楊光慧, 王建超, 唐格格, 楊紅嬌, 伍 林, 彭華勇

(1 吉首大學(xué)藥學(xué)院，武陵山地區(qū)民族藥解析與創(chuàng)制湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000；2 云浮順天然生物科技有限公司，廣東 云浮 527300；3 吉首大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理中心，湖南 吉首 416000)

蠶絲是由丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸等18種氨基酸構(gòu)成的天然蛋白纖維，自古就有“人體第二肌膚”、“纖維皇后”之美譽(yù)[1]。而且蠶絲蛋白與人表皮蛋白是同源蛋白[2]，對(duì)皮膚親和力強(qiáng)，可以參與修復(fù)皮膚組織?，F(xiàn)代皮膚科學(xué)表明，皮膚能直接吸收短肽類物質(zhì)，并能通過自身載體作用深入肌膚底層[3-4]。將蠶絲水解成易被皮膚吸收的小分子肽，可促調(diào)節(jié)膠原蛋白和黏多糖的生成，維持皮膚組織中水分含量和電解質(zhì)代謝平衡[5]，改善干枯皮膚的缺水狀態(tài)，滋潤(rùn)皮膚組織，使細(xì)胞變得更加聰慧[6]。目前，蠶絲已被諾斯貝爾等化妝品公司應(yīng)用于面膜[7]在面霜、手霜等方面的應(yīng)用仍有待開發(fā)，也缺乏對(duì)絲素肽的護(hù)膚功效評(píng)價(jià)[8]。為拓展天然蠶絲蛋白在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，本文以天然蠶絲為原料，經(jīng)鹽解與酶解制備絲素肽，并測(cè)定分子量與體外透皮情況，研究其潤(rùn)膚保濕功效，為新型天然護(hù)膚保濕用品應(yīng)用開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

脫膠蠶絲，云浮市御華蠶絲綢有限公司；堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)，諾維信公司；過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)、marker對(duì)照；北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；透析袋(8000-14000D)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣、水合茚三酮、抗壞血酸、單寧酸、磷酸二氫鈉、丙氨酸、甘氨酸等均為分析純。

3K3O Sigma 低溫高速離心機(jī)，德國(guó)；LGJ-25 冷凍干燥機(jī)，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；KDN-08C(04C)定氮儀、DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；RYH-6B透皮吸收儀，天津市光學(xué)儀器廠； UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；CM825 皮膚水分含量測(cè)試儀和TM300皮膚水分流失測(cè)試儀，德國(guó) Courage+Khazaka公司； GPC-MALLS-RID凝膠滲透色譜，美國(guó)懷雅特技術(shù)公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中性鹽法制備絲素肽

按摩爾比1:8:2稱取CaCl2、H2O、C2H5OH加入帶冷凝回流裝置的燒瓶中，充分溶解后加入一定量的脫膠蠶絲，置于70 ℃的恒溫水浴鍋，回流攪拌至蠶絲充分鹽解。將鹽解后的溶液用濾紙過濾后置于8000 D的透析袋中，以去離子水進(jìn)行流動(dòng)透析去除鹽分，再經(jīng)冷凍干燥，得絲素肽，冷藏備用。

1.2.2 酶法制備絲肽

稱取0.2 g堿性蛋白酶制劑，加緩沖液預(yù)配制成250 mL澄清酶液。取一定量的絲素肽溶液、堿性蛋白酶溶液、緩沖液、pH值調(diào)節(jié)劑加入反應(yīng)容器，混合均勻、pH調(diào)至9.5。置于 40 ℃恒溫水浴鍋，緩慢攪拌，在酶解過程中維持酶解系統(tǒng) pH 恒定。反應(yīng)至預(yù)定時(shí)間，迅速置于沸水中10 min，冷卻后用鹽酸中和至pH為7.0，6000 r/min離心分離，收集上清夜，再冷凍干燥，獲得小分子量的絲肽，冷藏備用。

1.3 表征與性能測(cè)試

1.3.1 含量與分子量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]方法，用雙縮脲法測(cè)定樣品的中多肽含量；參考文獻(xiàn)[10]方法，用SDS-PAGE 測(cè)定絲素肽的分子量；采用GPC測(cè)定絲素短肽的分子量。

1.3.2 體外透皮分析

以小香豬皮為皮膚模型測(cè)定透皮率[11]，將小香豬豬皮用生理鹽水清洗干凈后，剪成大小合適，并固定在透皮吸收試驗(yàn)裝置的擴(kuò)散室與接受室之間，角質(zhì)層面向擴(kuò)散室，接收室中注入生理鹽水至液面完全與皮膚內(nèi)層接觸。向擴(kuò)散池內(nèi)加入5.0 mL生理鹽水與0.2 mL樣品，開啟電磁恒溫?cái)嚢杵?，溫?7 ℃± 2 ℃，100 r/min恒速攪拌，從接收池中取樣用雙縮脲法測(cè)定肽含量，同時(shí)補(bǔ)加同質(zhì)量的生理鹽水并排盡氣泡。其中，接收池體積為 10 mL，有效透過面積為 3.14 cm2。

1.3.3 潤(rùn)膚保濕成效測(cè)定

按照表1的配方，分別將A組分、B組分、C組分分散均勻，再將B組分均質(zhì)5 min，加入分散均勻的A組分均質(zhì) 5 min，加入分散均勻的C組分均質(zhì)5 min，冷卻消泡后，密封保存。采用化妝品保濕功效評(píng)價(jià)指南QB/T 4256-2011 方法測(cè)定，選取符合條件的志愿者參加測(cè)試。測(cè)試部位為前臂內(nèi)側(cè)。樣品及空白對(duì)照區(qū)按測(cè)試區(qū)域分布于志愿者前臂內(nèi)側(cè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域大小為3.0 cm×3.0 cm，樣品用量為(2.0±0.1) mg/cm2。測(cè)試人員在產(chǎn)品使用前、后進(jìn)行皮膚角質(zhì)層水分含量、皮膚經(jīng)皮水分流失的測(cè)試。

表1 膏霜測(cè)試樣配方表Table 1 Formula table of cream sample

續(xù)表1

表中辛酸/癸酸甘油三酯GTCC，甘油油酸檸檬酸酯GOC。

2 結(jié)果與討論

2.1 含量與分子量分析

對(duì)絲素肽含量與分子量測(cè)定結(jié)果見表1所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，絲素肽的肽含量93.8%，相對(duì)分子質(zhì)量主要位于14500；絲素短肽的肽含量95.3%，相對(duì)分子質(zhì)量主要位于1500(重均分子量)左右。表明中性鹽把蠶絲蛋白成功鹽解成能水溶的絲素肽，堿性蛋白酶進(jìn)一步將絲素蛋白水解成小分子量的絲素短肽，聚合度約為16。

表2 含量與分子量測(cè)定結(jié)果Table 2 Content and molecular weight of peptides

2.2 透皮實(shí)驗(yàn)分析

對(duì)絲素肽、絲素短肽的透皮率按公式(1)計(jì)算，透皮分析結(jié)果見圖1所示。絲素肽24 h時(shí)的透皮率為7.1%，絲素短肽在8 h時(shí)的透皮率為29.5%，絲素短肽24小時(shí)的的透皮率為47.8%。結(jié)果表明，大分子的絲素肽透皮性差，酶解降低分子量后的絲素短肽透皮性增強(qiáng)，有利于皮膚吸收。

圖1 絲肽的透皮實(shí)驗(yàn)Fig.1 Transdermal experiment of silk peptide

透皮率=(CnVn+∑CkVk)/m×100%

(1)

式中：Cn為樣品濃度，m為樣品添加量。

2.3 皮膚角質(zhì)層水分含量分析

測(cè)試人員在產(chǎn)品使用前選定皮膚測(cè)試位置的角質(zhì)層水分含量測(cè)試初始值見表3，產(chǎn)品按要求使用后，對(duì)第1 h、2 h、4 h、6 h、8 h時(shí)進(jìn)行皮膚角質(zhì)層水分含量測(cè)試，測(cè)試結(jié)果減去該位置的皮膚角質(zhì)層水分含量初始值，得皮膚角質(zhì)層水分含量變化量，結(jié)果如圖2所示。從測(cè)試結(jié)果可知，選定皮膚位置的角質(zhì)層水分含量的初始值接近，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)空白對(duì)照區(qū)域的皮膚角質(zhì)層水分含量穩(wěn)定，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)測(cè)試條件穩(wěn)定，表明測(cè)試數(shù)據(jù)可靠，對(duì)比性強(qiáng)。擦涂a、b、c膏霜的皮膚在8 h內(nèi)角質(zhì)層水分含量增加，具有明顯的保濕效果，其中在測(cè)試時(shí)間內(nèi)擦涂a膏霜的皮膚角質(zhì)層含水量增加8.6%，擦涂b膏霜的角質(zhì)層含水量增加在13.1%以上，擦涂c膏霜的角質(zhì)層含水量增加在17.5%以上，配方a具有一定的保濕效果是因?yàn)榕浞浇M分中含有甘油。結(jié)果表明，絲素肽與絲素短肽能改善皮膚的缺水狀態(tài)，滋潤(rùn)皮膚組織，絲素短肽對(duì)皮膚的保濕性能更為突出。

表3 皮膚角質(zhì)層水分含量初始值Table 3 Initial values of moisture content in cuticle

圖2 皮膚角質(zhì)層水分含量變化量Fig.2 Changes of moisture content in cuticle of skin

2.4 皮膚經(jīng)皮水分流失值分析

測(cè)試人員在產(chǎn)品使用前選定皮膚測(cè)試位置的皮膚經(jīng)皮水分流失測(cè)試初始值見表4，按要求使用后，對(duì)第1 h、2 h、4 h、 6 h、8 h時(shí)進(jìn)行皮膚經(jīng)皮水分流失測(cè)試，測(cè)試結(jié)果減去該位置的皮膚角質(zhì)層水分含量初始值，得皮膚經(jīng)皮水分流失變化量如圖3所示。選定皮膚位置的皮膚經(jīng)皮水分流失的初始值接近，空白對(duì)照區(qū)域的皮膚經(jīng)皮水分流失變化量小，表明皮膚經(jīng)皮水分流失量的測(cè)試環(huán)境穩(wěn)定。對(duì)比皮膚經(jīng)皮水分流失變化量發(fā)現(xiàn)，擦涂a、b、c膏霜的皮膚在4小時(shí)內(nèi)皮膚經(jīng)皮水分流失明顯減少，其中，擦涂b膏霜皮膚經(jīng)皮水分流失減少26.6%，擦涂c膏霜皮膚經(jīng)皮水分流失減少19.3%，體現(xiàn)出鎖水效果。b、c膏霜的鎖水效果均優(yōu)于a，膏霜b的效果更為明顯，膏霜a具有一定的鎖水效果是因?yàn)榕浞浇M分中含有一定量的油脂類組分。8小時(shí)后皮膚經(jīng)皮水分流失與空白對(duì)照接近，膏霜鎖水功能逐漸消失。結(jié)果表明，絲素肽/絲素短肽具有鎖水功能，大分子的絲素肽鎖水效果更為明顯。

表4 選定區(qū)域皮膚經(jīng)皮水分流失初始值Table 4 Initial values of skin transdermal moisture loss in selected areas

圖3 皮膚經(jīng)皮水分流失變化量Fig.3 Water loss through skin

3 結(jié) 論

天然蠶絲蛋白經(jīng)鹽解、酶解制備成分子量為14500的絲素肽和分子量為1500絲素短肽。透皮實(shí)驗(yàn)表明24 h內(nèi)絲素肽的透皮率為7.1%，小分量的絲肽透皮率接近47.8%。潤(rùn)膚保濕成效分析發(fā)現(xiàn)，含絲素肽與絲素短肽的膏霜具有良好的鎖水保濕功能。分子量大的絲素肽在皮膚表面形成一層鎖水膜，減少水分流失，起到潤(rùn)膚保濕的功效。絲素短肽通過皮膚吸收后，起到營(yíng)養(yǎng)肌膚的作用，提升皮膚角質(zhì)層的水分含量，鎖住角質(zhì)水分，從而達(dá)到滋養(yǎng)和保濕的目的，為拓展天然蠶絲蛋白在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。