金 珂,張麗娟,張 偉,張 翔,陳 橋,楊江華,張 詠,張效偉,3

1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210023

2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心,江蘇 南京 210023

3.江蘇省環(huán)境保護化學(xué)品安全與健康風(fēng)險研究重點實驗室,江蘇 南京 210023

對生態(tài)環(huán)境中物種多樣性的精準監(jiān)測是科學(xué)開展生態(tài)環(huán)境保護與管理的前提。 底棲動物占據(jù)淡水生態(tài)系統(tǒng)的核心位置,其種類與數(shù)量的分布情況對淡水生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況具有一定的指示作用,因此,常被用于淡水生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測與健康評估[1]。 傳統(tǒng)底棲動物監(jiān)測主要通過采集生物樣本,依據(jù)形態(tài)學(xué)方法進行鑒定。 然而,樣品挑揀和鑒定的難度大、周期長,需要消耗大量的人力和時間,且部分近緣種的形態(tài)特征非常相似,難以區(qū)分,對鑒定人員的專業(yè)要求較高[2-3]。 這些問題使得以形態(tài)學(xué)鑒定為主的底棲動物監(jiān)測方法在我國生態(tài)環(huán)境監(jiān)測工作中難以得到大規(guī)模應(yīng)用。

環(huán)境DNA 宏條形碼(eDNA Metabarcoding)技術(shù)是一種用于檢測生物多樣性的新方法[4],其基礎(chǔ)來自DNA 條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)[5-8],在生物監(jiān)測中具有巨大的應(yīng)用潛力。 生物在環(huán)境中活動時,其DNA 會不斷釋放到周圍的環(huán)境介質(zhì)中。 從環(huán)境介質(zhì)中提取的包含了物種多樣性信息的DNA 物質(zhì)被稱為環(huán)境DNA[9-12]。 環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)使用通用引物對環(huán)境DNA 樣品進行聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增,結(jié)合高通量測序技術(shù),可產(chǎn)生上百萬條反映物種多樣性的序列。 通過對序列進行分析,可以識別環(huán)境中的物種組成、群落結(jié)構(gòu)等多樣性信息。 與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)測方法相比,環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)能夠更快速、更精確、更經(jīng)濟[13-15]地識別水生態(tài)系統(tǒng)中生物群落的細微變化[14,16-17]。

環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)在底棲動物監(jiān)測和生物評價上尚存在一些不確定的問題[18]。 目前常用的底棲動物環(huán)境DNA 提取方法包括水樣提取、研磨提取、酒精浸提3 種方法。 其中,通過水樣提取的環(huán)境DNA 在物種識別方面與形態(tài)學(xué)識別結(jié)果的一致性較低[19]。 盡管研磨破碎經(jīng)挑揀的底棲動物并提取其DNA 可以獲得更高的物種識別率,但該方法的操作相對煩瑣。 酒精浸提法則是從用于保存標本的“清潔”乙醇固定劑中獲得底棲動物群落的環(huán)境DNA[11,20-23]。 最近,有少數(shù)研究者開始使用保存環(huán)境樣品的“臟”乙醇作為底棲動物環(huán)境DNA 的提取來源[24-25],表明其具有用于底棲動物生物監(jiān)測的潛力。 但受時間、人力、經(jīng)濟等因素的限制,早期的方法研究與示范僅限于少數(shù)樣品或監(jiān)測位點,鮮有在流域尺度上的實際應(yīng)用與驗證研究。

太湖流域水環(huán)境治理和生態(tài)恢復(fù)工作受到廣泛關(guān)注。 通過監(jiān)測太湖流域底棲動物多樣性,可以有效揭示太湖流域水環(huán)境受脅迫水平和水生態(tài)健康修復(fù)狀況。 對于太湖流域底棲動物監(jiān)測而言,既要對流域內(nèi)各點位的底棲動物物種進行識別,也要在此基礎(chǔ)上進行流域生態(tài)健康評價。 然而,我國尚未在流域尺度上開展過基于環(huán)境DNA的底棲動物多樣性監(jiān)測。 對此,本研究同步采用環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定方法,在太湖流域布點開展底棲動物群落監(jiān)測,詳細比較了兩種方法在物種識別、生態(tài)評價方面的一致性,并系統(tǒng)地分析了將環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)應(yīng)用于底棲動物監(jiān)測的可行性與有效性。

1 實驗方法

1.1 采樣點布設(shè)與環(huán)境樣品采集

2019 年8—11 月,在太湖流域共布設(shè)65 個采樣點位,同時采用環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法開展底棲動物監(jiān)測(圖1)。 采集環(huán)境樣品時,使用1/16 m2Peterson 采泥器采集水體底部沉積物樣品,每個點位采集8 夾。 在沒有沉積物的點位,使用D 網(wǎng)(寬0.3 m,孔徑425 μm)采集足量樣品。 在溪流點位,使用踢網(wǎng)(1 m×1 m,425 μm)采集足量樣品。 將采集到的樣品置于孔徑為425 μm 的篩網(wǎng)內(nèi)淘洗,挑去大塊石頭、植物枝干后,保留剩余的環(huán)境基質(zhì),于4 ℃冷藏帶回實驗室保存。 連續(xù)采樣時,應(yīng)清洗器材以避免交叉污染。 將樣品均勻混合后,分成兩等份,一份用于形態(tài)學(xué)鑒定,另一份用于環(huán)境DNA 監(jiān)測中的酒精浸提處理。 研究路線及技術(shù)路線見圖2。

圖1 太湖流域底棲動物采樣點Fig.1 Sampling sites of macroinvertebrate in Taihu Lake Basin

圖2 底棲動物監(jiān)測研究路線與技術(shù)路線Fig.2 Research flowchart and technical approaches of macroinvertebrate monitoring

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

返回實驗室后,將用于形態(tài)學(xué)鑒定的樣品4 ℃冷藏,并于24 h 內(nèi)挑揀出其中的底棲動物個體。 在解剖鏡和顯微鏡下對底棲動物個體進行鑒定,同時通過比對參考資料,將其鑒定至種或?qū)?并計數(shù)、稱重,計算生物量和生物密度[26-28]。

1.3 環(huán)境樣品前處理

用于環(huán)境DNA 監(jiān)測的樣品可于-20 ℃儲存。解凍后,參考MARTINS 等[25]的方法進行前處理。將包含底棲動物的環(huán)境基質(zhì)樣品置于2 L 玻璃缸中,根據(jù)環(huán)境基質(zhì)樣品的總重加入無水乙醇。 1 g樣品換算為1 mL,加入3.5 倍環(huán)境基質(zhì)樣品體積的無水乙醇。 輕輕搖晃混勻后,蓋上蓋子,在室溫下靜置14 d,隨后抽取2 mL 浸提液,保存在無菌離心管中。 在50 ℃的真空環(huán)境中蒸干離心管內(nèi)的乙醇,得到干燥的組織樣品。 為保證組織樣品留在離心管底部,可在真空離心機中蒸干。

1.4 環(huán)境DNA 提取與PCR 擴增

1.4.1 DNA 提取

對于干燥后的組織樣品,用DNeasy 試劑盒(德國Qiagen,69504)提取組織DNA。 首先向干燥的組織樣品中加入裂解緩沖液和蛋白酶K,渦旋均勻后,56 ℃水浴裂解3～4 h。 后續(xù)操作主要包括DNA 吸附上柱、洗滌雜質(zhì)、洗脫DNA,參照試劑盒說明書進行。 使用熒光計( 美國Invitrogen,Qubit 2.0)測定DNA 濃度。

1.4.2 PCR 擴增

PCR 擴增體系為50 μL,包含25 μL 的2×PrimeStar Max DNA 聚合酶(日本 TAKARA,R045A),5 μL DNA 模板(總量約20 ng),上下游引物各1.25 μL,無酶水17.5 μL。 上游引物為mlCOⅠintF,下游引物為dgHCO2198,其中,下游引物帶有一段唯一的短核苷酸序列,用于標記不同樣品。 PCR 程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性15 s,46 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸45 s,35 個擴增循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。 PCR 產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳的檢測后,進一步純化。

上游引物mlCOⅠintF 序列:5’-GGWACWGG WTGAACWGTWTAYCCYCC-3’。

下游引物dgHCO2198 序列:5’-TAAACYTC AGGRTGACCRAARAAYCA-3’。

DNA 提取和PCR 擴增中使用的器材和試劑均為無菌狀態(tài)或做滅菌處理,操作過程中避免交叉污染。

1.5 文庫構(gòu)建與高通量測序

將各個點位樣品的PCR 產(chǎn)物按照相等的DNA 量混合。 混合后的DNA 樣品用DNA 純化與分選磁珠(南京諾唯贊,VAHTS N411)再次純化,利用DNA 文庫構(gòu)建試劑盒(南京諾唯贊,VAHTS ND702)構(gòu)建測序文庫。 利用Ion Torrent測序平臺(美國Life Technologies,S5)進行測序。使用的所有器材和試劑均為無菌狀態(tài)或做滅菌處理,操作過程中避免交叉污染。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 生物信息學(xué)分析

測序完成后,使用Python 中的SeqIO 將FASTQ 文件轉(zhuǎn)化為FASTA 格式,使用QIIME(v1.8.0)剔除低質(zhì)量序列(Q<20)、錯配序列和長度<250 bp 的序列。 以上操作均在Bio-Linux 8系統(tǒng)下完成。 利用USEARCH7 進行可操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚類,相似度閾值為97%。 利用QIIME 將OTU 的代表性序列與本土物種數(shù)據(jù)庫進行比對,相似性閾值設(shè)定為85%,采用相似性最高的序列對應(yīng)的物種信息對OTU 進行注釋。

1.6.2 環(huán)境DNA 與形態(tài)學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)的比較分析

為評估環(huán)境DNA 方法在底棲動物物種識別上的有效性和可靠性,本研究從分類單元檢出數(shù)、優(yōu)勢物種識別結(jié)果、物種檢出頻次等方面,對兩種方法的監(jiān)測結(jié)果進行了比較,以探究兩種方法的一致性。 其中,對于檢出頻次上的相關(guān)性,分別采用了檢出頻次和檢出種次兩個指標進行比較。 檢出頻次表示某分類單元在多少個點位被檢出。 檢出種次進一步考慮了所隸屬的分類單元的數(shù)目,將隸屬于某一類群的所有物種在所有點位出現(xiàn)的次數(shù)進行加和,作為一項指標進行比較。 例如,環(huán)棱螺屬有銅銹環(huán)棱螺和梨形環(huán)棱螺2 個物種被檢出,其中,銅銹環(huán)棱螺在26 個點位被檢出,梨形環(huán)棱螺在25 個點位被檢出,則可以說環(huán)棱螺屬共計檢出51種次。

1.6.3 生物指數(shù)計算

參考已有的太湖流域生物指數(shù)研究成果[29],利用物種鑒別結(jié)果計算底棲動物完整性指數(shù)(Benthic-Index of Biotic Integrity,B-IBI),并評 價每個點位的底棲動物生態(tài)健康狀況。 單項指數(shù)包括:

B1:軟體動物分類單元數(shù)。 B1(監(jiān)測值)= 樣品中的軟體動物種類數(shù)。

B2:第一優(yōu)勢種優(yōu)勢度得分。 形態(tài)學(xué)方法中,B2(監(jiān)測值)= 第一優(yōu)勢種生物密度/點位總生物密度;環(huán)境DNA 方法中,B2(監(jiān)測值)= 第一優(yōu)勢OTU 序列數(shù)/點位總底棲動物序列數(shù)。

B3:大型底棲動物生物監(jiān)測工作組(Biological Monitoring Working Party,BMWP)打分值。 B3(監(jiān)測值)= BMWP=∑ti,ti為物種i所屬科的科級敏感值。

基于環(huán)境DNA 方法和形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果,分別計算單項指數(shù)和B-IBI,計算方法見表1 及公式(1)。 結(jié)合計算結(jié)果,對點位進行生態(tài)質(zhì)量等級劃分,并進行比較。

表1 淡水大型底棲無脊椎動物完整性單項指數(shù)計算方法Table 1 Index calculation method for the integrity of freshwater macroinvertebrates

式中:Bi為第i個生物指數(shù)的值。

2 結(jié)果分析

2.1 底棲動物多樣性監(jiān)測

2.1.1 物種識別

使用環(huán)境DNA 方法在65 個點位檢測出107種底棲動物,隸屬3 門6 綱14 目35 科73 屬。 底棲動物共計出現(xiàn)1 308 種次,平均每個點位發(fā)現(xiàn)底棲動物20.5 種。 通過環(huán)境DNA 方法在65 個點位的樣品中獲得了共計1 643 777 條高質(zhì)量序列,其中828 415 條序列(50%)可注釋到370 個OTU。 共有243 個OTU 被注釋到了107 種底棲動物,代表了760 331 條序列,包括環(huán)節(jié)動物、軟體動物、節(jié)肢動物等主要底棲動物類群(圖3)。

圖3 環(huán)境DNA 監(jiān)測注釋結(jié)果Fig.3 Annotated results of eDNA monitoring

基于形態(tài)學(xué)方法在65 個點位共檢出69 種底棲動物,隸屬3 門8 綱21 目33 科55 屬。 底棲動物共計出現(xiàn)515 種次,平均每個點位發(fā)現(xiàn)7.7 種。環(huán)境DNA 方法平均檢出物種數(shù)是形態(tài)學(xué)方法的近3 倍,在科、屬、種分類水平上均比形態(tài)學(xué)方法檢出了更多的分類單元數(shù),分別是形態(tài)學(xué)方法的106%、132%、155%(圖4)。 采用環(huán)境DNA 方法檢出物種數(shù)較多的點位及其物種數(shù):陽澄湖心,39種;大港橋,35 種;釣渚大橋,33 種;觀山橋,32種;東西氿,30 種。

圖4 兩種方法在不同分類階元的檢出數(shù)目比較Fig.4 Comparison of the number of taxadetected by the two methods

2.1.2 分類單元交叉情況

在科級水平,環(huán)境DNA 方法共檢出35 個科,形態(tài)學(xué)方法共檢出33 個科,其中有13 個科為兩種方法共同檢出,占形態(tài)學(xué)方法檢出總科數(shù)的近40%。 共有44 個形態(tài)學(xué)物種隸屬于交叉的13 個科,占據(jù)了形態(tài)學(xué)方法檢出總物種數(shù)的64.7%、所有個體數(shù)的94.9%和所有生物量的99.2%(表2,圖5)。 同時,共同檢出的科所代表的物種占據(jù)了環(huán)境DNA 方法檢出的所有底棲動物類群中66.3%的OTU 和76.4%的序列數(shù),說明環(huán)境DNA 方法產(chǎn)生的信息大部分都來源于形態(tài)學(xué)方法鑒定出的主要底棲動物類群。

圖5 科級別的交叉率Fig.5 Overlaps at family level

表2 各項指標在科級別的交叉情況Table 2 Overlaps of indexes in family level

在屬水平上,環(huán)境DNA 方法共檢出73 個屬,形態(tài)學(xué)方法共檢出55 個屬,其中有25 個屬為共同檢出,占形態(tài)學(xué)檢出總屬數(shù)的45.5%。 共同檢出的25 個屬包括30 個形態(tài)學(xué)物種,占據(jù)了形態(tài)學(xué)檢出總物種數(shù)的48.4%、所有個體數(shù)的94.2%及所有生物量的80.1%(圖6,表3)。 同時,共同檢出的屬所代表的物種也占據(jù)了環(huán)境DNA 方法檢出的大部分OTU(58.7%)和序列數(shù)(90.6%)。

圖6 屬級別的交叉率Fig.6 Overlaps at genus level

表3 各項指標在屬級別的交叉情況Table 3 Overlaps of indexes in genus level

2.1.3 優(yōu)勢物種與檢出頻次比較

在環(huán)境DNA 方法和形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果中,檢出頻次和第一優(yōu)勢物種次數(shù)的前五名非常一致(表4)。 與形態(tài)學(xué)方法相比,環(huán)境DNA 方法物種檢出頻次、第一優(yōu)勢物種次數(shù)、科檢出種次、屬檢出種次的前五名,分別有80%、60%、80%、60%是一致的。 總體而言,環(huán)境DNA 方法監(jiān)測結(jié)果表明,顫蚓科水絲蚓屬和尾鰓蚓屬、田螺科環(huán)棱螺屬、蜆科蜆屬是太湖流域廣泛分布的底棲動物類群。

表4 優(yōu)勢物種對照Table 4 Comparison of dominant species 次

在底棲動物屬水平的檢出頻次和檢出種次上,環(huán)境DNA 方法與形態(tài)學(xué)方法呈顯著線性相關(guān)(P<0.000 1,圖7)。 底棲動物流域分布特征存在較高的一致性,1 625 個點位-物種單元格中,共有1 175 個在兩種方法中獲得了一致的檢出結(jié)果,一致率達到了72.3%(圖8)。 同時,熱點圖也直觀地表明,水絲蚓屬、尾鰓蚓屬、環(huán)棱螺屬、蜆屬、前突搖蚊屬、長足搖蚊屬等類群是太湖流域較為普遍存在的類群,均被兩種方法高頻率地檢出。

圖7 兩種方法對各屬檢出率的比較Fig.7 Comparison of the detection rate of each genus by two methods

2.2 環(huán)境DNA 方法預(yù)測生物量

搖蚊科和顫蚓科是太湖流域最為常見的底棲動物類群,也是重要的水生態(tài)指示類群[30]。 本研究發(fā)現(xiàn),對于搖蚊科和顫蚓科底棲動物,在各點位測得的該類群序列數(shù)與形態(tài)學(xué)方法記錄的個體數(shù)及生物量之間,具有顯著的相關(guān)性(P<0.05,圖9)。 其中,搖蚊科的相關(guān)性較強,無論是序列數(shù)與個體數(shù)(R2=0.737,P<0.001),還是序列數(shù)與生物量(R2=0.545,P<0.001),都存在非常顯著的相關(guān)性。 而顫蚓科序列數(shù)與個體數(shù)、生物量之間的相關(guān)性較弱,但仍然顯著(P<0.05)。 上述結(jié)果表明,基于環(huán)境DNA 獲得的序列數(shù)可以用于定量預(yù)測搖蚊科和顫蚓科的個體數(shù)和生物量。

圖9 序列數(shù)與個體數(shù)、生物量的相關(guān)關(guān)系Fig.9 Correlation between reads and individuals or biomass

2.3 生態(tài)評價

2.3.1 生物指數(shù)

基于環(huán)境DNA 方法與形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果計算得到的軟體動物分類單元數(shù)(R2=0.381)、BMWP 打 分 值(R2= 0.287)、 B-IBI 值(R2=0.235)顯著線性相關(guān)(P<0.000 1,圖10)。 軟體動物分類單元數(shù)和BMWP 打分值是底棲動物生態(tài)評價中的常用指標,也是太湖流域B-IBI 值的組成部分。 由圖10 中的箱型圖可知,采用環(huán)境DNA 方法得到的B-IBI 值能夠較好地區(qū)分基于形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果劃分的不同生態(tài)健康等級的點位,對于參考點(良)、受損點(差)能夠很好地進行區(qū)分,箱體無重疊。

圖10 兩種方法計算生物指數(shù)的相關(guān)性Fig.10 Correlation of biological indices by two methods

2.3.2 流域尺度生態(tài)健康評價

在對點位進行生態(tài)健康等級劃分方面,根據(jù)環(huán)境DNA 方法監(jiān)測數(shù)據(jù)計算得出的B-IBI 結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)方法得出的結(jié)果基本一致。 40%的點位取得了與形態(tài)學(xué)方法一致的B-IBI 等級,絕大多數(shù)點位(94%)的B-IBI 等級和形態(tài)學(xué)方法評價結(jié)果的偏差在1 級以內(nèi)。 利用插值法繪制B-IBI 值的地理分布圖,反映出整個太湖流域江蘇片區(qū)的底棲動物完整性狀況(圖11)。 環(huán)境DNA方法監(jiān)測結(jié)果顯示,在流域尺度上,太湖東西兩岸、太湖東北(釣渚大橋周邊)、太湖流域西側(cè)(大溪水庫周邊)的底棲動物完整性狀況較好。 形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果呈現(xiàn)出類似的格局,兩種方法的高值區(qū)分布高度一致。

圖11 太湖流域底棲動物完整性Fig.11 The integrity of macroinvertebrate in Taihu Lake Basin

3 討論

3.1 物種鑒別的一致性

本研究采用的酒精浸提法是一種適用于底棲動物監(jiān)測的環(huán)境DNA 樣品前處理方法,相較于組織研磨或者標本浸提等前處理方式,酒精浸提無需對其中的底棲動物個體進行挑揀和初步分類,大大降低了前處理的時間和人力成本,也減小了交叉污染的風(fēng)險。 相較于水樣提取,利用底棲基質(zhì)更能反映采樣點原位的群落組成,樣品中的底棲動物密度也更大。 本研究環(huán)境DNA 方法注釋結(jié)果中,有54%的序列和90%的OTU 來自非靶向物種(非底棲動物),這是環(huán)境DNA 宏條形碼監(jiān)測中普遍存在的現(xiàn)象。 這些信號可能來源于浮游動植物或其他后生動物,也可能是由于物種條形碼數(shù)據(jù)庫中底棲動物數(shù)據(jù)的缺失[20,31]。

總體而言,環(huán)境DNA 方法在流域物種豐富度計算、常見種識別上,與形態(tài)學(xué)方法具有較高的一致性。 無論是在科還是屬的分類水平上,環(huán)境DNA 方法與形態(tài)學(xué)方法的共同檢出結(jié)果涵蓋了形態(tài)學(xué)方法檢出的大部分物種、絕大部分個體和生物量,代表了太湖流域底棲動物中分布較為廣泛、檢出頻次較高、物種優(yōu)勢度較高的類群。 在本研究中,采用環(huán)境DNA 方法檢出了形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果中40%的科和45.5%的屬,共同檢出的科和屬分別涵蓋了形態(tài)學(xué)方法檢出物種數(shù)的64.7%和48.4%。 這一比例與DEINER 等[32](科水平73%交叉)、MACHER 等[31](EPTs 類群64%交叉)、M?CHLER 等[33](屬水平62%交叉)的研究結(jié)果相近。 而GLEASON 等[19]的研究表明,在利用水樣環(huán)境DNA 進行底棲動物監(jiān)測時,其結(jié)果與組織研磨樣品環(huán)境DNA 分析結(jié)果的一致性較低。 此外,本研究中,在形態(tài)學(xué)監(jiān)測中檢出頻率較高的分類單元,在環(huán)境DNA 方法中同樣被高頻檢出,即環(huán)境DNA 方法在對流域常見種的識別上與形態(tài)學(xué)方法具有較高的一致性,兩種方法對于判斷某物種在流域范圍內(nèi)是否廣泛存在具有相近的效果。 AYLAGAS 等[34]發(fā)現(xiàn),利用形態(tài)學(xué)方法檢出的優(yōu)勢物種同樣也是利用環(huán)境DNA 方法識別出的優(yōu)勢物種。 HAJIBABAEI 等[35]的研究則表明,對于個體數(shù)不少于2 的物種,通過對標本進行酒精浸提,可以達到100%的檢出率,這也印證了上述結(jié)論。 因此,使用酒精浸提法直接處理環(huán)境樣品,并結(jié)合環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)進行底棲物種識別,在結(jié)果上與形態(tài)學(xué)方法具有較高的一致性。

環(huán)境DNA 方法比形態(tài)學(xué)方法識別出了更多的物種,既體現(xiàn)在總分類單元數(shù)目上,也體現(xiàn)在點位平均值上。 環(huán)境DNA 方法能夠識別出在形態(tài)學(xué)挑揀中因肉眼識別困難而容易遺漏的物種,例如仙女蟲科的某些種類。 盡管在數(shù)量上,兩種方法共同檢出的科較少,但共同檢出的科都是具有很高代表性的類群,如搖蚊科、顫蚓科、田螺科、蚌科等,這些科的檢出頻次和種次都處于所有科的前列。 與科級水平的情況類似,共同檢出的屬也都是具有很高代表性、檢出頻次和種次較高的類群,如環(huán)棱螺屬、蜆屬、水絲蚓屬、尾鰓蚓屬、長足搖蚊屬、小搖蚊屬等。 而環(huán)境DNA 方法檢出次數(shù)較少的物種主要為沙蠶、蛭等動物。 此類動物在接觸高濃度乙醇后會迅速固縮,其組織釋放較慢,可能導(dǎo)致浸提效率較低。 另外,一些毛翅目、蜻蜓目的物種在環(huán)境DNA 方法中的檢出次數(shù)較少,可能是由于個體數(shù)少且出現(xiàn)率低,降低了環(huán)境DNA方法的檢出率。 在MACHER 等[31]的研究中,環(huán)境DNA 宏條形碼方法對EPT 類群(蜉蝣目/衤責(zé)翅目/毛翅目)的識別率僅有8%(4/51),說明現(xiàn)有方法對該類群的檢出能力可能較弱。

在流域尺度的空間分布格局上,環(huán)境DNA 方法監(jiān)測結(jié)果與形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測結(jié)果呈現(xiàn)多方面的一致性。 兩種方法在檢出頻次和檢出種次上均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(R2>0.7,P<0.000 1)。 在形態(tài)學(xué)鑒定中頻繁檢出的分類單元,在環(huán)境DNA 方法中同樣頻繁檢出;在形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果中較為罕見的分類單元,在環(huán)境DNA 方法中同樣較少檢出。 在太湖流域,采用環(huán)境DNA 方法和形態(tài)學(xué)方法獲得了相似的物種分布圖譜,兩種方法的總體檢出一致率達到了72.3%。 因此,環(huán)境DNA 方法在物種包括優(yōu)勢種的識別上是有效的,與形態(tài)學(xué)方法具有較高的一致性,能夠用于太湖流域尺度的底棲動物多樣性監(jiān)測。

3.2 定量關(guān)系

環(huán)境DNA 方法在優(yōu)勢物種的定量分析上與形態(tài)學(xué)方法具有一致性。 其中,搖蚊科和顫蚓科物種在環(huán)境樣品中的生物密度和生物量,與環(huán)境DNA 方法檢出的序列數(shù)顯著正相關(guān)(P<0.05),尤其是搖蚊科的相關(guān)性較強,R2分別為0.737 和0.545。 搖蚊科和顫蚓科的生物密度往往非常大,采用人工計數(shù)的方法較為煩瑣。 此時,環(huán)境DNA數(shù)據(jù)提供的幫助就不容忽視。 對物種生物密度和生物量的估算是環(huán)境DNA 研究中的一項重要挑戰(zhàn)。 目前,已有一些研究表明,環(huán)境DNA 可以定量表征浮游動物和魚類等類群的生物多樣性[36-37],但是對于底棲動物的定量研究還較少且不深入。 CAREW 等[38]和LINARD 等[20]研究發(fā)現(xiàn),在標本浸提液樣品中,部分底棲動物的生物量與序列數(shù)具有相關(guān)性。 AYLAGAS 等[34]還發(fā)現(xiàn)了個體數(shù)與序列數(shù)之間的顯著相關(guān)性。 但在大塊環(huán)境樣品的浸提液中,將環(huán)境DNA 測序數(shù)據(jù)用于物種定量的可行性尚不明確,亦有研究認為難以發(fā)掘其定量關(guān)系[39]。 盡管底棲動物定量監(jiān)測不是本研究的主要目標,但本研究的結(jié)果表明,在復(fù)雜的環(huán)境樣品中,存在DNA 序列數(shù)與底棲動物生物密度、生物量之間的相關(guān)性。

3.3 生態(tài)評價的一致性

在流域尺度上開展的生態(tài)評價表明,由環(huán)境DNA 監(jiān)測數(shù)據(jù)推導(dǎo)出的B-IBI 值具有顯著的辨識度。 環(huán)境DNA 監(jiān)測結(jié)果在軟體動物分類單元數(shù)、BMWP 打分值和B-IBI 值上,與形態(tài)學(xué)監(jiān)測結(jié)果具有一致性,可用于評估水生態(tài)健康狀況。 在流域生態(tài)健康空間格局的描繪上,兩種方法的高值區(qū)高度重合,具有一致性。 已有部分研究表明,將環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)用于生態(tài)評價,可以獲得與形態(tài)學(xué)方法類似的結(jié)果。 例如,CLARKE 等[40]和MARTINS 等[41]分別在針對浮游動物和底棲動物群落的研究中發(fā)現(xiàn),通過環(huán)境DNA 方法和形態(tài)學(xué)方法可以得到相似的β 多樣性,盡管兩種方法得到的α 多樣性之間差距較大。 這與本研究結(jié)果類似,即兩種方法在物種識別上的結(jié)果并不完全一致,但在生態(tài)評價上的結(jié)果較為相近。EMILSON 等[42]和SERRANA 等[43]的研究表明,基于DNA 方法和形態(tài)學(xué)方法檢出的底棲動物群落,對理化因子的環(huán)境梯度有著相似的響應(yīng)。 而ERDOZAIN 等[44]研究發(fā)現(xiàn),相比形態(tài)學(xué)方法,環(huán)境DNA 方法檢出的底棲動物群落對環(huán)境變量的響應(yīng)較弱。 MARSHALL 等[45]發(fā)現(xiàn),基于兩種方法對底棲動物的監(jiān)測結(jié)果,可以對棲息地類型進行類似的區(qū)分。 此外,有證據(jù)表明,使用多引物組合可以更加全面地解釋群落結(jié)構(gòu),使生物評價的結(jié)果更加準確[41,46]。 綜上所述,盡管在物種識別層面有時略有出入,但這并未成為將環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)應(yīng)用于水體生態(tài)健康評價的障礙。 將環(huán)境DNA 監(jiān)測結(jié)果用于太湖流域底棲動物完整性評價是可行的,并且在很大程度上與形態(tài)學(xué)方法的評價結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論與展望

將環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)方法同步用于針對太湖全流域的底棲動物監(jiān)測,監(jiān)測結(jié)果表明,兩者在物種識別和生態(tài)評價方面均具有較高的一致性。 環(huán)境DNA 方法可以識別出太湖流域底棲動物中分布較為廣泛、檢出頻次較高、優(yōu)勢度較高的類群,且能比形態(tài)學(xué)方法識別出更多的物種。 兩種方法在各物種的檢出頻次上具有較強的相關(guān)性(P<0.000 1)。 基于環(huán)境DNA 方法得到的B-IBI 值與形態(tài)學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯著相關(guān),且在底棲動物完整性的流域空間格局描繪上高度一致。 此外,兩種方法還在生物量、序列數(shù)等方面呈現(xiàn)出一定的定量關(guān)系。

未來,需進一步完善本土物種DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫,以提高測序數(shù)據(jù)的物種注釋率和注釋結(jié)果的可靠性。 此外,生物密度和生物量是生物監(jiān)測和評估中的重要信息,因此,建立基于環(huán)境DNA的定量生物監(jiān)測技術(shù)具有重要意義。 綜上,環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)在大規(guī)模、多點位底棲動物多樣性快速監(jiān)測及相關(guān)評價工作中具備較高的可靠性,具有廣泛的應(yīng)用前景,未來有望顯著提高我國水生態(tài)系統(tǒng)生物監(jiān)測和生態(tài)健康評估的技術(shù)水平。