梁小燕，何學(xué)虎，張玉英，師志云，趙倩穎，韓朝陽(yáng)，郭雅琪，馬婷婷，董 潔，趙 玥，趙志軍，2

乙型肝炎病毒(HBV)是目前已知的感染人的最小DNA病毒之一[1]，由HBV所引起的乙型肝炎是一種流行久遠(yuǎn)、傳播廣泛、危害嚴(yán)重的傳染性疾病[2]。對(duì)HBV的防治已成為世界健康與傳染病控制的首要問(wèn)題。目前臨床診斷多數(shù)為煮沸法提取DNA，但其檢測(cè)靈敏度有限。而高敏乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)采用磁珠法，即在樣本中加入超順納米磁珠，磁珠可以富集微量的病毒核酸分子，然后再直接進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增[3]，基于磁珠法核酸提取的HBV-DNA定量試劑檢測(cè)方法使得檢測(cè)靈敏度達(dá)到為10 IU，可以更好地為臨床的診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 高敏乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)試劑盒：由湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 臨界及強(qiáng)陽(yáng)標(biāo)本：乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)盒自帶。

1.1.3 室間質(zhì)評(píng)物：衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.1.4 小牛血清：湖南圣湘科技有限公司惠贈(zèng)。

1.1.5 干擾物質(zhì)：膽紅素、血紅蛋白、EDTA-二甲(EDNTA)均為湖南圣湘科技有限公司惠贈(zèng)。

1.1.6 HBV-DNA檢測(cè)標(biāo)本：來(lái)自臨床患者標(biāo)本。

1.1.7 儀器：ABI7500 熒光定量PCR儀、低溫高速離心機(jī)、磁力架。

1.2 方法

1.2.1 正確度評(píng)價(jià)：采用衛(wèi)生臨檢中心HBV-DNA質(zhì)評(píng)物進(jìn)行檢測(cè)，按室間質(zhì)評(píng)的檢測(cè)要求連續(xù)進(jìn)行分析檢測(cè)，每批測(cè)定1次，計(jì)算5個(gè)樣品的分析結(jié)果與室間質(zhì)評(píng)結(jié)果靶值的偏倚。

1.2.2 精密度評(píng)價(jià)：取2個(gè)濃度水平的樣品(采用的是試劑盒自帶的臨界和強(qiáng)陽(yáng)質(zhì)控物)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行5 d 測(cè)試，每天每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算精密度值。2個(gè)濃度水平的樣品(采用的是試劑盒自帶的臨界和強(qiáng)陽(yáng)質(zhì)控物)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行5 d 測(cè)試，每天每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)精密度<3/5TEa，中間精密度<4/5TEa(以室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限靶值±0.4對(duì)數(shù)值作為允許總誤差TEa)。

1.2.3 線性范圍評(píng)價(jià)：取高濃度臨床樣品(109IU/mL)，分別用小牛血清按0、10、102、103、104、105、106、107、108倍進(jìn)行稀釋，每濃度稀釋樣本重復(fù)檢測(cè)3次。分別計(jì)算其均值，將均值與理論值比較，偏倚應(yīng)<20%,計(jì)算y=ax+b，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95，a值在1±0.05范圍內(nèi)。

1.2.4 可報(bào)告范圍評(píng)價(jià)：如線性范圍不能滿足臨床高值標(biāo)本的檢測(cè)范圍時(shí)，則需要在線性范圍基礎(chǔ)上擴(kuò)展可報(bào)告范圍，并進(jìn)行可報(bào)告范圍驗(yàn)證。

1.2.5 抗干擾能力評(píng)價(jià)：在HBV陽(yáng)性標(biāo)本中添加特定濃度的血紅蛋白、膽紅素、EDNTA干擾物質(zhì)后進(jìn)行定量，重復(fù)檢測(cè)3次,計(jì)算3次檢測(cè)結(jié)果與正常樣本的檢測(cè)結(jié)果以±0.4 Log內(nèi)為準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用graphpad prim軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均數(shù)、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、CV用非參數(shù)檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正確度結(jié)果：5個(gè)樣品連續(xù)檢測(cè)分析結(jié)果靶值偏倚小于ISO15189規(guī)定的7.5%，符合規(guī)定要求。

2.2 精密度結(jié)果：重復(fù)性精密度及中間精密度均符合ISO15189質(zhì)量認(rèn)可要求，見(jiàn)表1至表2。

表1 重復(fù)精密度(2個(gè)水平L和H)結(jié)果

表2 中間精密度(2個(gè)水平L和H)結(jié)果

2.3 線性范圍：a=0.973，R2=0.996，符合ISO15189質(zhì)量認(rèn)可要求，見(jiàn)圖1(封二)。

2.4 可報(bào)告范圍：線性范圍已經(jīng)涵蓋可報(bào)告范圍。

2.5 抗干擾能力檢測(cè)：正常樣本的檢測(cè)結(jié)果均在±0.4 Log內(nèi)，符合ISO15189質(zhì)量認(rèn)證要求，見(jiàn)表3。

表3 抗干擾能力檢測(cè)結(jié)果分析

3 討論

我國(guó)是乙型肝炎患者和肝炎病毒攜帶者人數(shù)最高的國(guó)家，乙肝病毒攜帶者占我國(guó)總?cè)丝诘?%～10%[4]。全球權(quán)威指南一致認(rèn)為乙肝治療的根本目的在于長(zhǎng)期持續(xù)抑制病毒復(fù)制，阻止疾病發(fā)展[5]。然而乙肝臨床癥狀復(fù)雜，肝功能與乙肝標(biāo)志物對(duì)乙肝的診斷、監(jiān)控有部分的誤診率和漏診率[6-7]，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)可以準(zhǔn)確快速地反映乙肝患者體內(nèi)的乙肝病毒復(fù)制情況，從而有效地彌補(bǔ)了乙肝標(biāo)志物的不足，HBV-DNA載量成為貫穿乙肝診斷、治療及監(jiān)控的主要指標(biāo)[8]。但采用不同的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒對(duì)于乙肝病毒復(fù)制的監(jiān)測(cè)靈敏度不同[9-10]。HBV復(fù)制的一個(gè)最顯著的特點(diǎn)是經(jīng)mRNA中間體進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這一過(guò)程由于缺乏校對(duì)酶的作用而容易發(fā)生錯(cuò)誤，核苷酸替代率約為(1～3)×105/nt·年。HBV 變異率高于其他DNA病毒4個(gè)數(shù)量級(jí)，而低于RNA病毒1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。普通PCR試劑一般采用S或C區(qū)等保守段基因進(jìn)行單靶標(biāo)擴(kuò)增，因此，存在定量值偏低[11]的情況。以國(guó)產(chǎn)達(dá)安試劑為例，其檢測(cè)靈敏度為100 IU/mL，那么HBV-DNA復(fù)制在100 IU/mL以下的乙肝患者或經(jīng)藥物治療后恢復(fù)中的乙肝患者不能得到有效準(zhǔn)確的診斷及監(jiān)控。本次實(shí)驗(yàn)采用湖南圣湘生物科技有限公司的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)試劑盒經(jīng)性能驗(yàn)證，其靈敏度高達(dá)20 IU/mL[12]，能準(zhǔn)確反映患者體內(nèi) HBV 的復(fù)制情況和傳染性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱匿性感染，有效防止醫(yī)源性傳播[13-14]。線性范圍寬至101～109可以有效地診斷、監(jiān)控乙肝病毒的復(fù)制情況。同時(shí)，正確度、精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍及抗干擾能力均符合ISO15189質(zhì)量認(rèn)證要求。高敏乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測(cè)經(jīng)性能驗(yàn)證可以用于臨床乙肝標(biāo)本的檢測(cè)，并能為臨床提供快速、準(zhǔn)確的報(bào)告[15]。