張勁遠，何磊，劉遠成，李永海，張承岳，徐烈娟，李瑞

(安徽醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 合肥市第一人民醫(yī)院 a.普外科，b.中醫(yī)肛腸科，c.胃腸外科，合肥 230061)

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，全球每年結直腸癌新發(fā)病例超過50萬[1]。隨著我國人民生活水平的不斷提高、飲食結構的改變，結直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，已成為近十幾年來發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，且尤以經(jīng)濟較發(fā)達地區(qū)發(fā)病率較高[2]。隨著生物分子學研究的不斷發(fā)展，研究顯示，結直腸癌的發(fā)生與多個癌基因的激活以及抑癌基因的失活密切相關[3]。結直腸上皮黏膜腺體以及間質(zhì)成分細胞的增殖調(diào)控異常在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]，如周期蛋白E，其作為細胞正向周期調(diào)節(jié)因子，可通過促進中心體的過度增殖、干擾有絲分裂以及染色體的形成等促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。生存素作為抑制凋亡基因家族成員之一，可抑制細胞凋亡而促使腫瘤生長[6]。研究表明，結直腸癌中生存素的表達與組織分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移及Dukes分期密切相關[7]。本研究主要從生物學角度，通過免疫組織化學方法檢測周期蛋白E和生存素在結直腸癌組織中的表達，探討兩者與結直腸癌生物學病理因素的相關性，以期為結直腸癌的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年9月在安徽醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院進行手術切除治療的60例結直腸癌患者的結直腸癌組織。其中男32例、女28例，年齡36～90歲，平均(58±6)歲?；颊咴谌忧熬唇邮芊暖熀突?，所有組織的選取位置距離癌變部位10 cm以上。依據(jù)《消化系統(tǒng)腫瘤病理學和遺傳學》[8]作為參考，組織分化：低分化12例、中分化17例、高分化31例；Dukes分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期30例、Ⅲ期24例、Ⅳ期3例；未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者33例，發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者27例；腫瘤浸潤位置：黏膜層6例、肌層6例、漿膜層48例。選取同期進行結直腸外科手術的30例非結直腸癌患者的正常結直腸組織作為對照，其中男17例、女13例，年齡38～75歲，平均(58±5)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法 使用10%的中性甲醛固定標本，對其包埋切片，連續(xù)切片的厚度為3～4 μm，采用Envision兩步法進行免疫組織化學染色。選用0.01 mol/L、pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗切片，清洗3次，每次3 min；將選取的組織抗原放置微波爐內(nèi)進行加熱修復。每張切片均加入1滴過氧化酶阻斷溶液，在室溫條件下進行孵育，時間為10 min。PBS沖洗3次，去除PBS，在切片下滴入1滴正常的非免疫動物血清，在室溫條件下孵育，時間為10 min。將血清去除，在切片上滴入鼠抗人周期蛋白E抗體，室溫條件下孵育60 min，再使用PBS清洗3次，每次3 min。在切片上滴入生存素單克隆抗體，室溫下孵育3 min，PBS沖洗。每張切片上加入2滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色劑，將其放置顯微鏡下觀察3～10 min。使用自來水將其沖洗，蘇木精進行復染，使用自來水或PBS沖洗，對于二氨基聯(lián)苯胺顯色的切片，每張切片需要使用梯度乙醇脫水干燥，使用中性樹膠進行封固。

1.3免疫組織化學染色結果判斷標準 腫瘤細胞周期蛋白E和生存素在免疫組織化學陽性反應中呈棕黃色顆粒，周期蛋白E定位于細胞核，生存素主要定位于細胞質(zhì)，少數(shù)在細胞核，陽性定義為著色細胞≥10%。

免疫組織化學染色結果的判斷標準：采用雙盲試驗法，分別由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行閱片。結果判斷參照Kawasaki等[9]制訂的半定量積分標準：顯微鏡下觀察，若組織細胞出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒，則為陽性細胞。選取10個高倍視野組織，按照組織中陽性細胞百分比計分：若陽性細胞的細胞數(shù)<5%，記為0分；5%≤陽性細胞數(shù)<25%，記為1分；25%≤陽性細胞數(shù)<50%，記為2分；50%≤陽性細胞數(shù)<75%，記為3分；陽性細胞數(shù)≥75%，記為4分。按照著色程度計分：組織染色呈現(xiàn)淡黃色，記為1分；組織染色呈現(xiàn)黃色，記為2分；組織染色呈現(xiàn)棕黃色，記為3分。將兩個計分結果相乘，即可得出陽性強度：0分為陰性、1～4分為弱陽性、5～8分為中度陽性、9～12分為強陽性。

2 結 果

2.1正常結直腸組織與結直腸癌組織中周期蛋白E、生存素的表達情況 結直腸癌組織中，周期蛋白E陽性表達率為75.0%(45/60)，其中弱陽性18例、中度陽性15例、強陽性12例；生存素陽性表達率為50.0%(30/60)，其中弱陽性11例、中度陽性10例、強陽性9例；正常結腸組織中，周期蛋白E陽性表達率為3.3%(1/30)，生存素陽性表達0例。結直腸癌組織組中周期蛋白E和生存素的陽性表達率高于正常結直腸組織(χ2=30.077，P<0.001；χ2=16.000，P<0.001)，見圖1、圖2。

圖1 結直腸黏膜組織中周期蛋白E的表達情況(免疫組織化學染色法，×400) 1a為正常結直腸黏膜周期蛋白E陰性表達，1b為結直腸癌黏膜周期蛋白E弱陽性表達，1c為結直腸癌黏膜周期蛋白E中度陽性表達，1d為結直腸癌黏膜周期蛋白E強陽性表達

圖2 結直腸黏膜組織中生存素的表達情況 (免疫組織化學染色法，×400) 2a為正常結直腸黏膜生存素的陰性表達，2b為結直腸癌黏膜生存素弱陽性表達，2c為結直腸癌黏膜生存素中度陽性表達，2d為結直腸癌黏膜生存素強陽性表達

2.2結直腸癌組織中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達與臨床病理因素的關系 不同性別、組織分化、腫瘤浸潤位置周期蛋白E和生存素陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；年齡≥50歲者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于年齡<50歲者(P<0.05)；Dukes分期為 Ⅲ～Ⅳ 期者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)；發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者周期蛋白E和生存素陽性表達率均高于未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見表1。

表1 結直腸癌中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達與臨床病理因素的關系 [例(%)]

2.3結直腸癌中周期蛋白E和生存素表達強度與臨床病理因素的相關性 周期蛋白E和生存素陽性表達強度與Dukes分期和淋巴結轉(zhuǎn)移均呈正相關(P<0.01)，見表2。

表2 結直腸癌中周期蛋白E和生存素的表達強度與臨床病理因素的相關性

3 討 論

腫瘤的形成過程極為復雜，受多因素、多基因間的相互作用影響最終形成惡性腫瘤[10]。生物體在生長發(fā)育過程中，維持機體正常細胞的增殖、凋亡，細胞增殖、凋亡失調(diào)將對組織細胞生物學行為產(chǎn)生不良影響，進而導致腫瘤的發(fā)生[11]。據(jù)相關研究顯示，在結直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中細胞增殖和凋亡均發(fā)揮重要作用[12]。

在細胞周期調(diào)控過程中，周期蛋白E發(fā)揮重要作用，與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關系，該蛋白與細胞周期蛋白依賴性激酶2結合，可以促進細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而使細胞周期正常運轉(zhuǎn)。通常情況下，周期蛋白E的合成主要處于G1中期，當細胞至S期后，與脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸存在關系的蛋白會發(fā)生水解，從而導致周期蛋白E水平急速下降，因此在細胞的G2和M期不存在周期蛋白E表達，在整個細胞周期期間，周期蛋白依賴性激酶2的表達水平保持穩(wěn)定[13]。腫瘤發(fā)生過程中，周期蛋白E在整個細胞周期間表達，從而激活細胞周期中的周期蛋白依賴性激酶2，導致一些已經(jīng)停止繁殖的細胞不斷增殖，進入細胞周期內(nèi)，進而導致腫瘤的發(fā)生[14]。許曉陽等[15]通過對比原發(fā)性結直腸癌、正常結直腸黏膜以及息肉中周期蛋白E的表達情況發(fā)現(xiàn)，周期蛋白E的表達水平與腫瘤大小、病理分級以及是否存在淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關，可以將周期蛋白E作為結直腸癌的判斷指標。本研究結果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者周期蛋白E的陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期和未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者?？梢?，周期蛋白E的過表達對細胞周期的轉(zhuǎn)化具有促進作用，可參與結直腸癌的發(fā)生及發(fā)展。

生存素是一種細胞凋亡抑制蛋白，屬于目前研究中最強的一種凋亡抑制因子，其除對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用外，還可以保護血管、促進腫瘤血管的生成以及在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有調(diào)節(jié)性作用等。研究表明，生存素在正常的分化組織中不表達，但是在各種腫瘤組織中呈高表達，該性質(zhì)使其在腫瘤的早期診斷、治療以及預后評價中具有獨特的優(yōu)勢，同時生存素表達水平升高可抑制細胞的正常凋亡，延長腫瘤細胞生存期，使已經(jīng)停止增殖的細胞出現(xiàn)異常增殖和惡化，增加結直腸癌的發(fā)生率[16]。另有研究顯示，生存素具有多種生物學活性，可通過抑制細胞凋亡、保護血管、調(diào)節(jié)細胞周期參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展[17]。楊東杰和姚宏[18]對66例大腸癌組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)生存素在大腸癌組織中的陽性表達率為71.21%(47/66)，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移患者生存素的陽性表達率均為81.58%(31/38)。本研究結果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移者生存素陽性表達率明顯升高，與上述研究結果類似。提示生存素的高表達對細胞的凋亡產(chǎn)生抑制作用，不僅提高結直腸癌癌細胞的生存能力，還參與結直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達水平可能成為判斷結直腸癌預后的潛在指標。

研究表明，生存素的表達與患者的年齡、性別以及腫瘤的分化程度無相關性，但與患者的Dukes分期和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關[19-20]。本研究結果顯示，周期蛋白E和生存素表達強度與Dukes分期和淋巴結轉(zhuǎn)移均呈正相關(P<0.01)，與上述研究結論類似。提示，周期蛋白E、生存素與結直腸癌患者臨床分期和是否發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移存在一定關系，周期蛋白E的表達可能將結直腸癌細胞進行部分轉(zhuǎn)化，即從G1期轉(zhuǎn)化至S期，使DNA合成增加。而生存素則使經(jīng)DNA合成后的細胞從G2期轉(zhuǎn)化為M期，周期蛋白E和生存素發(fā)揮協(xié)同作用，促進結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，使患者臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移等臨床癥狀和體征表現(xiàn)更加明顯[21-23]。

綜上所述，周期蛋白E和生存素在結直腸癌組織中高表達，與患者的Dukes分期、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，可成為判斷結直腸癌患者預后的潛在指標。