膜基底的金納米顆粒的含量高于金溶膠，單位面積的金納米顆粒數(shù)增大，可能會提高金納米顆粒與被測物的碰撞幾率，更有利于SERS信號的增強。

2.2 復(fù)合膜的SERS表征

不同方法制備的Au-Nylon柔性膜基底，其表面的金納米顆粒分布有很大的差異。為了研究這些差異是否對Au-Nylon基底的SERS活性產(chǎn)生影響，實驗以10-5mol·L-1的CV溶液作為探針分子，進行Au-Nylon的SERS活性檢測，結(jié)果如圖3(a)所示。從圖中可以看出，Cond B的SERS信號明顯強于Cond A，隨著金溶膠體積的增加，Nylon柔性膜附著的金顆粒的增多，使得Au-Nylon對CV的SERS活性更好。同時，兩次處理后的Au-Nylon(Cond C和Cond D)的SERS活性明顯好于單次處理的Au-Nylon(Cond A和Cond B)。值得注意的是，金溶膠總體積一致時，Cond C(1 mL·次-1，2次)的SERS信號比Cond A(2 mL·次-1，1次)有明顯增強，分析認(rèn)為兩次處理后的金納米顆粒主要附著在Nylon柔性膜表面[見圖3(a)]，說明Au-Nylon表面的金納米顆粒對SERS信號的增強起主導(dǎo)作用。附著在Nylon柔性膜表面上的金納米顆粒會形成一些SERS“熱點”，這些SERS“熱點”的形成是由于金納米顆粒之間的聚集，納米顆粒間形成納米間隙，導(dǎo)致顆粒之間的耦合作用增強，從而提供的“熱點”逐漸增多；但當(dāng)金納米顆粒過飽和時，影響了“熱點”的分布，金納米顆粒之間的納米間隙發(fā)生改變，使得SERS信號減弱[17]。因此，盡管Cond D的Au-Nylon表面的金納米顆粒多于Cond C的Au-Nylon基底，但是由于表面金納米顆粒過多而發(fā)生聚集，影響“熱點”的形成，使得Cond D的SERS活性反而弱于Cond C的SERS活性。

圖3 不同制備條件的Au-Nylon柔性膜基底對CV探針分子的SERS檢測(a)及 Nylon柔性膜和Au-Nylon柔性膜基底對CV探針分子和R6G探針分子的SERS譜圖(b)Fig.3 SERS spectra of Au-Nylon flexible membrane substrate at different conditions on CV probe molecules (a)and SERS spectra of Au-Nylon flexible membrane substrate and Nylon flexible membrane on CV probe molecules and R6G probe molecules (b)

2.3 Au-Nylon柔性膜基底的SERS的檢測限及增強因子

為測試Au-Nylon柔性膜基底的SERS檢測限，實驗將濃度為2.5×10-5，1×10-5，1×10-6，5×10-7及1×10-7mol·L-1的CV探針分子溶液滴加在Au-Nylon柔性膜基底上，然后進行SERS檢測，結(jié)果如圖4(a,b)所示。結(jié)果表明，隨著CV探針分子溶液濃度的降低，CV探針分子在Au-Nylon柔性膜基底上的SERS信號強度逐漸降低，當(dāng)CV溶液的濃度低至1×10-7mol·L-1時，CV探針分子的特征SERS信號幾乎檢測不到，說明Au-Nylon柔性膜基底可以檢測到5×10-7mol·L-1的CV探針分子，不同濃度CV的1 171 cm-1處的拉曼峰強與濃度之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達到0.916。

圖4 Au-Nylon柔性膜基底對CV溶液定量分析(a)和1 171 cm-1處峰強與濃度線性關(guān)系(b)的SERS檢測極限圖譜Fig.4 Quantitative analysis of CV solution with Au-Nylon flexible membrane substrate (a)and linear relationship between peak strength and concentration at 1 171 cm-1 (b)

對Au-Nylon柔性膜基底的增強因子(enhancement factor,EF)進行計算[19]，見式(1)

EF=(ISERS/cSERS)/(Iref/cref)

(1)

式(1)中，ISERS和cSERS分別表示吸附在基底上的CV探針分子的SERS信號強度和濃度。Iref和cref分別表示吸附在錫紙基底上的CV探針分子的非SERS的散射強度和濃度。以本基底檢測CV溶液濃度1.0×10-6mol·L-1作為cSERS，以非SERS散射檢測CV溶液的最低濃度103mol·L-1作為cref。選用1 171 cm-1處的拉曼峰的強度來計算EF。經(jīng)計算Au-Nylon柔性膜基底的SERS增強因子為1×104。

2.4 Au-Nylon柔性膜基底的均一性與重復(fù)性分析

金納米顆粒均勻的分布在SERS活性基底表面會產(chǎn)生更多的SERS“熱點”，因此Au-Nylon柔性膜基底的均一性對待測樣品的SERS檢測有著重要的實際意義[17]。為了研究所制備的Au-Nylon柔性膜基底的均勻性，實驗將5×10-7mol·L-1的CV溶液滴加在Au-Nylon柔性膜基底上，隨機選取15個不同的點進行SERS檢測，圖5(a)為15個點SERS譜圖，不同顏色表明Au-Nylon柔性膜基底的SERS強度。結(jié)果表明，隨機選取的15個點的CV探針分子SERS圖譜的峰形和特征峰的強度基本一致，不同拉曼峰均在相同峰強區(qū)域，特征峰1 171 cm-1處的SERS強度大部分處于藍色區(qū)域。進一步的對Au-Nylon柔性膜基底的均勻性進行研究，統(tǒng)計并分析特征峰1 171 cm-1處的SERS信號強度，結(jié)果如圖5(b)所示，15個不同點在1 171 cm-1處的SERS信號強度的RSD為11.8%，進一步說明研究中所制備的Au-Nylon柔性膜基底具有較好的均勻性。

圖5 15個不同點 的SERS圖譜(a);CV在1 171 cm-1處的柱狀體(b)Fig.5 SERS collected from 15 different points (a);Histogram of the peak of CV at 1 171 cm-1 (b)

批間重復(fù)性也是評價SERS基底的一個重要指標(biāo)。本實驗制備5批Au-Nylon柔性膜基底，以10-5mol·L-1的CV作為探針分子，探索基底的不同批次的重復(fù)性，圖6展示了5批Au-Nylon柔性膜基底對CV進行SERS測試的拉曼光譜圖(其中每一批均為重復(fù)測定了10次后的平均譜圖)，表2為CV的特征峰(798，913，1 171和1 296 cm-1)的峰強RSD，結(jié)果顯示不同批次CV特征峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)約為15%，因此不同批次可擦拭柔性SERS基底有著良好的重現(xiàn)性。

圖6 Au-Nylon柔性膜基底(5批)對CV的SERS譜圖Fig.6 SERS diagram of Au-Nylon flexible membrane substrate (5 batches)for CV

表2 不同批次的Au-Nylon柔性膜基底對CV的RSD分析Table 2 RSD analysis of different batches of Au-Nylon flexible membrane substrates for CV

2.5 Au-Nylon柔性膜基底在細(xì)菌SERS檢測中的應(yīng)用

Nylon柔性膜具有對蛋白吸附力低，在檢測細(xì)菌時減少了其他蛋白物質(zhì)對SERS結(jié)果的影響。為了探究Au-Nylon柔性膜基底對細(xì)菌的SERS檢測能力，將金溶膠和Au-Nylon柔性膜基底對S.aureus的SERS檢測進行對比，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，空白Nylon柔性膜和Au-Nylon柔性膜基底的本底SERS信號較弱，對檢測無影響；Au-Nylon柔性膜基底對S.aureus的SERS信號有明顯的增強，且峰型清晰并高于液體金溶膠對S.aureus的增強作用。從圖7可以看出S.aureus的特征峰主要有734，962，1 031，1 235，1 314，1 350和1 460 cm-1，與Zheng等[20]的研究結(jié)果基本相吻合。由此可見，本方法所制備的SERS活性基底，可以很好地響應(yīng)細(xì)菌的拉曼特征信息，具有微生物SERS檢測的應(yīng)用前景。

圖7 金溶膠、Nylon柔性膜以及Au-Nylon柔性膜基底對S. aureus的SERS圖譜Fig.7 SERS spectra of S. aureus with gold colloid,Nylon film and Au-Nylon flexible film substrate

3 結(jié) 論

利用固相萃取過濾裝置，將金納米顆粒均勻的附著在Nylon柔性膜上，制備了Au-Nylon柔性膜基底。以掃描電子顯微鏡作為表征技術(shù)，以結(jié)晶紫CV為SERS探針分子，對Au-Nylon柔性膜基底的結(jié)構(gòu)及SERS性能進行分析，發(fā)現(xiàn)Nylon纖維與其所附著的金納米顆粒形成新的活性截留層，將再次處理的金納米顆粒均勻地附著在柔性膜表面，形成SERS“熱點”，提高了Au-Nylon柔性膜基底的SERS活性，Au-Nylon柔性膜基底對CV的檢測極限達到5×10-7mol·L-1，增強因子達到1×104。同時，Au-Nylon柔性膜基底具有較好的均勻性，相對平均偏差為11.8%。此外，Au-Nylon柔性膜基底能對金黃色葡萄球菌(S.aureus)進行SERS檢測，且SERS性能高于液體金溶膠。綜上所述，Au-Nylon柔性膜基底具有良好的均一性和重復(fù)性，并具有較好的SERS活性，該方法具有簡單且易批量制備的優(yōu)點，無論在化合物檢測還是微生物檢測中都具有良好的實際應(yīng)用價值。