冷曉晨，張 影，胡 娟，劉夢(mèng)瑤，王奕斌，熊浛羽，馮釗波，張大帥，史載鋒

(海南省水環(huán)境污染治理與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158)

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography)是實(shí)驗(yàn)室常用的定性和定量分離分析儀器。HPLC由于具有高分離率和高靈敏度特性在藥品、化工、食品、環(huán)境和生物分子[1-4]中應(yīng)用越來越廣泛。近年來高效液相色譜法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用更是不斷增多，2010 年版《中國藥典》高效液相分析方法約2000種[5]，高效液相色譜為醫(yī)藥業(yè)發(fā)展發(fā)揮重要作用。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室使用的高效液相色譜多為高性能精密儀器，因此在配件、耗材相對(duì)價(jià)格比較高，為了避免能高效液相色譜效能下降，保證高效液相色譜的正常使用，高效液相色譜使用管理和日常的維護(hù)非常必要，本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)室崗位實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，通過高效液相色譜(HPLC)介紹主要模塊使用及其日常維護(hù)問題處理進(jìn)行分析，有利于提高檢測數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)度，增加色譜柱使用年限。

1 高效液相色譜安全使用和管理

在高效液相色譜中因?yàn)槭褂糜袡C(jī)溶劑和少量生物危害樣品，HPLC實(shí)驗(yàn)室的安全問題與大多數(shù)分析實(shí)驗(yàn)室是一致。高效液相色譜雖然高壓操作環(huán)境，但其使用的小體積不可壓縮液體，因此不會(huì)造成重大的安全風(fēng)險(xiǎn)。典型的HPLC安全問題是外部環(huán)境引起的，例如流動(dòng)相附近的高電壓和流動(dòng)相本身(易燃易爆液體)是主要的安全隱患。HPLC實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置應(yīng)符合當(dāng)?shù)睾蛧业南酪?guī)范；在試驗(yàn)前需要對(duì)分析樣品和流動(dòng)相中使用的有機(jī)溶劑的毒性進(jìn)行審查，并納入的實(shí)驗(yàn)室安全程序；同時(shí)應(yīng)查閱所處理的每種化合物或溶劑樣品的安全使用方法，最好與實(shí)驗(yàn)室人員了解HPLC實(shí)驗(yàn)室中化學(xué)品和消防安全。

高效液相色譜主要分為反相色譜、正相色譜、凝膠滲透色譜等，反相色譜(RPC)的流動(dòng)相通常使用的是甲醇和乙腈(ACN)相對(duì)比較安全，而正相色譜(NPC)或凝膠滲透色譜(GPC)中使用的溶劑，如四氫呋喃(THF)，二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)需要加強(qiáng)安全和環(huán)境管理。如果是二氯甲烷在使用是有一套特定的規(guī)章制度。在處理有毒或腐蝕性化學(xué)品時(shí)，需要戴上安全眼鏡和手套，且選擇與所對(duì)應(yīng)的防護(hù)設(shè)備；當(dāng)樣品具有呼吸急性毒性時(shí)，使用時(shí)應(yīng)佩戴適當(dāng)?shù)暮粑Ｗo(hù)用具；揮發(fā)性、易燃性和有毒有機(jī)溶劑應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)柜處理；在稱重具有潛在致癌性的藥物時(shí)，應(yīng)做好防護(hù)在應(yīng)放在手套箱中進(jìn)行溶解操作；實(shí)驗(yàn)過程中所用的化學(xué)品和廢棄溶劑應(yīng)按規(guī)范儲(chǔ)存和處理。

實(shí)驗(yàn)安全第一，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)要遵守實(shí)驗(yàn)室安全守則、嚴(yán)禁吸煙和進(jìn)食等可能對(duì)實(shí)驗(yàn)研究及儀器性能造成影響或與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的一切活動(dòng)；儀器使用者必須經(jīng)過專門的技術(shù)培訓(xùn)，掌握儀器的性能，操作方法和使用注意事項(xiàng)，方可獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中不得擅自改變電腦內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；使用儀器務(wù)必登記開始和結(jié)束時(shí)間，若儀器出現(xiàn)異常，及時(shí)停機(jī)找管理人員說明并在登記本上記錄詳情；實(shí)驗(yàn)之后關(guān)閉儀器，材料、溶液必須及時(shí)清理，保證實(shí)驗(yàn)室的清潔和安全，注意要及時(shí)鎖門，并保證實(shí)驗(yàn)室的水電安全。

2 高效液相色譜組成

高效液相色譜可以是模塊化的(Agilent 1290)、集成的(Shimadzu LC2030)，也可以是兩種儀器類型的混合(Waters Acquity UPLC H-Class)，采用模塊化系統(tǒng)比完全集成的系統(tǒng)更易維護(hù)。典型的高效液相色譜主要由溶劑系統(tǒng)、脫氣系統(tǒng)、輸液泵系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)組成(如圖1)[6]。

圖1 HPLC系統(tǒng)的原理圖和主要模塊部件Fig.1 A schematic of an HPLC system showing all themajor modules or components

2.1 溶劑系統(tǒng)

流動(dòng)相：高效液相色譜溶劑系統(tǒng)一般包括流動(dòng)相(甲醇-水或乙腈-水、正己烷-異丙醇)、洗針液(50%甲醇水溶液或50%異丙醇水溶液)、泵頭潤洗液(10%甲醇水溶液)。溶劑一般置于1000 mL的溶劑瓶中。高效液相色譜管路內(nèi)徑較小，為了防止微粒進(jìn)入就會(huì)造成色譜管路阻塞，所以在使用水體系流動(dòng)相時(shí)，通常選擇0.45 μm膜過濾器進(jìn)行過濾[7]；為了提供一個(gè)穩(wěn)定的pH環(huán)境抑制藥物的解離，增強(qiáng)藥物樣品的保留，通常使用加入酸或堿性(0.1%甲酸、0.1%氨水、0.1%磷酸)水系流動(dòng)相，此時(shí)的流動(dòng)相一定要進(jìn)行過濾。由于最有效的緩沖范圍是±1 pH，因此為選擇合適的pH緩沖液至關(guān)重要，緩沖相濃度在5～20 mm可以滿足大多數(shù)應(yīng)用。當(dāng)緩沖相與有機(jī)溶劑混合時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，如ACN與磷酸鹽緩沖液混合流動(dòng)相時(shí)，磷酸鹽緩沖液的濃度應(yīng)在15 mm以下，同時(shí)ACN混合比例要低于85%，以防止混合過程產(chǎn)生沉淀。水系流動(dòng)相過濾時(shí)一般選擇混合纖維素酯膜，而有機(jī)流動(dòng)相過濾使用PTFE或PVDF過濾膜，尼龍膜作為通用過濾膜，可以水、有機(jī)和水/有機(jī)混合流動(dòng)相。色譜級(jí)的溶劑通常由制造商進(jìn)行預(yù)過濾，所以在使用前不建議過濾。如圖2顯示了為欣維爾全玻璃過濾器。用緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，在使用前和使用后都要用水清洗流路，絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時(shí)間，及時(shí)更換避免細(xì)菌滋生。

圖2 全玻璃溶劑過濾器Fig.2 All-glass solvent fifiltration flflask

樣品制備：在HPLC分析中，樣品(濃度0.001～10 mg/mL)通常裝在2 mL樣品瓶，當(dāng)?shù)臉悠敷w積較小時(shí)可使用倒錐形樣品瓶(體積100～300 μL)。樣品在測試時(shí)可以采用溶劑重量稀釋方法(mg/g)和溶解稀釋方法(mg/mL)，溶劑重量稀釋方法無需使用容量瓶，明顯的更加方便和精確，但其藥物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用卻很少。藥物樣品的默認(rèn)稀釋劑為50%乙腈/水，低溶解度樣品可以通過增加稀釋劑使其溶解，在測定口服藥物中原料藥時(shí)(片劑或膠囊)，需要用過濾器進(jìn)行過濾(0.2～0.45 μm膜過濾器)。復(fù)雜的樣品可能需要富集或其他制備過程，但通常借助內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.2 脫氣系統(tǒng)使用、注意事項(xiàng)和維護(hù)

流動(dòng)相的脫氣在泵混合和梯度分析中至關(guān)重要。傳統(tǒng)的流動(dòng)相脫氣采用超聲脫氣，特別時(shí)水和有機(jī)混合時(shí)，脫氣是非常必要的。超聲脫氣后的溶劑將在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)“氣泡的重生”，可能導(dǎo)致混合錯(cuò)誤，在線真空脫氣機(jī)的使用，避免“氣泡的重生”帶來的影響。在線真空脫氣機(jī)(如圖3)使流動(dòng)相的脫氣變得簡單方便。為了有效脫氣，所有四條管線都應(yīng)注入溶劑。脫氣機(jī)中的真空膜管是分正相反相的，通常的液相脫氣機(jī)的真空膜管是反相脫氣膜，適用于甲醇和乙腈等有機(jī)系溶劑，如使用正己烷等小極性的溶劑，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后一定要盡快用甲醇等溶劑將真空膜管的小極性溶劑替換出來，最好的方法按液相使用的流動(dòng)相配置相應(yīng)的脫氣機(jī)或脫氣機(jī)內(nèi)同時(shí)配置正相和反相真空膜管。

圖3 在線真空脫氣機(jī)示意圖(PerkinElmer公司)Fig.3 Schematic diagram of an online vacuum degasser(Diagram courtesy of PerkinElmer, Inc.)

2.3 輸液泵系統(tǒng)使用、注意事項(xiàng)和維護(hù)

高效液相色譜柱通常用3 μm和5 μm顆粒為填料，同時(shí)小管徑的管路對(duì)流動(dòng)相產(chǎn)生很大的阻力，高壓泵使用時(shí)必要的[8]。高壓泵設(shè)定壓力上限為3000～4000 psi，一般低于系統(tǒng)壓力限值；設(shè)置壓力下限通常為100 psi，可以防止溶劑耗盡(觸發(fā)后泵關(guān)閉)。高壓泵設(shè)定活塞密封清洗功能來清洗潤滑活塞，以延長密封壽命，活塞密封清洗溶劑為10%甲醇水溶液。高壓泵的在線過濾器通常要在2～3個(gè)月要清洗一次，如使用高鹽緩沖液流動(dòng)，不要讓緩沖液停留在HPLC系統(tǒng)中，測試后須立即用10%甲醇或乙腈沖洗。流動(dòng)相管線入口過濾器 (10 μm過濾器)使用可以防止切換溶劑交叉污染或緩沖相沉淀。輸液泵系統(tǒng)可以分低壓混合系統(tǒng)和高壓混合系統(tǒng)。在低壓混合系統(tǒng)中，保留體積(從泵到柱的入口的溶劑體積)包括比例閥、泵頭、混合器和其他泵內(nèi)部器件(如脈沖阻尼器、壓力傳感器、背壓裝置和過濾器)，進(jìn)樣器以及連接到柱入口的所有管路。低壓混合系統(tǒng)的停留體積為在0.5～2 mL，高壓混合系統(tǒng)的停留體積較小。在等度分析中，保留體積不重要，但在梯度分析中變得重要，因?yàn)樗鼮榉治鲈黾恿颂荻妊舆t時(shí)間，特別是在低流速下梯度分析中。分析工作時(shí)要配制足夠的流動(dòng)相，防止流動(dòng)相用盡后空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，空泵運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)把空氣泵入色譜柱，這樣會(huì)磨損柱塞密封環(huán)和缸體，最終會(huì)導(dǎo)致漏液[9]。

2.4 進(jìn)樣系統(tǒng)使用、注意事項(xiàng)和維護(hù)

高效液相色譜進(jìn)樣系統(tǒng)的進(jìn)樣器分為自動(dòng)進(jìn)樣和手動(dòng)進(jìn)樣；在樣品進(jìn)樣時(shí)，樣品通常要進(jìn)行過濾，尼龍膜作為通用過濾膜，可以水溶、有機(jī)和水/有機(jī)混合樣品。水溶樣品過濾時(shí)一般選擇混合纖維素酯膜，而有機(jī)體系樣品過濾使用PTFE或PVDF過濾膜。使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液清洗進(jìn)樣針，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品潤洗進(jìn)樣針(3遍以上)，并排除針中的氣泡；手動(dòng)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性一般低于自動(dòng)進(jìn)樣器，在手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)操作人員的技術(shù)熟練度很重要。自動(dòng)進(jìn)樣器的洗針液通常選擇50%甲醇或乙腈溶液。樣品分析前對(duì)注射器進(jìn)行吹掃，以去除注射器中的氣泡，進(jìn)樣前后用樣品潤洗注射器(3遍以上)。樣品瓶裝滿足夠的樣品溶液，通常2 mL進(jìn)樣瓶中樣品體積不小于 0.5 mL。自動(dòng)進(jìn)樣量一般范圍為5～50 μL，隨著進(jìn)樣體積的增大，峰面積精度增加，由于自動(dòng)進(jìn)樣器馬達(dá)精度有限(精度為0.01 μL)，如果進(jìn)樣量<5 μL可能導(dǎo)致檢查的精度降低[10]。

圖4 典型自動(dòng)進(jìn)樣器精度與進(jìn)樣量的對(duì)比圖Fig.4 Diagram illustrating typical autosamplerprecision vs. injection volumes

2.5 高效液相色譜柱的使用、注意事項(xiàng)和維護(hù)

色譜柱是高效液相色譜中的核心部分，在高效液相色譜中色譜柱起到分離的效果，色譜柱的長度(如150 mm和 250 mm)、半徑(如2.1 mm和4.6 mm)、填充性質(zhì)粒徑(如 3 μm和5 μm)對(duì)樣品的分析時(shí)間和分離效果產(chǎn)生影響。色譜柱使用前要詳細(xì)的閱讀說明書，注意不同類型色譜柱對(duì)應(yīng)不同的流動(dòng)相。正常使用情況下色譜柱壽命為3～24個(gè)月或1000～3000次進(jìn)樣，具體取決于使用的流動(dòng)相類型和樣品。反相色譜柱是高效液色譜最常用的色譜柱[11]，反相柱通常采用乙腈或甲醇水溶液保存，不使用的色譜柱要密封防止色譜柱填料變干；色譜使用前應(yīng)用強(qiáng)溶劑(ACN或MeOH)沖洗色譜柱以除去高度保留的雜質(zhì)。如果測試“臟”樣品要使用保護(hù)柱或在線過濾器，保護(hù)柱最好與分析柱填料相同。色譜柱在使用時(shí)不得超過其pH值范圍，一般情況下，色譜柱的pH值為2-8，個(gè)別硅膠柱的范圍pH值范圍可以到1.5-10，如果流動(dòng)相PH值超出酸性范圍，則鍵合相有可能出現(xiàn)水解而流失，如果流動(dòng)相PH值超出堿性范圍，則有可能導(dǎo)致硅膠溶解加速而產(chǎn)生絮狀物，造成管柱堵塞[12]；大多數(shù)色譜柱的溫度限制為60～80 ℃，溫度過高可能造成柱填料溶解降低柱效，色譜柱的使用溫度通常在5～40 ℃之間；使用色譜柱時(shí)，要注意柱壓力上限一般是在6000～18000 psi，超過壓力上限可能會(huì)使柱子塌陷。當(dāng)更換流動(dòng)相時(shí)，通常使用10～20倍柱體積的流動(dòng)相進(jìn)行平衡，基線穩(wěn)定再進(jìn)樣。樣品檢測完后要及時(shí)沖洗色譜柱，避免樣品殘留，如緩沖鹽作為流動(dòng)相的水相時(shí)，需要用純水進(jìn)行置換。

色譜柱維護(hù)和再生，隨著色譜柱使用色譜柱的性能逐漸降低，如柱壓升高和峰值變寬；當(dāng)柱壓升高和分離性能降低，應(yīng)及時(shí)采取措施糾正，不要等到柱被堵住。如果柱壓異常高，盡快嘗試強(qiáng)溶解的試劑反沖洗色譜柱，如果發(fā)生色譜柱堵塞，可以嘗試更換一些色譜柱的入口的填料。受污染色譜柱可以使用一系列強(qiáng)溶劑沖洗再生色譜柱，恢復(fù)其分離性能，對(duì)反相色譜柱可以使用按先使用水、甲醇、CH2Cl2和甲醇的順序沖洗。

2.6 檢測器使用、注意事項(xiàng)和維護(hù)

檢測器是高效液相色譜重要部份。多大數(shù)分析物(如藥物)包含一個(gè)或多個(gè)發(fā)光基團(tuán)，所以紫外/可見吸收檢測器(UV/Vis)和光電二極管陣列檢測器(PDA)是最常用的檢測器[13]。UV/Vis檢測器包括一個(gè)氘燈、一個(gè)單色器和一個(gè)小樣品池。單色器中光柵可以通過一個(gè)出口狹縫轉(zhuǎn)動(dòng)來選擇特定的波長。紫外可見燈是檢測器核心部件，燈使用壽命，一般可以持續(xù)使用12個(gè)月或1000 h以上，液相不使用時(shí)(2 h)應(yīng)及時(shí)關(guān)閉燈以延長燈使用壽命；如果靈敏度降低，則嘗試更換燈，燈老化通常會(huì)基線噪聲升高。檢測器在分析前，至少需要打開燈預(yù)熱 15 min，設(shè)置波長和檢測器響應(yīng)時(shí)間需要0.1～0.5 s。檢測器噪音也可能檢測池內(nèi)產(chǎn)生了氣泡造成的，通過對(duì)流動(dòng)相超聲脫氣和在線脫氣可以減小氣泡的數(shù)量，降低檢測器噪音[14]。

3 結(jié) 論

高效液相色譜(HPLC)是一種多用途的分析儀器，在過去的50年高效液相色譜不斷改進(jìn)，使其更加精密、準(zhǔn)確和便利。本文介紹了高效液相色譜安全使用及各模塊使用的注意事項(xiàng)。做好高效液相色譜日常管理及維護(hù)，可以有效的提升高效液相色譜使用效率，發(fā)揮其在實(shí)驗(yàn)室的作用。