何 潔 梁 霜 李 忠,2,3,* 趙 致

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3 貴州省農(nóng)業(yè)微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

過路黃(LysimachiachristinaeHance)，屬報(bào)春花科珍珠菜屬多年生匍匐草本植物，民間俗稱金銀花、走游草、金錢草等[1]。過路黃莖匍匐，鋪地效果好，可以作為觀賞性植物用于園林建設(shè)。此外，過路黃是我國(guó)南方民間常用的中草藥植物，有文獻(xiàn)記載其具有清熱解毒、消腫解痛、利尿通淋等作用[2]，臨床用于治療膽結(jié)石、泌尿系統(tǒng)結(jié)石、慢性膽囊炎、腎積水等癥狀[3-4]。目前關(guān)于過路黃的研究報(bào)道僅限于其藥用價(jià)值、臨床應(yīng)用和種植等方面，對(duì)其病害的識(shí)別及防治研究較少。隨著市場(chǎng)需求增大，過路黃的種植面積逐年增加，其病害也開始發(fā)生。2019年6月在施秉縣三泓藥業(yè)股份有限公司中藥材種植示范基地發(fā)現(xiàn)，過路黃葉部邊緣有明顯的紅褐色病斑，且病斑面積隨著時(shí)間的增長(zhǎng)有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)，發(fā)病后期葉部有穿孔現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整片葉枯死，嚴(yán)重影響其觀賞性及藥用價(jià)值。

目前，中藥材病害的防治方法主要以化學(xué)藥劑為主，但農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題迫使人們尋求更加安全高效的防治方法[5]。據(jù)報(bào)道，植物內(nèi)生細(xì)菌具有固氮、分泌植物激素、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性和產(chǎn)生抗真菌代謝產(chǎn)物等多種生物學(xué)作用[6]，因此分離并應(yīng)用植物內(nèi)生細(xì)菌成為生物防控技術(shù)研究的一大熱點(diǎn)[7-8]。其中芽胞桿菌是研究較為廣泛的一類細(xì)菌，其穩(wěn)定性、相容性、一致性均優(yōu)于其他生防菌[9]。目前運(yùn)用生物防治控制作物病害已取得了一些進(jìn)展，已從多種植物內(nèi)部分離出具有促生或拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，如苜蓿[10]、黃精[11]、人參[12]等，在病害的防治上具有巨大的開發(fā)潛力，但關(guān)于過路黃的病害防控鮮有報(bào)道。為了明確過路黃的葉部病害病原種類，采集典型病葉并利用組織分離法、柯赫氏法則、形態(tài)觀察和分子生物學(xué)方法等技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，并從太子參健康塊根內(nèi)分離篩選出對(duì)該病原菌有顯著抑制作用的拮抗細(xì)菌，利用形態(tài)、生理生化、16S rDNA以及DNA促旋酶A亞基編碼基因(gyrA)序列分析明確細(xì)菌種類，旨在為過路黃葉斑類病害的病原識(shí)別及生物防治技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來(lái)源 過路黃病葉及太子參健康塊根于2019年6月分別采集自貴州省施秉縣三泓藥業(yè)股份有限公司中藥材種植基地和牛大場(chǎng)鎮(zhèn)太子參種植基地。將樣品裝入采樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L；Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 供試病原菌 細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、齊整小核菌(Sclerotiniatidis)、果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)，均由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。

1.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法[13]在病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，于75%酒精中浸泡10 s，無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于PDA平板，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，挑取無(wú)污染的邊緣菌絲至另一PDA平板，重復(fù)此步驟3～5次獲得純培養(yǎng)菌株，于4℃斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

選取健康葉片洗凈擦干水分，用5 mm的無(wú)菌打孔器在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌餅，用滅菌針在葉片刺傷2個(gè)定點(diǎn)，接種菌餅于定點(diǎn)上，將葉片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，以同樣方法接種菌餅于無(wú)刺傷的葉片上，以接種無(wú)菌瓊脂塊為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于溫度28℃、相對(duì)濕度70%、光周期為12 h光照/12 h黑暗的培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，每天觀察并記錄葉片的發(fā)病情況[14]。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將純化培養(yǎng)7 d的菌株，用DNA提取試劑盒(上海生物工程有限公司)并參照說明書提取DNA。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔(internal transcribed spacer, ITS)區(qū)通用引物ITS1: 5′-G G C G T C A A G T G G A T G C C T-3′/ITS4: 5′-G G T A T A G T T A T T C G C C T C C T-3′、轉(zhuǎn)錄延伸因子(elongation factor，EF-1α)引物EF1: 5′-A T G G GT A T A A G G A(A/G)G A A A G A C-3′/EF2: 5′-GGA(G/A)G T A C C A G T(G/A)A T C A T G T T-3′、β-微管蛋白基因(β-tubulin)引物Bt2a：5′-T T C C C C C G T C T C C A C T T C T T C AT G-3′/Bt2b：5′-GGA(G/A)G T A C C A G T(G/C)A T C A T G T T-3′[15]對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(以上引物均由上海生物工程有限公司合成)。25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL、正反引物各1 μL、2×Taq PCR Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：ITS序列反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。β-tubulin基因的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。EF-1α基因反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后送至上海生物工程有限公司測(cè)序。將獲得的菌株序列復(fù)制至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，然后在Genbank中進(jìn)行同源性比較，參考文獻(xiàn)[16]下載各模式菌株基因序列基于最大簡(jiǎn)約法用PAUP*4.0軟件構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定病原菌的種類。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選及鑒定

1.5.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 采用組織塊培養(yǎng)法[17]進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。具體步驟：將采集的健康太子參塊根用自來(lái)水沖洗干凈，75%酒精表面消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，將最后一次使用的無(wú)菌水均勻涂布于PDA平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)1～3 d驗(yàn)證表面消毒情況。用無(wú)菌濾紙擦干塊根水分，用滅菌刀切取3 mm×3 mm的組織塊于LB固體培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。將平板上形狀、顏色、大小不一的菌落挑取至另一LB平板上，不斷劃線獲得純菌株保存于含20%甘油的凍存管內(nèi)，于-80℃保存。

1.5.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選 采用平板對(duì)峙法[18]，將純化后培養(yǎng)7 d的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中央，將各形態(tài)不一的細(xì)菌以十字交叉法分別接種于距離病原菌2 cm處，以只接種病原菌的平板作為對(duì)照，對(duì)照組菌落長(zhǎng)滿平板時(shí)利用十字交叉法測(cè)量病原菌的生長(zhǎng)直徑，設(shè)置3個(gè)重復(fù)取平均值計(jì)算拮抗菌對(duì)病原菌的抑制情況。

抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.5.3 拮抗菌形態(tài)觀察及生理生化測(cè)定 參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]，將活化后的拮抗菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及顏色，同時(shí)挑取適量菌落進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.5.4 拮抗菌的分子鑒定 利用Biomiga細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行提取。PCR擴(kuò)增利用16S rDNA通用引物27F：5′-C T A C G G C T A C C T T G T T A C G A-3′和1492R：5′-G A G A G G A T C C T G G C T C A G-3′、gyrA引物F：5′-C A G T C A G G A A A T G C G T A C G T C C T T-3′和R：5′-C A A G G T A A T G C T C C A G G C A T T G C T-3′[20](以上引物均由上海生物工程有限公司合成)。反應(yīng)總體系與上述病原菌體系相同，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物公司測(cè)序，用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件將測(cè)序得到的序列和GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，下載同源性較高的菌株序列通過MEGA6.0軟件采用鄰近(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 拮抗細(xì)菌抑菌譜測(cè)定

通過平板對(duì)峙法測(cè)定拮抗菌株對(duì)極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、齊整小核菌(Sclerotiniatidis)、果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)4種病原真菌的抑菌譜，平板對(duì)峙法的操作步驟同1.5.2。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性測(cè)試

過路黃葉斑病發(fā)病時(shí)，在葉片上能看到明顯的紅褐色病斑，發(fā)病后期病斑面積逐漸擴(kuò)大，聚合為一個(gè)大病斑，伴有穿孔現(xiàn)象(圖1-A)。在過路黃健康葉片上用無(wú)菌接種針刺傷后接種病原菌，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后開始發(fā)病，7 d后發(fā)病部位病斑逐漸擴(kuò)大呈紅褐色，致病力較強(qiáng)(圖1-D、D1)，無(wú)傷接種病原菌7 d后葉片也出現(xiàn)紅褐色病斑，但病斑面積較刺傷葉片小(圖1-C、C1)。接種瓊脂塊的對(duì)照葉片培養(yǎng)7 d后仍無(wú)發(fā)病現(xiàn)象(圖1-B、B1)。從發(fā)病部位再次分離病原菌得到與之前相同的菌落，表明該病原菌為過路黃葉斑病的致病菌，菌株編號(hào)為GLHYB。

注：A:過路黃葉斑病發(fā)病癥狀；B、B1：接種瓊脂塊7 d后的發(fā)病癥狀；C、C1：未刺傷接種病原菌7 d后的發(fā)病癥狀；D、D1：刺傷接種病原菌7 d后的發(fā)病癥狀。Note: A: Symptoms of Lysimachia christinae leaf spot. B、B1: Symptoms after 7 days with stab inoculation. C、C1: Symptoms of 7 days after inoculation without stab wound. D、D1: Symptoms after 7 days of inoculation.圖1 過路黃葉斑病發(fā)病癥狀及人工接種病原菌發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of Lysimachia christinae leaf spot and artificial inoculation of pathogen

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

GLHYB菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d左右時(shí)，病原菌長(zhǎng)滿全皿，菌落顏色為白色、米白色，菌絲生長(zhǎng)茂盛，呈絨毛狀，菌落底部有淡黃色的分生孢子座，基物表層肉色，菌落背面呈淡黃色(圖2-A、B)。小型分生孢子數(shù)量多，卵型或腎型，大多為0～1個(gè)隔膜(圖2-C)，大型分生孢子呈紡錘型，有的兩端略彎曲且較鈍，大小為(21.65～38.74)μm×(2.68～7.46)μm，有3～7個(gè)隔膜，多數(shù)為3～5個(gè)隔膜(圖2-D)。厚垣孢子數(shù)量多，單生、對(duì)生或串生，呈球形(圖2-E～G)，產(chǎn)孢細(xì)胞在氣生菌絲上長(zhǎng)出單瓶梗狀，單瓶梗產(chǎn)孢(圖2-H、I)。

注：A：病原菌菌落形態(tài)正面；B：病原菌菌落形態(tài)背面；C：小型分生孢子；D：大型分生孢子；E、F、G：厚垣孢子形態(tài)；H、I：產(chǎn)孢細(xì) 胞。標(biāo)尺為20 μm。Note:A、B: The colony morphology of pathogen (A: Front, B: Back). C: Small conidias. D: Large conidias. E、F、G:Morphology of chlamydospores. H、I: Sporogenic cell. The scale is 20 μm.圖2 腐皮鐮刀菌菌落形態(tài)特征Fig.2 Colony morphological characteristics of F. solani

2.3 病原菌的分子鑒定

測(cè)序結(jié)果顯示，ITS、EF-1α、β-tubulin基因獲得的序列長(zhǎng)度分別為522、602、337 bp，各基因序列如圖3所示。將各基因序列復(fù)制到NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，選取同源性較高的菌株序列構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明目標(biāo)菌株GLHYB與腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)聚為一支，支持率為95%，且與其他種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。結(jié)合形態(tài)及分子生物學(xué)結(jié)果鑒定可知，導(dǎo)致過路黃葉斑病的病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani)。

圖3 ITS、EF-1α、β-tubulin基因序列Fig.3 ITS, EF-1 α,β-tubulin gene sequence

圖4 基于ITS、EF-1α、β-tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(GLHYB為目標(biāo)菌株)Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS，EF-1 α，β-tubulin genes sequences (GLHYB as target strain)

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離、篩選

利用組織塊培養(yǎng)法從太子參塊根內(nèi)分離出12株形態(tài)不一的細(xì)菌，進(jìn)一步以GLHYB為指示菌，采用平板對(duì)峙法篩選出1株對(duì)GLHYB抑制效果達(dá)50%以上的拮抗細(xì)菌，編號(hào)為X14(圖5-A、B)。利用光學(xué)顯微鏡觀察該菌株對(duì)GLHYB菌絲生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)X14可引起GLHYB菌絲的膨大及畸形(圖5-C、D)。

注：A：GLHYB菌落形態(tài)；B菌株X14對(duì)GLHYB的拮抗效果；C：GLHYB 的菌絲形態(tài)；D：菌株X14引起GLHYB菌絲膨大、畸形。Note: A: The colony morphology of GLHYB. B: Antagonistic effect of X14 on GLHYB. C: The mycelial morphology of GLHYB. D: The strain of X14 caused the mycelial of GLHYB enlargement and deformity.圖5 拮抗細(xì)菌X14對(duì)GLHYB菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of X14 on the mycelial growth of GLHYB

2.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌譜測(cè)定

利用平板對(duì)峙法測(cè)定X14對(duì)細(xì)極鏈格孢菌(A.tenuissima)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、齊整小核菌(S.tidis)、果生刺盤孢菌(C.fructicola)4種主要病原真菌的抑菌效果，結(jié)果顯示X14對(duì)這4種病原真菌均有較強(qiáng)的抑菌效果(圖6)，抑菌率均達(dá)50%以上(表1)。

圖6 菌株X14對(duì)4種主要病原真菌的拮抗效果Fig.6 Antagonistic effects of X14 against four pathogen fungi

表1 菌株X14對(duì)5種供試病原真菌的抑菌率測(cè)定Table 1 Determination of bacteriostatic rates of X14 against five tested pathogenic fungi

2.6 拮抗細(xì)菌的形態(tài)及生理生化測(cè)定

菌株X14在LB培養(yǎng)基上菌落初期為白色，后期顏色泛黃，表面粗糙、不透明(圖7-A)。該菌株經(jīng)生理生化特征測(cè)定結(jié)果為革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖7-B)，明膠液化明顯呈陽(yáng)性，能使淀粉水解(表2)。

注：A：菌株X14的菌落形態(tài)；B：菌株X14的革蘭氏染色結(jié)果。Note: A: The colony morphology of X14. B: Gram staining results of X14.圖7 菌株X14的菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.7 Colony morphology and Gram staining of X14

表2 菌株X14的生理生化測(cè)定Table 2 Physiological and biochemical determination of X14

2.7 拮抗細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)上海生物公司測(cè)序返回的16S rDNA及gyrA基因序列如圖8，序列長(zhǎng)度分別為1 462、926 bp，將復(fù)制序列至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，序列比對(duì)結(jié)果中X14與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的同源性達(dá)99.54%，基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明X14與枯草芽孢桿菌聚為一支，支持率為90%，進(jìn)一步進(jìn)行g(shù)yrA基因鑒定，結(jié)果顯示其與枯草芽孢桿菌聚為一支且支持率為100%(圖9)，因此可將X14鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

圖8 菌株X14 16S rDNA、gyrA基因序列Fig.8 16S rDNA and gyrA gene sequence of strain X14

圖9 菌株X14基于16S rDNA和gyrA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of X14 based on 16S rDNA and gyrA genes

3 討論

葉斑病是多種植物葉部主要真菌病害之一，其病原種類較為廣泛。研究表明，擬盤多毛孢(Pestalotiopsisspp.)、鏈格孢(Alterariaspp.)、棒孢霉(Corynesporaspp.)、莖點(diǎn)霉(Phomaspp.)、葉點(diǎn)霉(Phyllostictaspp.)等多種真菌均可引起植物發(fā)生葉斑病，而鐮刀菌屬真菌多為土傳類病原菌，侵染植物根莖部，導(dǎo)致根腐、莖腐、枯萎等，國(guó)內(nèi)僅報(bào)道了層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)[21]、燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)[22]可侵染植物引起葉斑病。本研究結(jié)合形態(tài)及分子生物學(xué)方法將貴州省施秉縣過路黃葉斑病病原菌鑒定為腐皮鐮刀菌，該菌廣泛分布于世界各個(gè)角落，可作為腐生菌普遍存在于土壤及病殘?bào)w內(nèi)[21]，同時(shí)也是一種土傳病害的病原菌，可侵染多種植物(如滇黃精[23]、胡蘿卜[24]、芒果[25]、半夏[26]、馬鈴薯[27]等)引起根腐病和莖枯病，對(duì)于腐皮鐮刀菌能侵染過路黃引起葉斑病，本研究屬早期發(fā)現(xiàn)。對(duì)于鐮刀菌屬真菌的鑒定，由于其孢子形態(tài)具有多型性及易變異性，僅依靠形態(tài)及單基因無(wú)法鑒定到種。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，明確了一些可用于鐮刀菌種間鑒定的基因位點(diǎn)，如內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、線粒體小亞基核糖體(mitochondrial small subunit rDNA,mtSSU)、β-微管蛋白(β-tubulin)及翻譯延伸因子(nuclear translation elongation factor-1α,EF-1α)等[28～29]。本研究選用ITS、EF-1α及β-tubulin基因片段能區(qū)分目的菌株與其他菌株，明確了施秉縣過路黃葉斑病病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani)。

近年來(lái)，許多學(xué)者致力于從不同生態(tài)環(huán)境中分離篩選具有拮抗作用的菌株來(lái)防治植物病害，為病害的綠色防治提供了一條新途徑。菌株以細(xì)菌居多，而根系內(nèi)生細(xì)菌是生防功能微生物篩選的重要資源庫(kù)，其中芽胞桿菌(Bacillusspp.)是其優(yōu)勢(shì)微生物種群，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，抗逆性強(qiáng)且能穩(wěn)定定植[30]，具有很好的抗菌防病效果，目前研究主要集中在枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、多粘芽胞桿菌(Bacilluspolymyxa)、 短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheni-formis)等幾個(gè)種[31]，以枯草芽孢桿菌最為普遍。本研究以F.solani為指示菌，首次從太子參健康塊根內(nèi)分離篩選出1株對(duì)過路黃葉斑病病原菌抑菌率達(dá)50%以上的拮抗細(xì)菌X14，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定，初步明確了該菌株為芽孢桿菌，以往對(duì)于細(xì)菌鑒定主要是生理生化結(jié)合16S rDNA序列分析進(jìn)行種類鑒定，近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)16S rDNA序列在芽胞桿菌不同種之間存在較高的相似性[32-33]，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系難以區(qū)分，但一些高突變率蛋白質(zhì)編碼基因可以用來(lái)區(qū)分種間差異，如促旋酶(gyrAse)亞單位基因(gyrA)、促旋酶B亞單位基因(gyrB)逐漸作為芽孢桿菌種類鑒定的新靶標(biāo)，本研究利用16S rDNA以及gyrA基因明確了菌株X14為枯草芽孢桿菌，該菌具有廣譜抑菌性，對(duì)供試植物病原真菌細(xì)極鏈格孢菌(A.tenuissima)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、齊整小核菌(S.tidis)、果生刺盤孢菌(C.fructicola)的抑菌率在50%～70%之間，與韓如月等[34]研究結(jié)果相似。研究表明，芽孢桿菌的抑菌機(jī)理主要為直接競(jìng)爭(zhēng)病原菌的營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)，以及產(chǎn)生胞外酶從而達(dá)到溶菌作用[35]，其自身還能分泌一些表面活性物質(zhì)，如表面活性素、伊枯草菌素等抗菌素，具有抑制作物病害擴(kuò)展能力[36]。Ambrico等[37]研究表明，枯草芽孢桿菌ET-1可產(chǎn)生伊枯草菌素，能有效抑制真菌菌絲的擴(kuò)展，對(duì)檸檬綠霉病和草莓灰霉病防效分別為68.6%和74.1%；此外，芽孢桿菌還能分泌次生物質(zhì)作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物自身抗病性[38]。本研究結(jié)果表明，菌株X14能引起過路黃葉斑病菌絲膨大和畸形，與程歡歡等[39]研究結(jié)果相似。在本研究菌株培養(yǎng)過程中X14與病原菌未發(fā)生物理觸碰，其抑菌機(jī)理可能是在培養(yǎng)過程中菌株X14產(chǎn)生了某種抗生素或次生代謝產(chǎn)物從而抑制了病原菌的生長(zhǎng)，但具體的抑菌機(jī)理及田間防控效果等方面還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過病原菌的分離純化、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定及多基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等技術(shù)手段，將引起貴州省施秉縣過路黃葉斑病的病原菌鑒定為腐皮鐮刀菌(F.solani)，并以F.solani為指示菌，從健康太子參塊根內(nèi)分離篩選出1株對(duì)該菌抑菌率達(dá)52.33%的拮抗細(xì)菌X14，利用形態(tài)、生理生化、16S rDNA及gyrA基因序列分析，明確該拮抗細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，該菌對(duì)細(xì)極鏈格孢菌(A.tenuissima)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、齊整小核菌(S.tidis)、果生刺盤孢菌(C.fructicola)的菌絲抑制率在50%～70%之間，具有較大的生防潛力，可進(jìn)一步用于田間驗(yàn)證以及抗菌機(jī)理的研究。