李博，楊童，劉錦，蔣鵬，周倩

(1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣州 510006； 2.暨南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510632； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，成都 610052)

血栓性疾病(如心肌梗死、腦卒中、肺栓塞)的前期癥狀隱匿、治療窗口期短，致死率高居全球疾病的首位[1-4]。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加快，血栓性疾病發(fā)病率逐年上升，給社會(huì)及患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。血栓形成的主要生理功能是預(yù)防血管損傷引起的出血，同時(shí)加速止血；在后期愈合階段，血栓斑塊能在內(nèi)源性組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)的作用下被逐步溶解，實(shí)現(xiàn)血管再通暢[5]。在病理狀態(tài)下，血栓始于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊剝離等偶發(fā)事件，伴隨著剝離斑塊的隨機(jī)附著，新發(fā)微血栓形成并迅速增長(zhǎng)，但往往在機(jī)體調(diào)控溶栓之前已導(dǎo)致毀滅性臨床事件[6-7]。因此，早期診斷和有效溶栓是提高血栓性疾病治療效果的關(guān)鍵。

目前，影像學(xué)技術(shù)僅能識(shí)別晚期血栓而無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)急性新發(fā)血栓，嚴(yán)重制約了血栓性疾病治療窗口期；此外，臨床溶栓主要依賴肝素、tPA、重組tPA、尿激酶型纖溶酶原激活物和鏈激酶等，這些蛋白質(zhì)類藥物在體內(nèi)具有半衰期短、免疫原性高、易失活等特點(diǎn)，且采用全身給藥，易誘發(fā)腦出血等并發(fā)癥，危及生命[8]，故嚴(yán)重困擾著血栓性疾病的臨床診斷與治療。近年來(lái)，納米技術(shù)在血栓性疾病早期診療方面取得了令人矚目的成果?，F(xiàn)就納米材料在血栓診斷及溶栓治療方面的最新研究進(jìn)展，及其現(xiàn)存問(wèn)題和臨床轉(zhuǎn)化前景進(jìn)行綜述。

1 血栓分子機(jī)制

血栓性疾病主要由血管內(nèi)血栓阻塞血液流動(dòng)而導(dǎo)致的局部缺血引起。依據(jù)血栓形成的部位分為動(dòng)脈血栓和靜脈血栓，動(dòng)脈血栓主要由大量血小板和少量纖維酶原蛋白及紅細(xì)胞在高剪切力血流下形成；靜脈血栓則由少量血小板、纖維酶原蛋白和大量紅細(xì)胞在低剪切力血流下形成。

前期研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)/靜脈血栓形成及演進(jìn)均涉及3個(gè)主要階段：①血小板黏附在血管內(nèi)壁病灶區(qū)域(內(nèi)壁破損點(diǎn)、炎癥部位及膠原蛋白暴露點(diǎn)等)并被激活，其表面高表達(dá)P-選擇素等受體分子；②活化血小板同時(shí)改變其表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，又稱整合素αⅡbβ3，提高其與纖維蛋白原的結(jié)合，進(jìn)而快速形成聚集塊；③凝血酶原在凝血瀑布級(jí)聯(lián)放大作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，進(jìn)一步將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，后者交聯(lián)組裝形成不溶性的血栓斑塊[9-12]。上述各階段所涉及的關(guān)鍵分子使設(shè)計(jì)出血栓特異性靶向結(jié)合體系成為可能。近20年來(lái)，納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展為多種疾病的精準(zhǔn)診斷及藥物靶向遞送研究帶來(lái)了希望，其在血栓診斷與溶栓治療方面也取得了重要進(jìn)展。

2 納米材料用于血栓診斷

大多數(shù)血栓性疾病患者在發(fā)病前幾乎無(wú)明顯的臨床癥狀，早期準(zhǔn)確診斷血栓性疾病能有效延長(zhǎng)治療窗口期，為及時(shí)采取有效溶栓策略創(chuàng)造條件，從而避免后期發(fā)生危及生命的嚴(yán)重臨床事件。然而，現(xiàn)階段的臨床影像技術(shù)仍無(wú)法對(duì)早期血栓進(jìn)行診斷。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，通過(guò)開發(fā)靶向血栓標(biāo)志物提高病灶區(qū)域造影信號(hào)的分子影像探針的研究不斷展開。

2.1磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI) 磁性納米體系因其獨(dú)有特性而被作為MRI造影對(duì)比劑。前期研究證實(shí)，褐藻糖膠能與活化血小板表面的P-選擇素特異性結(jié)合[13]。將褐藻糖膠與超小型順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)納米顆粒(nanoparticles,NPs)偶聯(lián)，可獲得彈性蛋白酶誘導(dǎo)大鼠腎下主動(dòng)脈血栓模型的血栓病灶MRI[14]。Liu等[15]將能與血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa特異性結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)肽(cyclic arginine-glycine-aspartate，cRGD)偶聯(lián)到聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]修飾過(guò)的四氧化三鐵(Fe3O4)-NPs上，實(shí)現(xiàn)大鼠腹主動(dòng)脈血栓造影成像。Ta等[16]將可剝離的釓(Gd)層用能被凝血酶特異性裂解的短段(ThrPep)偶聯(lián)到氧化鐵納米表面，并進(jìn)一步用纖維蛋白結(jié)合肽修飾納米結(jié)構(gòu)，得到血栓MRI多功能納米傳感器；該體系能夠依據(jù)血栓形成時(shí)間及病灶凝血酶含量而特異性釋放Gd，從而呈現(xiàn)MRI中T1、T2造影信號(hào)的切換，實(shí)現(xiàn)血栓類型的準(zhǔn)確診斷。Li等[17]通過(guò)“點(diǎn)擊反應(yīng)”將能與血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa特異性結(jié)合的單鏈抗體偶聯(lián)到表面修飾有化學(xué)熒光基團(tuán)的NaGdF4-NPs上，證實(shí)該結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的生物相容性，能快速靶向富集到活化血小板，實(shí)現(xiàn)血栓MRI和熒光雙模成像。

2.2CT 臨床上，CT難以區(qū)分血栓結(jié)構(gòu)及循環(huán)系統(tǒng)中的血液組分，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷。一些含有高Z元素的組分，包括金(Au)、鉍(Bi)、鋯(Zr)、碘(I)等具有很強(qiáng)的X射線吸收能力，可作為CT成像造影劑。乙二醇?xì)ぞ厶切揎椀腁u(GC-Au)NPs可聚集在血栓部位增強(qiáng)病灶CT造影信號(hào)[18]。纖維蛋白結(jié)合肽進(jìn)一步修飾GC-AuNPs表面得到功能化fib-GC-AuNPs，其能在小鼠頸動(dòng)脈血栓及腦卒中模型中快速靶向并富集到病灶部位，顯著增強(qiáng)血栓CT造影信號(hào)，實(shí)現(xiàn)血栓的快速診斷[19]。Kwon等[20]設(shè)計(jì)了凝血酶響應(yīng)的近紅外熒光和CT雙模成像分子探針(TAP-SiO2@AuNPs)，其在血栓病灶富集后能特異性地提供近紅外熒光/CT雙重造影信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)早期血栓精準(zhǔn)診斷。Koudrina等[21]將能夠特異性靶向纖維蛋白原的適配子分別與I-NPs及Au-NPs偶聯(lián)得到I-FA和FA-AuNPs兩種靶向分子探針，兩者均可在血栓處富集并增強(qiáng)病灶CT成像效果；而FA-AuNPs主要富集在血栓表面，I-FA能夠滲透進(jìn)入血栓內(nèi)部，從而提供整個(gè)血栓區(qū)域的CT造影信號(hào)，這可能是由于不同粒徑及形貌特征I-NPs及Au-NPs對(duì)NPs擴(kuò)散性的影響所致。

2.3超聲及光聲成像 超聲因快速(實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè))、安全(非侵襲、無(wú)放射)、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)被視為臨床疾病診斷的首選輔助檢查。但血管內(nèi)循環(huán)組分，如紅細(xì)胞、血小板等具有較高的超聲背景信號(hào)，極大地限制了血栓病灶的準(zhǔn)確診斷。前期研究發(fā)現(xiàn)，微氣泡能顯著增強(qiáng)超聲造影信號(hào)，可將能與血栓特異性靶向結(jié)合的分子修飾到微氣泡表面，有望克服血流剪切力，使微氣泡富集在血栓部位，從而提高病灶區(qū)域的超聲造影信號(hào)[22]。Li等[23]將聚合物微泡與褐藻糖膠偶聯(lián)得到褐藻糖膠微泡，證實(shí)其能在大鼠下腔靜脈血栓靶向富集并增強(qiáng)病灶區(qū)域的超聲造影信號(hào)。Wang等[24]將能與活化血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa結(jié)合的單鏈抗體與微泡偶聯(lián)，獲得靶向微泡，并證實(shí)靶向微泡可實(shí)現(xiàn)小鼠頸動(dòng)脈血栓的快速成像，并能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)血栓體積、評(píng)價(jià)溶栓治療效果。

光聲成像是一種新興的生物醫(yī)學(xué)成像方式，主要通過(guò)檢測(cè)組織或造影劑吸收特定激光后產(chǎn)生的超聲信號(hào)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)特定區(qū)域的成像技術(shù)。Cui等[25]利用兩性分子二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亞胺(perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic diimide，PDI)自組裝成NPs，并用cRGD進(jìn)一步修飾得到具有較好光聲造影性能的功能化分子探針cRGD-PDI；在小鼠模型中，cRGD-PDI能夠依據(jù)血栓形成時(shí)間提供不同光聲信號(hào)，實(shí)現(xiàn)新老血栓的區(qū)別監(jiān)測(cè)。Jung等[26]開發(fā)了過(guò)氧化氫觸發(fā)的T-FBM(thrombus-specific the-ranostic)-NPs，其可被血栓微環(huán)境獨(dú)有的過(guò)氧化氫激活生成CO2，進(jìn)而放大病灶區(qū)域光聲信號(hào)，實(shí)現(xiàn)血栓特異性成像。Zhang等[27]將Fe3O4-NPs、墨汁、PLGA共同封裝入聚多巴胺納米殼中，并在其表面共修飾cRGD和P-選擇素特異性結(jié)合肽沒(méi)食子酸修飾的EWVDV，獲得雙靶向功能納米體系，結(jié)果證實(shí)，雙靶向設(shè)計(jì)顯著提高了高血液剪切力下納米體系靶向結(jié)合血栓的能力，并能提供病灶區(qū)域光聲成像/MRI造影信號(hào)。

2.4光學(xué)/熒光成像 隨著光學(xué)納米探針的飛速發(fā)展，紫外線、可見(jiàn)光、紅外線、熒光等光學(xué)設(shè)備在血栓診斷領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注。Gerstenhaber等[28]設(shè)計(jì)了一系列熒光納米金剛石顆粒(fluorescent nanodiamond particles，F(xiàn)-NDP)，隨后與Bit(Bitistatin)偶聯(lián)形成功能化的近紅外探針F-NDP-Bit，其能與活化血小板上的纖維蛋白原受體特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)血栓的紅外成像。此外，Bonnard等[29]以介孔二氧化硅為模板，利用賴氨酸(K)和聚谷氨酸(E)將具有高度親水性的脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和絲氨酸(S)交聯(lián)構(gòu)成具有高度生物安全性的納米結(jié)構(gòu)PASKE，其在循環(huán)系統(tǒng)中具有較長(zhǎng)滯留時(shí)間，且極易被溶酶體降解；與單鏈抗體和熒光染料偶聯(lián)的PASKE能在小鼠頸動(dòng)脈血栓處靶向富集并呈現(xiàn)病灶熒光信號(hào)。盡管分子探針的發(fā)展給血栓的光學(xué)/熒光成像帶來(lái)新的機(jī)遇，但外源光線組織穿透性差等因素限制了其現(xiàn)階段的應(yīng)用，目前其僅用于檢測(cè)近表層血栓，未來(lái)近紅外二區(qū)成像的分子探針的開發(fā)將有望實(shí)現(xiàn)深層血栓的精準(zhǔn)診斷。

3 納米材料用于溶栓治療

目前，納米載體在延長(zhǎng)藥物循環(huán)時(shí)間及實(shí)現(xiàn)體內(nèi)病灶靶向富集方面已取得令人矚目的成績(jī)。與腫瘤等疾病的遞送系統(tǒng)相比，靶向血栓藥物的遞送路徑更直接，遞送效率更高[30-32]。但體內(nèi)血栓病灶往往處于血流高速剪切力環(huán)境下，這對(duì)納米體系的靶向結(jié)合能力提出了更高的要求[33]。

3.1脂質(zhì)體納米材料 脂質(zhì)體納米的生物相容性較高，被認(rèn)為是最具前景的納米藥物遞送系統(tǒng)之一，目前一些產(chǎn)品已被批準(zhǔn)臨床使用。Zhang等[34]將cRGD與脂質(zhì)體NPs偶聯(lián)構(gòu)建了血栓靶向遞送系統(tǒng)，其負(fù)載尿激酶能夠提升4倍左右的溶栓效果，且出血風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。Huang等[35]證實(shí)，cRGD修飾的聚乙二醇功能化脂質(zhì)體負(fù)載重組tPA后能與活化血小板結(jié)合，并在血栓區(qū)域富集，隨后通過(guò)膜融合實(shí)現(xiàn)重組tPA在血栓部位的加速釋放，進(jìn)而快速溶解血栓。Rassam等[36]以固體脂質(zhì)體為載體，通過(guò)詳細(xì)研究不同反應(yīng)配比下的重組鏈激酶負(fù)載率獲得實(shí)現(xiàn)最大負(fù)載率的條件，為工業(yè)化制備脂質(zhì)體溶栓藥物奠定了基礎(chǔ)。盡管脂質(zhì)納米載體在溶栓領(lǐng)域取得了一定成績(jī)，但其臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

3.2聚合物納米材料 目前，以多糖(透明質(zhì)酸、葡聚糖、殼聚糖等)天然聚合物和聚乙烯、氰基丙烯酸異丁酯、PLGA、聚乙二醇、聚吡咯(poly pyrrole，PPY)等合成聚合物為基礎(chǔ)的納米遞送系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注。上述合成聚合物NPs具有制備簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)均一、重現(xiàn)性好、便于后期功能化修飾等優(yōu)點(diǎn)。Sivaraman等[37]以十二烷基二甲基溴化銨或聚乙烯醇為表面活性劑構(gòu)建了可負(fù)載10 μg重組tPA的PLGA納米結(jié)構(gòu)，證實(shí)其可通過(guò)緩釋重組tPA抑制動(dòng)脈瘤的進(jìn)一步增生。Juenet等[38]構(gòu)建了由氰基丙烯酸異丁酯交聯(lián)褐藻糖膠及葡聚糖形成的納米結(jié)構(gòu)，負(fù)載重組tPA后，在靜/動(dòng)脈剪切力下，其通過(guò)結(jié)合P-選擇素富集于血栓病灶，達(dá)到快速溶栓的目的。Colasuonno等[39]將PLGA和聚乙二醇聚合構(gòu)建了仿紅細(xì)胞的盤狀聚合物納米結(jié)構(gòu)(discoidal polymeric nanoconstructs，DPNs)，并將tPA分子與DPNs表面的羧基共價(jià)連接得到tPA-DPNs，仿紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)tPA-DPNs使tPA分子快速富集到血栓部位，實(shí)現(xiàn)高效溶栓。Lu等[40]將能與P-選擇素結(jié)合的肝素及酸敏感的乙二醇?xì)ぞ厶切揎椀絇PY-NPs上得到具有雙靶向功能的GCS-PPY-H NPs，其可靶向酸性/P-選擇素高表達(dá)的血栓病灶區(qū)域，并通過(guò)近紅外光輻射熱療啟動(dòng)病變部位特異性溶栓，達(dá)到光熱溶栓效果。

3.3無(wú)機(jī)納米材料 無(wú)機(jī)納米材料因其獨(dú)特的磁、熱等特質(zhì)，在多種疾病的診療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。現(xiàn)階段，無(wú)機(jī)材料在血栓治療領(lǐng)域的研究主要集中在溶栓藥物的體外控釋方面。Hu等[41]設(shè)計(jì)了載有tPA的多孔磁性氧化鐵微棒，其可在外部磁場(chǎng)引導(dǎo)下靶向腦部血栓，隨后tPA在栓塞部位緩慢釋放；同時(shí)，施加外部旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)可使載有tPA的多孔磁性氧化鐵微棒實(shí)現(xiàn)微擾動(dòng)，機(jī)械破壞血栓結(jié)構(gòu)，增加tPA滲透性，從而實(shí)現(xiàn)快速溶栓。Wang等[42]將尿激酶通過(guò)肉豆蔻醇固定到含金介孔二氧化硅納米球上，其富集在血栓病灶后，在近紅外光輻照下，金納米吸收光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，使肉豆蔻醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐合啵M(jìn)而達(dá)到緩釋尿激酶的目的，結(jié)果顯示，37 ℃時(shí)尿激酶釋放效率僅為10.5%，而39 ℃時(shí)尿激酶釋放效率高達(dá)89.5%。Fu等[43]構(gòu)建了含硫化銅的介孔二氧化硅-NPs，其擁有出色的光熱轉(zhuǎn)換效率和尿激酶型纖溶酶原激活物負(fù)載率；經(jīng)近紅外光輻照觸發(fā)硫化銅光熱轉(zhuǎn)換后，尿激酶型纖溶酶原激活物的釋放顯著增強(qiáng)，體內(nèi)模型驗(yàn)證結(jié)果顯示，含硫化銅的介孔二氧化硅-NPs在近紅外光輻照下的溶栓效果較好。Deng等[44]將血栓靶向肽CREKA(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala)修飾到載有一氧化氮供體分子BNN6的聚多巴胺空心納米表面得到功能NPs——B@P@C，其在血栓部位富集后，聚多巴胺在近紅外光輻照下將能量轉(zhuǎn)移至BNN6，進(jìn)而觸發(fā)一氧化氮?dú)馀葆尫牛_(dá)到機(jī)械溶栓效果，同時(shí)一氧化氮還能防止血小板再凝集，并可進(jìn)一步擴(kuò)張血管，避免血栓復(fù)發(fā)；B@P@C在一定程度上實(shí)現(xiàn)了血栓非藥物治療，避免溶栓藥物引發(fā)的副作用，為臨床溶栓治療提供了全新策略。

3.4仿生納米材料 傳統(tǒng)納米材料的臨床應(yīng)用面臨生物相容性、免疫原性、器官毒性等問(wèn)題。受生物結(jié)構(gòu)啟發(fā)的納米仿生技術(shù)不僅可有效偽裝NPs，從而躲避免疫清除并降低其機(jī)體毒性，同時(shí)也能實(shí)現(xiàn)部分原有生物結(jié)構(gòu)的功能。作為一種新興納米遞送體系，仿生納米材料的研究具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。血栓診療領(lǐng)域的仿生納米主要通過(guò)模擬血栓主要成分(紅細(xì)胞和血小板)靶向血栓。Vankayala等[45]將吲哚菁綠及近紅外顯像劑封裝到紅細(xì)胞膜納米結(jié)構(gòu)中，并通過(guò)胺醛將重組tPA偶聯(lián)到該納米結(jié)構(gòu)上，形成血栓仿生納米診療體系，其可用于溶栓治療，并可通過(guò)熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控血栓變化。Xu等[46]將血小板膜剝離后的偽裝PLGA-NPs與重組tPA偶聯(lián)得到仿血小板的納米結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在體內(nèi)循環(huán)中具有與血小板相似的生理行為，其循環(huán)時(shí)間較未修飾PLGA-NPs明顯延長(zhǎng)，且具有類似于血栓部位血小板主動(dòng)富集的生理行為，其治療的肺栓塞小鼠的血栓面積明顯低于相同劑量重組tPA治療小鼠，溶栓效果明顯提高。為應(yīng)對(duì)腦部血栓阻塞和隨后局部缺血誘發(fā)的缺血性腦卒中，研究人員設(shè)計(jì)合成了人造“納米血小板”，通過(guò)凝血酶響應(yīng)肽將Tat與重組tPA偶聯(lián)，隨后將其與神經(jīng)保護(hù)劑(ZL006e)共負(fù)載于乙縮醛葡聚糖聚合NPs上，再用血小板膜包被納米結(jié)構(gòu)得到順序靶向釋放的功能納米平臺(tái)tP-NP-重組tPA/ZL006e；其通過(guò)類血小板生理行為富集到腦血栓部位后，在凝血酶作用下重組tPA與Tat分離執(zhí)行溶栓功能，暴露的Tat可促進(jìn)NPs穿過(guò)血腦屏障并進(jìn)入缺血腦組織，從而實(shí)現(xiàn)ZL006e的定點(diǎn)遞送與釋放[47]。與其他納米結(jié)構(gòu)相比，仿生遞送體系的生物安全性更高、體內(nèi)滯留時(shí)間更長(zhǎng)，這為納米溶栓載體設(shè)計(jì)提供了新的方向。

4 小 結(jié)

現(xiàn)階段，納米體系在血栓診療領(lǐng)域的研究取得了一些進(jìn)展，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍面臨一系列問(wèn)題。體內(nèi)血流的高速剪切力仍是納米體系在血栓病灶實(shí)現(xiàn)高效靶向富集的最大障礙，且體內(nèi)血流的高速剪切力還直接影響納米材料在血栓部位的滯留時(shí)間，進(jìn)而影響溶栓效果；此外，納米載體本身的生物相容性、器官累積毒性及誘發(fā)的免疫反應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究；納米載體上溶栓藥物泄露所誘發(fā)的副作用也應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注；新近發(fā)展的仿生納米技術(shù)雖然克服了一些常規(guī)納米體系的缺陷，但其重現(xiàn)性以及放大生產(chǎn)的可能性尚不明確?？傊?，納米功能體系為血栓類疾病的早期精準(zhǔn)診斷與治療開辟了新的方向，未來(lái)可能為疾病治療帶來(lái)更多選擇和希望。