申 雪 聶 晶 李春霖 邵圣枝 黃 翠 張永志 武 運，* 袁玉偉，*

(1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021)

近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程的加快，葡萄酒的產(chǎn)量有了大幅度增長，消費者對葡萄酒的品質(zhì)越發(fā)重視。葡萄酒是葡萄全果經(jīng)酒精發(fā)酵后的產(chǎn)物[1-2]，不同地域釀酒葡萄品質(zhì)及葡萄酒釀造工藝差異使葡萄酒具有明顯的地域特色。近年來葡萄酒摻假、地理產(chǎn)地誤標(biāo)等情況時常發(fā)生，對葡萄酒品牌形象和消費者權(quán)益造成了嚴(yán)重?fù)p害[3]。因此，需要開發(fā)一種能夠快速、穩(wěn)健地對原產(chǎn)地進(jìn)行驗證的方法，以確保能準(zhǔn)確識別原產(chǎn)地[4-5]。

穩(wěn)定同位素比值能反映農(nóng)產(chǎn)品所處的環(huán)境條件并提供可靠、準(zhǔn)確的產(chǎn)地來源信息[6]。葡萄酒中穩(wěn)定同位素組成受原料種植地的光照氣候、地理位置與種植方式的影響，因此不同種植環(huán)境中的葡萄酒所含穩(wěn)定同位素比值表現(xiàn)出一定的地域特征[7-8]，可利用這種地域特征對葡萄酒進(jìn)行產(chǎn)地判別驗證。近年來，利用該技術(shù)探討發(fā)酵對穩(wěn)定同位素的影響取得了良好的成效。Zyakun等[9]系統(tǒng)調(diào)查了不同產(chǎn)區(qū)中葡萄酒發(fā)酵前后δ13C值的變化，發(fā)現(xiàn)葡萄酒中δ13C差異是由于釀酒葡萄生長條件和品種所致。Fauhl等[10]對不同發(fā)酵條件下的葡萄酒進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酵母菌株、發(fā)酵溫度或葡萄酒澄清度等參數(shù)對乙醇中甲基位(D/H)Ⅰ均未有顯著影響。Perini等[11]通過研究5個不同發(fā)酵階段的126個樣品中的穩(wěn)定同位素組成，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵階段各指標(biāo)參數(shù)與δ18O無關(guān)。綜上，國內(nèi)外對葡萄酒發(fā)酵過程中穩(wěn)定同位素比值的研究大多集中于單一穩(wěn)定同位素比值，而對整個發(fā)酵過程中各樣品穩(wěn)定同位素比值的研究較少，無法體現(xiàn)發(fā)酵過程中各穩(wěn)定同位素比值的變化。

本試驗采用元素分析儀-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)測定了發(fā)酵前(全果、果汁和皮籽)與發(fā)酵后(酒和皮渣)各固體樣品中同位素比值的特征差異及相關(guān)性，以期為葡萄酒產(chǎn)品的真實性研究提供理論參考與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗樣品于2020年9月采自新疆焉耆盆地的芳香莊園與鄉(xiāng)都酒莊的葡萄種植基地(兩地相距70 km)，采用對角線采樣的方式進(jìn)行收集，每個采樣點采集4～5 kg，共計15個采樣點，品種均為赤霞珠。

葡萄酒果酒專用酵母購自安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸鉀購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶(酶活力8 600 PGNU/g)，購自法國拉氟德公司；穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB= -10.449‰)和IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.3‰)，購自奧地利國際原子能機(jī)構(gòu)；B2155(δ13CV-PDB=-26.98‰，δ15Nair=5.94‰)購自英國EMA公司；USGS64(δ13CV-PDB=-40.81‰)、USGS40(δ15Nair=9.52‰)、USGS55(δ2H=-28.2‰，δ18OV-SMOW=19.12‰)和USGS56(δ2HV-SMOW=-44‰，δ18OV-SMOW=27.23‰)購自美國地質(zhì)勘探局。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Vario PYRO cube 型元素分析儀、Isoprime100型穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，德國Elementar公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；LC110-12勻漿機(jī)，佛山市翁開爾貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備與預(yù)處理 樣品經(jīng)采集后，用去離子水清洗干凈后進(jìn)行低溫干燥，去除表面水分。利用勻漿機(jī)將樣品進(jìn)行勻漿后，平均分裝成3份，分別用于發(fā)酵前(全果、果汁和皮籽)與發(fā)酵后(酒和皮渣)樣品的制備。

全果：取1份勻漿樣品作為全果樣品；

果汁：取1份勻漿樣品，利用0.5 mm篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，獲得的濾液作為果汁樣品；

皮籽：制備果汁樣品時經(jīng)篩網(wǎng)過濾后得到的濾渣為皮籽樣品；

酒：取1份勻漿樣品，先加入0.03%果膠酶和0.025%偏重亞硫酸鉀，攪拌均勻后再加入活化好的0.02%安琪釀酒活性干酵母。按照《GB/T 15037-2006 葡萄酒》[12]和《GB/T 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)酵和檢測，將發(fā)酵液用多層紗布進(jìn)行過濾后得到發(fā)酵完成后的葡萄酒樣品；

皮渣：待葡萄酒發(fā)酵過程結(jié)束后，經(jīng)過濾后得到的殘渣作為皮渣樣品。

將制備的樣品先放置于-20℃冰箱中冷凍保存，在-80℃、20 Pa條件下冷凍干燥至恒重。干燥結(jié)束后使用液氮將全果、皮籽和皮渣樣品研磨至粉末，裝入棕色小瓶中，置于18℃以下的干燥器中保存，待測。本研究中的果汁和酒樣品均為冷凍干燥并研磨后的固體樣品。

1.3.2 穩(wěn)定同位素比值測定 碳和氮穩(wěn)定同位素：稱取6～7 mg待測樣品，放入錫箔杯(5 mm×9 mm)中包好，然后放入元素分析儀的固體樣品自動進(jìn)樣盤中。樣品中碳、氮元素通過高溫燃燒后經(jīng)氧化銅還原成CO2和N2，再進(jìn)入穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。檢測條件：元素分析儀中燃燒爐和氧化爐的溫度分別為1 150℃和850℃，載氣He(99.999%)，流量為250 mL·min-1。在分析過程中碳穩(wěn)定同位素使用IAEA-CH-6、B2155和USGS64，氮穩(wěn)定同位素使用IAEA-N-2、B2155和USGS40為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別采用三點校正的方法對測試結(jié)果進(jìn)行校正。

氫和氧穩(wěn)定同位素：稱取約0.5 mg待測樣品，放入銀舟(8 mm×5 mm)中包樣，包好的樣品按編號放入元素分析儀自動固體進(jìn)樣盤中，樣品中的氫、氧元素在經(jīng)高溫裂解后分別轉(zhuǎn)化為H2和CO，進(jìn)入穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。檢測條件：元素分析儀裂解爐溫度為1 450℃，He流量為150 mL·min-1。在分析過程中以USGS55和USGS56作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對測試結(jié)果進(jìn)行兩點校正。

參照下列公式計算穩(wěn)定性同位素比值：

式中，R樣品為所測樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為國際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，其中，δ13C以維也納美洲擬箭石(V-PDB)為基準(zhǔn)，δ15N以大氣中氮氣為基準(zhǔn)，δ2H和δ18O以維也納標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水(V-SMOW)為基準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0(美國IBM公司)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)和皮爾遜相關(guān)分析，其中單因素方差分析采用鄧肯(Duncan)多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前葡萄中穩(wěn)定同位素分布特征

發(fā)酵前，對葡萄各部分(全果、果汁和皮籽)固體品中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖1所示。δ13C的分布范圍為-25.0‰～-24.4‰，全果(-24.7‰) 與皮籽(-24.6‰)及果汁(-24.8‰)間δ13C值的差異不顯著。δ15N分布范圍為2.4‰～5.4‰，各部分樣品間均具有顯著性差異，全果(4.6‰)顯著高于皮籽(2.8‰)和果汁(3.8‰)，而果汁顯著高于皮籽。δ2H分布范圍為-26.9‰～-14.3‰，全果(-19.3‰) 與果汁(-20.0‰)之間δ2H值差異不顯著，但顯著高于皮籽(-22.9‰)。δ18O分布范圍在32.1‰～41.6‰，全果(34.4‰)與皮籽(34.3‰)之間δ18O值差異不顯著，但果汁(40.1‰)的δ18O值顯著高于全果與皮籽。經(jīng)比較分析，除了δ13C外，發(fā)酵前各固體樣品(全果、果汁和皮籽)中δ15N、δ18O和δ2H均存在差異性。此外，全果中δ2H極差較大，跨度為10.3‰，而δ18O 極差較小，跨度為0.5‰。

注：不同小寫字母表示經(jīng)單因素方差分析，樣本間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Note: Different lowercases represent that significance exists between inter-samples after one-way ANOVA(P<0.05). The same as following.圖1 發(fā)酵前葡萄中穩(wěn)定同位素比率Fig.1 Stable isotope ratio in grapes before fermentation

2.2 發(fā)酵后葡萄酒中穩(wěn)定同位素分布特征

將釀酒葡萄發(fā)酵后，通過篩網(wǎng)過濾得到上清液(葡萄酒)與皮渣部分，收集兩部分樣品進(jìn)行穩(wěn)定同位素分析，各同位素比值分布情況略有不同(表1)。葡萄酒與皮渣中δ13C均值分別為-25.1‰和-25.2‰，無顯著差異；而δ15N、δ2H和δ18O值在酒和皮渣中差異較大，葡萄酒中δ15N值顯著低于皮渣，而δ2H與δ18O值均顯著高于皮渣，其中，δ2H差異較大，可能是由于添加的發(fā)酵劑導(dǎo)致同位素比值分餾[14]。綜上，發(fā)酵后的葡萄酒與固體皮渣樣品中除δ13C以外，其余穩(wěn)定同位素比值均呈顯著性差異。

表1 發(fā)酵后葡萄酒中穩(wěn)定同位素平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Average and standard deviation of stable isotopes in wine after fermentation /‰

2.3 發(fā)酵前后不同樣品中穩(wěn)定同位素的變化及相關(guān)性分析

全果和皮籽經(jīng)發(fā)酵后變?yōu)榫婆c皮渣，采用單因素方差法對發(fā)酵前后全果和酒，皮籽和皮渣中穩(wěn)定同位素比值的差異與變化進(jìn)行分析。由圖2可知，發(fā)酵前后穩(wěn)定同位素特征分布均有不同。碳是生物體的骨架元素，也是參與生命代謝的重要元素[15]。酒和全果中δ13C值分別為-25.1‰和-24.7‰，皮渣和皮籽中δ13C值分別為-25.2‰和-24.6‰，酒與全果中δ13C 值雖無顯著差異，但皮渣中δ13C值顯著低于皮籽。氮是發(fā)酵過程中重要的元素，酒和全果中δ15N值分別為3.6‰和4.9‰，皮渣和皮籽中δ15N值分別為5.0‰和2.8‰，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)δ15N值在發(fā)酵前后不同樣品中都具有顯著性差異。氫是質(zhì)量最小的元素，其同位素比值易受到外界影響而發(fā)生分餾。酒和全果中δ2H值分別為-28.7‰和-19.3‰，而皮渣和皮籽中的δ2H值分別為-57.5‰和-22.9‰，由此可見，氫同位素在發(fā)酵過程中發(fā)生較大變化，以皮渣中的同位素變化跨度最大。氧是構(gòu)成生物界與非生物界最重要的元素[16]。酒和全果中δ18O值分別為36.7‰和34.4‰，皮渣和皮籽中δ18O值分別為30.0‰和34.3‰，酒中δ18O值顯著高于發(fā)酵前全果，而皮渣中δ18O顯著低于發(fā)酵前的皮籽,由此可見δ18O值在發(fā)酵前后的變化趨勢不同。

通過對全果和酒、皮籽和皮渣中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O穩(wěn)定同位素特征進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析(表2)，結(jié)果表明，全果和酒中對應(yīng)相同元素的同位素比值相關(guān)性較弱且不顯著，葡萄酒δ15N與全果δ18O值呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.66(P<0.01)。皮籽和皮渣中對應(yīng)相同元素的同位素比值相關(guān)性較弱且不顯著，皮渣δ15N與皮籽δ18O值呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.61(P<0.05)。由此可見在該試驗條件下發(fā)酵對葡萄酒中穩(wěn)定同位素有顯著影響。

圖2 葡萄酒發(fā)酵后穩(wěn)定同位素特征Fig.2 Stable isotope characteristics of wine after fermentation

3 討論

本研究立足于我國新疆焉耆盆地的釀酒葡萄，分析了發(fā)酵前釀酒葡萄(全果、果汁和皮籽)與發(fā)酵后各樣品(葡萄酒和皮渣)中穩(wěn)定同位素比值分布情況，初步探討了發(fā)酵前后穩(wěn)定同位素比值變化，得到葡萄酒發(fā)酵前后各樣品穩(wěn)定同位素比值變化的相關(guān)性。葡萄

表2 發(fā)酵后葡萄與葡萄酒中穩(wěn)定同位素相關(guān)性Table 2 Correlation of stable isotopes in grape and wine after fermentation

是典型的C3植物[17]，本研究中釀酒葡萄的δ13C主要分布在-24.75‰附近，符合C3植物的穩(wěn)定同位素比值分布范圍[18]。C3植物中δ13C易受到位置、海拔的影響[19-20]。新疆是我國高緯度地區(qū)，新疆的大棗[21]、梨[22]、甜瓜[23]等農(nóng)產(chǎn)品的δ13C均值分別在-27.0‰、-26.0‰及-25.0‰附近。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中的施肥(有機(jī)肥與化肥)[24-25]會影響農(nóng)產(chǎn)品中δ15N值，使其比值發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄不同部位(全果、果汁和皮籽)中δ15N值存在顯著差異，這也印證了δ15N在植物體中分餾具有差異性。δ2H和δ18O是具有地理指示性的穩(wěn)定同位素，容易受到位置、海拔、海岸線等因素的影響[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆焉耆盆地產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄中的δ2H和δ18O分別在-26.9‰～14.3‰和32.1‰～41.6‰范圍內(nèi)。將釀酒葡萄發(fā)酵為葡萄酒的過程中，葡萄酒中的δ2H受到了人為及外部環(huán)境的影響。研究葡萄酒中的同位素可驗證產(chǎn)品的真實性，報道中多以葡萄酒中的乙醇為研究對象。本研究對發(fā)酵前后的全果、酒、皮籽、皮渣中各元素的穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)各元素的穩(wěn)定同位素比值特征均有不同，發(fā)酵前后相同元素的同位素相關(guān)性不顯著主要歸因于發(fā)酵過程。基于本研究結(jié)果，為建立更加穩(wěn)定的葡萄酒原產(chǎn)地數(shù)據(jù)庫，建議應(yīng)結(jié)合不同的釀酒葡萄品種和產(chǎn)地以及不同的發(fā)酵工藝展開研究。

4 結(jié)論

本研究采用固體樣品分析法對發(fā)酵前釀酒葡萄各部位(全果、果汁和皮籽)與發(fā)酵后各樣品(酒和皮渣)中穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同樣品中除δ13C外，其余穩(wěn)定同位素比值在發(fā)酵前后均具有顯著差異性。進(jìn)一步對發(fā)酵前全果和發(fā)酵后葡萄酒與發(fā)酵前皮籽和發(fā)酵后皮渣進(jìn)行相關(guān)性對比，發(fā)現(xiàn)各相同元素的穩(wěn)定同位素比值相關(guān)性較小(P<0.05)。結(jié)果證明通過固體樣品分析法能對發(fā)酵前后各樣品中穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行初步探索，為葡萄酒產(chǎn)品真實性鑒別提供了新思路。