張小琴，郝興宇，宗毓錚，張東升，史鑫蕊，李 萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

大豆是重要的油料作物，也是國家糧食安全體系中的重要作物，在中國居民食物結(jié)構(gòu)中占有重要地位［1］。聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(huì)（Intergovernmental Panel on Climate Change，IPCC）報(bào)告指出，大氣中CO2濃度在21世紀(jì)末可能升高到936 μmol/mol左右［2］。CO2是光合作用的底物，其濃度的變化會(huì)直接影響植物的生長發(fā)育。有研究表明，CO2濃度升高會(huì)影響大豆的光合特性、生物量積累以及產(chǎn)量與營養(yǎng)品質(zhì)的形成［3］。高CO2濃度條件下大豆葉片的光合作用和水分利用效率提高，有利于大豆生物量的增加［4］。

作為整個(gè)生物代謝的中心，糖代謝連接著蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝、核酸代謝及次生物質(zhì)代謝。蔗糖是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物運(yùn)輸和儲(chǔ)存的主要形式。蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）參與葉片中蔗糖合成［5］。三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TAC）是糖、脂肪、氨基酸等物質(zhì)有氧分解代謝釋放能量的共同途徑，為植物生命活動(dòng)提供主要能量，而異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）是該途徑的關(guān)鍵酶。三羧酸循環(huán)支路可以保障TAC的碳架補(bǔ)給，異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是三羧酸循環(huán)支路的關(guān)鍵酶［6］。戊糖磷酸途徑（hexose monophophate pathway，HMP）是植物體中糖代謝的重要途徑，在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的NADPH和ATP，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase，G6PDH）是該途徑的關(guān)鍵酶［7］。大豆油脂的化學(xué)成分為三酰甘油（triacylglycerol，TAG），由甘油和3分子長鏈脂肪酸在多種酶的催化下形成。脂肪酸的合成主要在質(zhì)體中進(jìn)行，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）可以催化乙酰CoA形成脂肪酸鏈的直接供體——丙二酸單酰CoA。二酰甘油脂酰轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油合成的限速酶［8］。酶活性強(qiáng)弱能反映代謝途徑的變化［6］。TAC為蛋白質(zhì)合成提供碳架，HMP為脂肪合成提供氫供體，脂肪代謝關(guān)系著脂肪合成，這些代謝途徑的變化關(guān)系著大豆品質(zhì)的變化［6］。

目前，大氣CO2濃度升高在小麥、水稻和大豆中的相關(guān)研究有很多［9-11］，但大多都集中在光合生理、氮素營養(yǎng)等方面［12-14］，也有對大豆品質(zhì)方面的研究報(bào)道［15-16］，但對其物質(zhì)和能量代謝方面卻鮮有報(bào)道。本研究開展了大氣CO2濃度升高對大豆鼓粒期光合作用、蔗糖代謝、TAC及脂肪代謝關(guān)鍵酶活性影響的研究，擬明確CO2濃度升高對大豆糖代謝及脂肪代謝的影響機(jī)制，為大豆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與供試材料

供試大豆品種為“晉大70”（油脂含量為22.06%，蛋白含量為41.18%）。試驗(yàn)地點(diǎn)位于山西省晉中市太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地（37.42°N，112.58°E）。試驗(yàn)CO2濃度設(shè)兩個(gè)水平：對照（CK，400 μmol/mol）和高CO2濃度（EC，600 μmol/mol）。在控制氣室（鋁合金框架玻璃結(jié)構(gòu)，每個(gè)氣室長8.0 m、寬3.0 m、高3.2 m）內(nèi)，通過CO2傳感器測定氣室內(nèi)的CO2濃度，主控電腦根據(jù)所測濃度來對氣室內(nèi)的CO2濃度進(jìn)行調(diào)控，使其在目標(biāo)范圍內(nèi)。

采用盆栽試驗(yàn)（直徑37 cm，高34 cm，底部打孔），于2019年6月20日播種大豆。每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，共20盆，在出苗后進(jìn)行間苗，每個(gè)重復(fù)保留6株大豆。在大豆鼓粒期（2019年9月7日）進(jìn)行光合指標(biāo)測定，隨機(jī)選取4盆，每盆選取一株功能葉片（倒2葉）測定，其余倒2葉和豆莢放置于-80℃低溫保存，用于測定其他生理指標(biāo)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 葉片光合參數(shù)測定

利用便攜式氣體交換系統(tǒng)LI-6400在鼓粒期于9:00—11:00測定光合參數(shù)。光照強(qiáng)度設(shè)為1 400 μmol/（m2·s），溫度穩(wěn)定在（26±0.5）℃，對照氣室CO2濃度設(shè)定為400 μmol/mol，高CO2濃度氣室CO2濃度設(shè)定為600 μmol/mol。選擇形狀相似的倒2葉，測定凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，gs）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）和葉片水分利用效率（water use effi-ciency，WUE），WUE=Pn/Tr［17］。采用直接浸提法測定葉綠素含量［18］。

1.2.2 糖代謝指標(biāo)測定

蔗糖含量及SS、SPS活性采用郭茜茜［19］的方法進(jìn)行測定。采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測定G6PDH、SDH、ICDH和ICL的活性。準(zhǔn)確稱取0.1 g葉片和籽粒，加入1 mL提取液研缽勻漿充分研磨，8 000×g4℃離心10 min，取上清置于冰上待測，按加樣表依次加入試劑，在340 nm波長下進(jìn)行比色，按樣本質(zhì)量計(jì)算G6PDH活性。SDH和ICDH按上述步驟分別在11 000×g和10 000×g4℃的條件下離心10 min，ICL在15 000×g4℃的條件下離心20 min，在600、505和340 nm波長下比色。采用蒽酮硫酸比色法測定可溶性糖和淀粉含量［18］。

1.2.3 脂肪代謝指標(biāo)測定

ACCase活性采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒進(jìn)行測定。ACCase活性按照G6PDH活性測定的方法在660 nm波長下進(jìn)行。DGAT活性采用上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)生物有限公司的試劑盒測定，采用雙抗體夾心法在450 nm處測定，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用索氏提取法測定脂肪含量［18］。

1.2.4 大豆產(chǎn)量性狀調(diào)查

收獲前調(diào)查每個(gè)重復(fù)有效株數(shù)，2019年10月14日收獲后進(jìn)行考種，測定單株莢數(shù)、單莢粒數(shù)及百粒重，計(jì)算單株產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和圖表的繪制均采用Excel 2016進(jìn)行。利用SPSS 25軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差的單變量分析（P=0.05）。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2濃度升高對大豆產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

CO2濃度升高使大豆單株粒重、單株莢數(shù)和百粒重顯著增加25.6%、23.4%和21.1%，單莢粒數(shù)雖增加但未達(dá)顯著水平（表1）。

表1 CO2濃度升高對大豆產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響Tab. 1 Effects of elevated CO2 concentration on yield component of soybean

2.2 CO2濃度升高對大豆葉片光合參數(shù)的影響

CO2濃度升高使大豆葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別顯著增加45.7%、54.2%和46.1%，對葉綠素a/b無顯著影響（表2）。在高CO2濃度下，葉片的Pn和WUE顯著增加59.7%和63.2%，gs和Tr無顯著變化（圖1）。

圖1 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片光合參數(shù)的影響Fig. 1 Effects of elevated CO2 concentration on photosynthetic parameters of soybean leaves at seed filling stage

表2 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片光合色素含量的影響Tab. 2 Effects of elevated CO2 concentration on photosynthetic pigment content of soybean leaves at seed filling stage

2.3 CO2濃度升高對大豆葉片和籽粒TAC及HMP的影響

CO2濃度升高對大豆葉片的可溶性糖和淀粉含量無顯著影響，但使籽粒的可溶性糖含量顯著下降20.6%，對淀粉含量無顯著影響（圖2）。CO2濃度升高使葉片的SDH活性顯著下降38.5%，ICDH活性顯著升高215.0%，對ICL和G6PDH活性無顯著影響。在高CO2濃度下，籽粒的SDH、ICL和G6PDH活性顯著升高75.0%、248.2%和1 119.3%，ICDH活性顯著下降36.1%（圖3）。

圖2 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片和籽粒的可溶性糖和淀粉含量的影響Fig. 2 Effects of elevated CO2 concentration on the contents of soluble sugar and starch in leaves and seeds of soybean at seed filling stage

圖3 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片和籽粒的6-磷酸葡萄糖脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和異檸檬酸裂解酶活性的影響Fig. 3 Effects of elevated CO2 concentration on the activities of 6-phosphate glucose dehydrogenase, succinate dehydrogenase, isocitrate lyase and isocitrate dehydrogenase in leaves and seeds of soybean at seed filling stage

2.4 CO2濃度升高對大豆葉片和籽粒蔗糖代謝的影響

蔗糖是光合產(chǎn)物在植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕问剑亲蚜Ｖ械矸酆铣傻闹饕记绑w［20-21］。CO2濃度升高對大豆葉片的蔗糖含量和SS活性無顯著影響，SPS活性顯著升高28.8%。在CO2濃度升高條件下，籽粒的蔗糖含量和SS活性顯著下降25.0%和32.3%，SPS活性無顯著變化（圖4）。

圖4 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片和籽粒的蔗糖、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性的影響Fig. 4 Effects of elevated CO2 concentration on the content of sucrose, the activities of sucrose synthase and sucrose phosphate synthase in leaves and seeds of soybean at seed filling stage

2.5 CO2濃度升高對大豆葉片和籽粒脂肪代謝的影響

大豆油脂的化學(xué)成分為TAG，由甘油和脂肪酸在多種酶的催化下脫水縮合形成。CO2濃度升高使大豆脂肪含量升高但未達(dá)顯著水平（圖5）。在CO2濃度升高條件下，葉片的ACCase和DGAT活性顯著下降14.4%和76.8%，籽粒的ACCase活性顯著升高15.8%，DGAT活性無顯著變化（圖6）。

圖5 CO2濃度升高對大豆脂肪含量的影響Fig. 5 Effects of elevated CO2 concentration on soybean fat content

圖6 CO2濃度升高對大豆鼓粒期葉片和籽粒的乙酰輔酶A羧化酶和二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的影響Fig. 6 Effects of elevated CO2 concentration on the activities of acetyl-CoA carboxylase and diacylglycerol acyltransferase in leaves and seeds of soybean at seed filling stage

3 討論

蘇營等［22］的研究表明，CO2濃度升高有增加大

豆株高、莖粗、干重和單株籽粒重的趨勢。本研究中，CO2濃度升高使大豆單株莢數(shù)和百粒重均顯著增加，單株籽粒重也顯著提高，表明在高CO2濃度下大豆產(chǎn)量的增加是因?yàn)榇蠖箚沃昵v數(shù)和百粒重的增加，這與郝興宇等［23］的研究結(jié)果一致。光合色素是植物利用光合能力的重要指標(biāo)，可以通過其來判斷植物光合生理能力和環(huán)境脅迫狀況［24］。Pn可以反映植物光合作用的強(qiáng)弱［25-26］。本研究表明，CO2濃度升高條件下，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著增加，但由于葉綠素b含量的增加幅度大于葉綠素a含量的增加，葉綠素a/b的值下降。這表明高CO2濃度更有利于葉綠素b含量的增加，該結(jié)果和蔣躍林等［27］的研究結(jié)果一致。Pn和WUE在高CO2濃度下顯著升高，這與葉綠素含量的變化一致。大氣CO2濃度升高后，作物細(xì)胞間CO2濃度的增加或葉肉細(xì)胞中Rubisco活性的提高及光呼吸的降低，可能是Pn增加的原因［23-28］。WUE的增加是由于Pn的升高引起的［29］。

TAC是碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)氧化分解的最后共同代謝途徑，具有分解代謝和合成代謝的雙重作用，同時(shí)為生物體內(nèi)物質(zhì)的合成提供碳骨架。SDH作為TAC中唯一的膜結(jié)合酶，催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，是TAC和呼吸鏈唯一的交匯點(diǎn)［20］。本試驗(yàn)中，CO2濃度升高使大豆葉片中SDH活性顯著降低，可溶性糖和淀粉含量變化不顯著，大豆籽粒中的HMP和TAC中關(guān)鍵酶活性顯著提高，籽粒中可溶性糖含量顯著下降，表明CO2濃度升高可以減弱葉片中的TAC代謝，但使籽粒中TAC代謝加強(qiáng)，有利于糖和淀粉的水解，為籽粒的生長提供能量。蔗糖及蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與卸載對籽粒中淀粉的積累與合成有重要的作用［30］，SPS和SS活性反映植物蔗糖合成和分解的能力［31］。本研究中，CO2濃度升高使大豆葉片中SPS活性顯著增加，但SS活性和蔗糖濃度無顯著變化，淀粉含量增加，表明CO2濃度升高有利于催化大豆葉片中蔗糖合成，使淀粉積累增加。有研究表明，對于高脂肪型大豆，蔗糖含量高不利于蛋白質(zhì)的積累，高效的SS/SPS循環(huán)有利于蛋白質(zhì)的積累［20］。本研究中，CO2濃度升高使大豆籽粒中SS活性和蔗糖濃度顯著下降。這表明高濃度的CO2不利于高脂肪型大豆蛋白質(zhì)的積累。

有研究表明，大豆的脂肪和蛋白質(zhì)含量呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，且蛋脂總量保持不變［32-33］。在油菜種子中，G6PDH活性與脂肪含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，是評(píng)價(jià)脂肪品質(zhì)的指標(biāo)［34］。本試驗(yàn)中，CO2濃度升高，大豆葉片和籽粒中G6PDH活性增加，有利于HMP運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)籽粒中脂肪含量增加。大豆油脂的合成代謝主要分為：脂肪酸的從頭合成、脂肪酸的脫飽和、三酰甘油的合成及油體形成［35］。ACCase可以在酶水平上和活力水平上控制脂肪酸的合成，是脂肪酸合成的限速酶［20］。DGAT能催化二酰甘油和脂肪酸?；纬蒚AG，是TAG合成的限速酶［8］。本試驗(yàn)中，大豆葉片中ACCase和DGAT活性在高CO2濃度下顯著降低，籽粒中ACCase活性顯著升高，DGAT活性變化不顯著，脂肪含量升高。這表明CO2濃度升高更有利于籽粒中脂肪酸的合成和脂肪含量的增加。

綜上所述，CO2濃度升高主要通過增加大豆單株莢數(shù)和百粒重增加大豆產(chǎn)量。CO2濃度升高可以增加大豆光合色素含量，提高光合作用。高CO2濃度有利于大豆葉片中的蔗糖合成和磷酸戊糖途徑運(yùn)轉(zhuǎn)。在高CO2濃度下，大豆籽粒蔗糖代謝減弱，導(dǎo)致蔗糖含量減少，三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑代謝加強(qiáng)，可溶性糖含量減少，脂肪酸合成增強(qiáng)，從而有利于脂肪含量增加。