李 琪， 孫 悅， 丁成華， 潘華平， 齊城成， 石國棟， 董艷玉， 李石林， 袁麗霞

(江西中醫(yī)藥大學(xué)， 南昌 330004)

泄瀉是臨床常見疾病,以排便次數(shù)增多,糞質(zhì)溏薄或完谷不化,甚至瀉出如水樣為主癥,脾虛濕盛為其主要病機(jī),腸道濕熱證和寒濕困脾證是其常見證型[1]?，F(xiàn)代研究表明,泄瀉患者均存在不同程度的腸道菌群失調(diào)[2-4],但不同證型泄瀉患者腸道菌群是否存在差異有待進(jìn)一步研究。本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)探究腸道濕熱證、寒濕困脾證泄瀉患者及健康志愿者3類人群腸道菌群特征,可為泄瀉的證候分型及后續(xù)的臨床與實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1．1 病例來源及分組

選取2018年4月至2019年5月在江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院就診的腸道濕熱證泄瀉患者12例，其中男10例，女2例，平均年齡55(24～69)歲，身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)平均22.87(19.69～25.94)kg/m2。寒濕困脾證泄瀉患者12例，其中男7例，女5例，平均年齡60(31～76)歲，平均BMI 22.08(19.29～25.68)kg/m2。同時選取12例健康志愿者，其中男2例，女10例，身體均無重大疾患，近期無身體不適)納入對照組，平均年齡56(23～73)歲，平均BMI 21.96(19.85～25.31)kg/m2。3組人群在年齡、BMI指數(shù)方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1．2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《泄瀉中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》中泄瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)，具備全部主癥和2項以上次癥，參考舌脈即可辨證[1]。

1．3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；近1個月內(nèi)未服用益生菌、益生元、抗生素或中草藥等可能對腸道菌群有影響的藥物；自愿參與配合該研究并簽署相關(guān)知情同意書。

1．4 排除標(biāo)準(zhǔn)

胃腸道手術(shù)史者；合并內(nèi)分泌、心血管等可能引起胃腸道癥狀及菌群失調(diào)疾病的患者；藥物原因引起的泄瀉。

1.5 主要設(shè)備及儀器

GV-B-DNA-50細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒(北京鼎固昌盛生物技術(shù)有限公司)；ABI GeneAmp 9700型PCR儀(美國ABI公司)；BCD-215SJV 型-20 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司)；澳柯瑪 DW-86L348 -80 ℃低溫冰箱(澳柯瑪股份有限公司)；XW-90A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；DYY-6C型電泳儀(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)；TBS-380微型熒光計(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)；Illumina Miseq PE300測序平臺(美國Illumina公司)；CBIO-UV5型紫外切膠臺(北京賽百奧科技有限公司)。

1.6 標(biāo)本采集

采集3組受試者新鮮糞便中間部分置于無菌采樣管中，迅速放入無菌冰盒2 h內(nèi)送至實驗室，稱取200 mg分裝于2.0 mL無菌離心管并放入-80 ℃冰箱保存。每例受試者1次采集2份樣品保存?zhèn)溆肹5，6]。

1.7 糞便菌群DNA的提取

按照DNA 提取試劑盒說明書提取樣本總DNA，利用 1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計對抽提的基因組 DNA 進(jìn)行濃度及純度檢測，篩選出優(yōu)質(zhì)樣本使用通用引物 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)與806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對樣本 16 S rRNA 的V3-V4 區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括 5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer (5 μM) 0.8 μL，Reverse Primer (5 μM) 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，模板基因 10 ng，并補足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，72 ℃穩(wěn)定10 min后4 ℃保存，每個樣本重復(fù)3次，并構(gòu)建PE 擴(kuò)增文庫，使用 Illumina Miseq PE 300 平臺進(jìn)行測序。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，再根據(jù)97%的相似度對優(yōu)化后的序列進(jìn)行操作分類單元(operationaltaxonomicunits，OTU)聚類、剔除嵌合體，比對Silva數(shù)據(jù)庫得到各樣本的物種分類與注釋信息。并基于美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com/)對樣本進(jìn)行多樣性、物種組成、組間差異顯著性檢驗及線性判別分析效應(yīng)值(Linear Discriminant Analysis Effect Size，LEfSe)多級物種差異分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 測序序列及稀釋性曲線分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化后共獲得2 219 796條有效序列，平均61 661條?；贠TU聚類結(jié)果的稀釋性曲線隨樣本序列數(shù)目增加趨于平坦，表明測序深度合理可以進(jìn)行下一步分析(圖1)。

注:一條稀釋性曲線代表一個樣本，其中紅色代表腸道濕熱證泄瀉組,藍(lán)色代表寒濕困脾證泄瀉組,綠色代表健康對照組圖1 3組樣本OUT水平Sobs稀釋性曲線圖

2.2 α多樣性分析

α多樣性分析是反映每組樣品內(nèi)的物種菌群豐富度和均勻性的一種分析方法，常見的評估指數(shù)有chao、ace、shannon 及 simpson，其中 chao 指數(shù)和ace指數(shù)常用于評估物種豐富度，指數(shù)越大豐富度越高；shannon 和 simpson指數(shù)常用來評估菌群多樣性和均勻度，shannon指數(shù)越高、simpson指數(shù)越低則說明菌群多樣性越高[7]。圖2示，腸道濕熱證泄瀉組菌群多樣性高于寒濕困脾證泄瀉組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但豐富度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明腸道濕熱證泄瀉組中某些菌的豐度變化較為突出。

注：*P<0.05, **P<0.01；圖a、b、c、d分別代表chao、ace、shannon 及 simpson指數(shù)，紅色代表腸道濕熱證泄瀉組,藍(lán)色代表寒濕困脾證泄瀉組，綠色代表健康對照組圖2 3組樣本α多樣性分析比較

2.3 Beta多樣性分析和分組分析

Beta多樣性分析和分組分析主要分析樣本間微生物群落組成的相似性，樣本距離越近則表示樣本的組成越相似。基于主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)與非度量多維尺度分析法(non-metric multidimensional scaling，NMDS)的Beta 多樣性分析及基于偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis PLS-DA)回歸模型的分組分析表明，X、Y軸兩坐標(biāo)系均不能將3組樣本完全分開，但3組樣本只有少部分混雜，且各組樣本組內(nèi)有明顯聚類，說明3組樣本間菌群結(jié)構(gòu)存在差異(圖3)。

注：圖a為OTU水平上基于PCoA分析法的Beta 多樣性分析，圖b為OTU水平上基于NMDS分析法的Beta 多樣性分析,圖c、d分別為門水平和OTU水平上基于PLS-DA分析法的分組分析，兩點距離的遠(yuǎn)近代表樣本組成的相似性程度，距離越近則樣本的組成越相似, 紅色代表腸道濕熱證泄瀉組,藍(lán)色代表寒濕困脾證泄瀉組,綠色代表健康對照組圖3 3組樣本Beta多樣性分析和分組分析比較

2.4 物種組成分析

基于70%的置信水平，與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，樣本共有16個菌門、26個菌綱、54個菌目、97個菌科、285個菌屬、526個菌種、907個OTU，以下主要從門、綱、目、屬這4個分類水平進(jìn)行分析。

2.4.1 門分類學(xué)水平 據(jù)圖4a可知，3組樣本的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)。其中厚壁菌門相對豐度最高，在腸道濕熱證泄瀉組、寒濕困脾證泄瀉組及健康對照組中占比分別為52.26%、67.06%、61.26%，其他各菌門在3組樣本中的豐度亦各不相同。放線菌門、變形菌門在腸道濕熱證泄瀉組豐度較高，厚壁菌門、柔膜菌門在寒濕困脾證泄瀉組中豐度較高，擬桿菌門在健康對照組中豐度較高，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4.2 綱分類學(xué)水平 據(jù)圖4b可知，3組樣本的優(yōu)勢菌綱均為梭菌(Clostridia)、擬桿菌(Bacteroidia)、丙型桿菌(Gammaproteobacyeria)、放線菌(Actinobacteria)、丹毒絲菌(Erysipelotrichia)、Negativicutes。除梭菌外，其他優(yōu)勢菌綱在3組樣本中豐度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，丙型桿菌、放線菌、丹毒絲菌在腸道濕熱證泄瀉組豐度較高，Negativicutes在寒濕困脾證泄瀉組豐度較高，擬桿菌在健康對照組中豐度較高(P<0.05)。

2.4.3 目分類學(xué)水平 據(jù)圖4c可知，3組樣本的優(yōu)勢菌目均為梭菌(Clostridiales)、擬桿菌(Bacteroidales)、腸桿菌(Enterobacteriales)、新月形單胞菌(Selenomonadales)、雙歧桿菌(Bifidobacteriales)、絨毛菌(Coriobacteriales)、丹毒絲菌(Erysipelotrichales)、柔膜菌(Mollicutes_RF39)，除梭菌、絨毛菌外，其他優(yōu)勢菌目在3組樣本中均存在顯著差異。腸桿菌、雙歧桿菌、丹毒絲菌在腸道濕熱證泄瀉組豐度較高，新月形單胞菌、柔膜菌在寒濕困脾證泄瀉組豐度升高，擬桿菌在健康對照組豐度較高(P<0.05)。

注：圖a、b、c、d分別代表門、綱、目、屬分類水平, 紅色代表腸道濕熱證泄瀉組,藍(lán)色代表寒濕困脾證泄瀉組,綠色代表健康對照組： *P<0.05, **P<0.01，***P<0.001圖4 3組樣本物種差異分析比較

2.4.4 屬分類學(xué)水平 圖4d可知，擬桿菌屬(Bacteroides)，埃希氏志賀桿菌屬(Escherichia-Shigella)，糞桿菌屬(Faecalibacterium)，布勞特氏菌屬(Blautia)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，普氏菌屬(Prevotella_9)，小桿菌屬(Dialister)，柯林斯氏菌屬Collinsella)，瘤胃球菌屬(Ruminococcus_2、[Ruminococcus]_torques_group、Ruminococcaceae_UCG-002)，優(yōu)桿菌屬([Eubacterium]_hallii_group), [Eubacterium]_coprostanoligenes_group，Agathobacter，Megamonas等15種菌屬在3組樣本中均存在明顯聚集，對排名前10的菌屬進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，腸道濕熱證泄瀉組中埃希氏志賀桿菌屬、布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬豐度較高，寒濕困脾證泄瀉組中瘤胃球菌屬豐度較高，健康對照組中擬桿菌屬、糞桿菌屬豐度較高(P<0.05)。

2.5 LEfSe多級物種差異判別分析

LEfSe 多級物種差異判別分析能從各分類水平顯示差異顯著物種。圖5a示，腸道濕熱證泄瀉組主要富集變形菌門、放線菌門、丙型桿菌綱、放線菌綱、腸桿菌目、毛螺菌科、埃希氏志賀桿菌、雙歧桿菌(目、科、屬)及丹毒絲菌(綱、目、科、屬)，寒濕困脾證泄瀉組主要富集Negativicutes綱、新月形單胞菌目、瘤胃球菌屬，健康對照組主要富集擬桿菌(門、綱、目、科)，與上述物種差異分析結(jié)果基本一致。而由物種層級樹圖(圖5b)可知，腸道濕熱證泄瀉組富集菌種主要來源于變形菌門下的埃希氏志賀桿菌屬、放線菌門下的雙歧桿菌屬及厚壁菌門下的毛螺菌科及丹毒絲菌屬，寒濕困脾證泄瀉組富集的菌種主要來源于厚壁菌門下的Negativicutes綱及瘤胃球菌屬，健康對照組富集的菌種主要來源于擬桿菌門下的擬桿菌屬。

注：圖a為線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)柱狀圖，LDA分值越大代表該物種豐度對差異效果影響越大，圖b為Lefse多級物種層級樹圖，圓圈從內(nèi)到外依次代表門、綱、目、科、屬水平，圓點代表各分類水平的物種，其中差異顯著物種隨組別進(jìn)行著色，紅色代表腸道濕熱證泄瀉組,藍(lán)色代表寒濕困脾證泄瀉組,綠色代表健康對照組圖5 3組樣本 Lefse多級物種差異判別分析

3 討論

本研究比較了腸道濕熱證和寒濕困脾證泄瀉患者及健康人群的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)上述3組樣本腸道菌群確實存在差異，他們雖在各分類學(xué)水平上均具有相同的優(yōu)勢菌，但各優(yōu)勢菌在不同樣本中的豐度差異明顯。結(jié)合物種層級樹圖可知,該差異主要來源于菌屬或菌科,即某一菌屬或菌科的差異是導(dǎo)致其相應(yīng)門綱目水平出現(xiàn)差異的原因。本研究中,腸道濕熱證泄瀉患者顯著富集菌種來源于變形菌門下的埃希氏志賀桿菌屬、放線菌門下的雙歧桿菌屬及厚壁菌門下的毛螺菌科和丹毒絲菌屬，寒濕困脾證泄瀉患者顯著富集菌種來源于厚壁菌門下的Negativicutes綱及瘤胃球菌屬，而健康對照組顯著富集菌種為擬桿菌門下的擬桿菌屬。

埃希氏志賀桿菌屬歸屬于變形菌門丙型桿菌綱腸桿菌(科、目)，是常見的食源性致病菌，可引起不同程度的泄瀉甚至溶血尿毒癥綜合征[8]；雙歧桿菌屬歸屬于放線菌(門、綱)下的雙歧桿菌(科、目)，具有降解碳水化合物為機(jī)體供能和減少炎癥并修復(fù)受損腸黏膜的功效；而丹毒絲菌屬歸屬于厚壁菌門下丹毒絲菌(綱、目、科)，是一種人畜共患病的病原菌。感染該病原菌后在組織病理水平上可觀察到多組織器官的毛細(xì)血管和微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變性，中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤及微血栓的形成[9-11]。可見，腸道濕熱證泄瀉患者的特征性表現(xiàn)是與炎癥相關(guān)的菌群增多，這與既往研究中濕熱證與炎癥相關(guān)結(jié)果相符[12，13]。值得注意的是，厚壁菌門梭菌(綱、目)下的毛螺菌科在腸道濕熱證組亦顯著富集，包括毛螺菌屬、布勞特氏菌屬等，目前研究認(rèn)為該菌科主要與代謝紊亂相關(guān)[14]，其可促進(jìn)I型糖尿病的發(fā)生[15]，且與肥胖癥呈正相關(guān)[16]，這似與腸道濕熱證主要表現(xiàn)為炎性反應(yīng)不符。其實不然，中醫(yī)認(rèn)為肥甘厚膩多生濕熱，通過高糖、高脂飲食可制備濕熱證模型小鼠[17]，臨床上糖尿病、非酒精性脂肪肝、代謝紊亂綜合征患者中濕熱證型為常見證型?？梢?，濕熱證在一定程度上與機(jī)體的糖、脂代謝紊亂相關(guān)，而腸道菌群可能在中間起到橋梁作用。這一點在臨床報道中尚不多見，對其進(jìn)行深入研究，或有利于完善濕熱證的客觀化研究和為代謝性疾病的防治研究帶來新契機(jī)。

寒濕均為陰邪易傷陽氣，陽主升主動，可協(xié)助機(jī)體運化水谷精微以維持人體正常生理機(jī)能，如陽氣被遏，運化功能下降，可致機(jī)體產(chǎn)能不足，出現(xiàn)頭暈、畏寒、乏力等類似西醫(yī)低血糖的表現(xiàn)。同時，中醫(yī)認(rèn)為脾胃所運化的水谷精微是維持人體機(jī)能的最基本物質(zhì)，這與西醫(yī)血糖的功能相似。且有研究表明，陽虛、寒凝痰濁證患者血糖水平明顯低于其他證型患者[18]，可見寒濕困脾、損傷脾陽、致脾運失司，在一定程度上也會影響機(jī)體的血糖水平。瘤胃球菌屬歸屬于厚壁菌門梭菌(綱、目)下的瘤胃球菌科，是胃腸道中分解纖維素和發(fā)酵抗性淀粉的主要菌屬，其豐度和血糖值呈負(fù)相關(guān)，在糖尿病患者中豐度顯著降低[19]。而其在本研究的寒濕困脾證泄瀉患者中豐度明顯升高，說明該證型患者確實存在血糖水平下降表現(xiàn)，可能與寒濕對脾陽的損傷有關(guān)。Negativicutes綱是厚壁菌門的一種，該菌綱在多種疾病或與疾病相關(guān)的不良嗜好人群中豐度顯著升高，如克羅恩病術(shù)后早期內(nèi)鏡復(fù)發(fā)患者[20]、非小細(xì)胞肺癌患者[21]及長期吸煙[22]人群，且與肥胖呈正相關(guān)[23，24]。因此，Negativicutes綱可能是致病菌或條件致病菌，與泄瀉等病癥的產(chǎn)生相關(guān)且可影響機(jī)體的代謝功能?？梢娏鑫盖蚓鷮俸蚇egativicutes綱可能是寒濕困脾證泄瀉患者的特征性菌群，對該菌的生理、生化、代謝途徑等進(jìn)一步研究，或有利于從客觀和微觀上闡釋寒濕困脾證的發(fā)病機(jī)理。

擬桿菌屬歸屬于擬桿菌(門、綱、目、科)，是腸道的優(yōu)勢菌之一，對宿主健康起著重要作用，如參與機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)代謝，抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，影響宿主的免疫系統(tǒng)等[25]。按照中醫(yī)的正邪理論，該菌對機(jī)體的營養(yǎng)、免疫、防御作用屬于中醫(yī)學(xué)“正氣”范疇。寒濕均為陰邪易傷陽氣，導(dǎo)致機(jī)體陽氣(正氣)虧損，運化、防衛(wèi)功能下降。故機(jī)體受寒、濕之邪侵襲，可出現(xiàn)正氣受損、擬桿菌豐度下降的表現(xiàn)，與本實驗結(jié)果中擬桿菌屬在健康人群中顯著富集，而在腸道濕熱證及寒濕困脾證泄瀉患者中豐度下降結(jié)果相符。

當(dāng)然，該研究樣本均來自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,具有明顯地域局限性；同時為確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性,對入選樣本進(jìn)行了嚴(yán)格篩選,導(dǎo)致樣本量偏小且性別比例存在差異。研究表明，腸道菌群可因年齡、性別、地域、生活習(xí)慣等不同而表現(xiàn)出差異[26]，因此上述不足可能會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,后續(xù)應(yīng)加大樣本量，減少組間差異并進(jìn)行多中心臨床研究進(jìn)行驗證。

綜上所述，腸道濕熱證、寒濕困脾證泄瀉患者與健康人群在腸道菌群上存在明顯差異，其中變形菌門下的埃希氏志賀桿菌屬、放線菌門下的雙歧桿菌屬及厚壁菌門下的毛螺菌科及丹毒絲菌屬顯著升高，可能是腸道濕熱證泄瀉患者的特征性表現(xiàn)，而厚壁菌門下的Negativicutes綱及瘤胃球菌屬顯著升高，可能是寒濕困脾證泄瀉患者的特征性表現(xiàn)。值得注意的是，濕熱證患者可能存在代謝紊亂的表現(xiàn)，腸菌中毛螺菌科及其代謝物質(zhì)可能起到中間作用，在治療過程中應(yīng)注意其豐度變化和代謝性疾病的防治，同時上述兩證型患者均表現(xiàn)為擬桿菌屬豐度下降，即腸道益生菌數(shù)量下降，說明該證型患者可能存在正氣虧損的表現(xiàn)，在治療過程中應(yīng)該注意補充益生菌或扶助正氣。