張曉飛，余秋然，趙宇航，石展耀，周利，李二超，謝嘉,*

1. 海南大學(xué)海洋學(xué)院，?？?570228 2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241

近年來，塑料被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療衛(wèi)生和商品包裝中，且需求量巨大。當(dāng)前，塑料產(chǎn)量從1950年代的150萬t增加至2018年的3.6億t，2018年中國(guó)的塑料產(chǎn)量占世界塑料產(chǎn)量的30%[1]。然而，塑料廢棄物處置不當(dāng)所引發(fā)的環(huán)境污染問題，引起了世界范圍內(nèi)的廣泛憂慮[2]。塑料產(chǎn)品在風(fēng)化和侵蝕后會(huì)破碎成較小的碎片，美國(guó)國(guó)家海洋和大氣管理局(NOAA)將長(zhǎng)度<5 mm的塑料碎片定義為微塑料(microplastics, MPs)[3]。如今MPs已成為非常受關(guān)注的新污染物，因其難降解、在環(huán)境中可長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)忍匦?，?duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的危害引起了全球關(guān)注。塑料薄膜殘留物的分解、地表徑流、污水灌溉和大氣沉降等原因，導(dǎo)致了微塑料MPs容易在土壤中累積，據(jù)調(diào)查，工業(yè)和農(nóng)業(yè)區(qū)域土壤中的MPs可高達(dá)300～67 500 mg·kg-1[4]。但在風(fēng)力、地下滲透和雨水沖刷的作用下，微塑料MPs通過地表徑流和河流匯入海洋，使其成為微塑料MPs的最終聚集地。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)江口表層水中MPs的平均豐度為900 n·m-3[5-6]，珠江三角洲每年估計(jì)有390億個(gè)(約66 t)MPs顆粒從河流匯聚入海[7]，MPs最終匯聚入海，在全球近海、大洋、深海和極地海洋表面大約有5.25萬億個(gè)MPs顆粒漂浮，總質(zhì)量可達(dá)2.7×105t[8]。

MPs易被水生生物攝入，科學(xué)家們?cè)谫O貝、魚類等水生物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了MPs的存在[3,9-12]。有報(bào)道稱，當(dāng)MPs進(jìn)入機(jī)體后會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(zebrafish)和珊瑚魚(Acanthochromispolyacanthus)的行為異常、抑制魚體的生長(zhǎng)[13-14]；使歐州鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[15]、羅非魚(Oreochromisniloticus)的免疫防御功能降低、擾亂機(jī)體的脂質(zhì)代謝[16]。此外，MPs還會(huì)在水生生物的腸道內(nèi)累積，使機(jī)體腸道菌群紊亂[17]。有研究發(fā)現(xiàn)MPs可通過影響魚類腸道菌群組成，進(jìn)而擾亂機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收和能量代謝[18]；此外，MPs還會(huì)導(dǎo)致斑馬魚腸道菌群紊亂從而引起腸道炎癥，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[19]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展了大量有關(guān)微塑料對(duì)魚類的毒性效應(yīng)研究，但微塑料的種類選擇多為聚苯乙烯(PS)[20-23]，對(duì)聚乙烯的毒性效應(yīng)研究鮮見報(bào)道。尼羅羅非魚是雜食性魚，具有生長(zhǎng)、繁殖快、抗逆性強(qiáng)等特性，是海南省重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，也是重要的科研用淡水養(yǎng)殖魚類[24-25]。因此，本文采用尼羅羅非魚作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究高密度聚乙烯(HDPE)對(duì)其生長(zhǎng)性能、生理生化功能以及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果可為微聚乙烯塑料對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

尼羅羅非魚仔魚購(gòu)自海南省?？谑泻Ｄ喜Ⅳ~鱉種苗場(chǎng)，馴養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)用淡水經(jīng)200目篩絹過濾，提前曝氣24 h后備用。

高密度聚乙烯粉末，粒徑61～83 μm(95.5%)，密度約為1 000 n·mg-1，購(gòu)自上海冠步科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尼羅羅非魚暴露實(shí)驗(yàn)

暴露實(shí)驗(yàn)在玻璃缸(60 cm×30 cm×35 cm)中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)水體為30 L，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)選擇180尾(每缸15尾)大小相近健康幼魚((23.9±0.46) g)分別放入HDPE濃度為0、0.01、0.1和5 mg·L-1的淡水中，HPDE暴露濃度的設(shè)計(jì)依據(jù)海南海域?qū)崪y(cè)環(huán)境濃度和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)曝氣，每日投喂羅非魚飼料(約占體質(zhì)量的3%)2次，日換水量100%，暴露28 d后進(jìn)行取樣，取樣前禁食24 h，收集魚腦、腸和肝臟，肝臟稱量濕質(zhì)量，其他分別放入1.5 mL的無菌離心管中，然后將樣品置于液氮中速凍，樣品儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱中待后續(xù)分析。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

參考[25-26]的方法，進(jìn)行生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定：

成活率(survival rate, %)=成活數(shù)量/總數(shù)量×100%
增重率(weight gain rate, %)=(Wt-W0)/W0×100%
肝體指數(shù)(hepatosomatic index, HI, %)=WI/Wt×100%
肥滿度(condition factor, %)=Wt/Lt3×100%

式中：W0、WI、Wt和Lt分別為尼羅羅非魚的初始體質(zhì)量(g·尾-1)，尼羅羅非魚肝臟質(zhì)量(g·尾-1)，實(shí)驗(yàn)終末尼羅羅非魚體質(zhì)量(g·尾-1)和終末魚體長(zhǎng)(cm)。

1.2.3 CAT、T-AOC、AKP、ACP、AChE酶活性和MDA含量的測(cè)定

每組肝臟和魚腦稱重約0.1 g，用0.86%預(yù)冷的生理鹽水溶液制成10%(V/m)的勻漿。將勻漿液在4 ℃下2 500 r·min-1離心10 min。立即提取上清液，接著用酶標(biāo)儀(Bio-RAD，美國(guó))分析其生化參數(shù)。丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和乙酰膽堿酯酶(AChE)等試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 16S rDNA高通量測(cè)序檢測(cè)MPs對(duì)腸道微生物的影響

使用杭州福來納米技術(shù)有限公司提供的商業(yè)磁珠DNA分離試劑盒，從每個(gè)腸道中提取基因組DNA(gDNA)。所有提取的gDNA均通過紫外光譜和電泳進(jìn)行定量，以供進(jìn)一步分析。此外，采用以下方案通過實(shí)時(shí)qPCR擴(kuò)增每個(gè)樣品中的部分gDNA：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s和72 ℃持續(xù)1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，然后72 ℃持續(xù)10 min。用靶向細(xì)菌16S rDNA基因V3和V4區(qū)的特異性引物(正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增gDNA樣品。此外，在Illumina MiSeq平臺(tái)上使用雙索引擴(kuò)增和測(cè)序，然后進(jìn)行QIIME(vision 1.9.0)生物信息學(xué)分析，檢測(cè)腸道菌群的組成。為了評(píng)估腸道菌群的α多樣性，使用QIIME計(jì)算豐富度指數(shù)(ACE、Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson指數(shù))。同時(shí)，通過KEGG系統(tǒng)分析羅非魚腸道微生物基因功能。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的方法表示，酶活數(shù)據(jù)使用SPSS(社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包)25.0軟件(美國(guó)SPSS Inc.)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，顯著水平為P<0.05。腸道微生物數(shù)據(jù)采用Student’s T檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 生長(zhǎng)和存活指標(biāo)

與對(duì)照組相比，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚的增重率、成活率和肝體比均無明顯變化(P>0.05)(圖1(a)、(b)和(d))。而0.1 mg·L-1和5 mg·L-1HDPE暴露組中尼羅羅非魚的肥滿度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1(c))。

圖1 高密度聚乙烯微塑料(HDPE)暴露28 d對(duì)尼羅羅非魚的增重率(a)、成活率(b)、肥滿度(c)和肝體比(d)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 Effect of high-density polyethylene (HDPE) on weight gain rate (a), survival rate (b), condition factor (c) and hepatosomatic index (d) of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.2 MDA含量與抗氧化酶活性

經(jīng)HDPE暴露28 d后，0.01 mg·L-1和5 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚肝臟MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05) (圖2(a))；T-AOC、SOD和CAT活性與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖2(b)、(d)和(e))。尼羅羅非魚肝臟GST活性僅在5 mg·L-1暴露組中顯著升高(P<0.05)(圖2(c))。

圖2 HDPE暴露28 d對(duì)尼羅羅非魚肝臟組織丙二醛(MDA) (a)、總抗氧化能力(T-AOC) (b)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) (c)、超氧化物歧化酶(SOD) (d)和過氧化氫酶(CAT) (e)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of HDPE on malondialdehyde (MDA) (a), total-antioxidant capacity (T-AOC) (b), gultathione S-transferases (GST) (c), superoxide dismutase (SOD) (d) and catalase (CAT) (e) in liver of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.3 神經(jīng)毒性和免疫功能

經(jīng)HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚腦組織中AChE活性以及肝臟組織中AKP活性與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)(圖3(a)和(c))，0.1 mg·L-1暴露組尼羅羅非魚肝臟組織中ACP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3(b))。

圖3 HDPE暴露28 d對(duì)尼羅羅非魚腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE) (a)、肝臟組織酸性磷酸酶(ACP) (b)和堿性磷酸酶(AKP) (c)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 3 Effect of HDPE on acetylcholinesterase (AChE) in brain (a), acid phosphatase (ACP) in liver (b) and alkaline phosphatase (AKP) in liver (c) of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.4 腸道菌群豐度與結(jié)構(gòu)功能

OTU(Operational Taxonomic Units)是人為把相似度>97%的分類單元(品系、屬、種、分組等)序列進(jìn)行聚類而設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。Veen圖用來統(tǒng)計(jì)樣本之間OTU組成的相似情況，通常情況下，分析時(shí)選用相似水平為97%的OTU。如圖4顯示，0.01、0.1和5 mg·L-1HDPE暴露組與對(duì)照組之間共有的OTU數(shù)目分別為34、30和8。

圖4 HDPE暴露28 d尼羅羅非魚腸道微生物Venn圖Fig. 4 Veen diagram of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 d

Alpha多樣性分析顯示，Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 HDPE暴露28 d尼羅羅非魚腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 d

在門水平上，放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和衣原體門(Chlamydiae)是尼羅羅非魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)物種，其他物種豐度占比均<1%。其中，5 mg·L-1HDPE暴露組的尼羅羅非魚腸道中，衣原體門顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖5(a)和(b))。

圖5 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道微生物門水平物種組成(a)及組間差異(b)注：*表示P<0.05。Fig. 5 Composition of intestine microbiota at the phylum level of O. niloticus (a) and differences between groups (b) after exposure to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05.

在屬水平上，戈登氏菌屬(Gordonia)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)為尼羅羅非魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)屬。由Student’s T檢驗(yàn)，0.01 mg·L-1HDPE暴露組未定義到屬的芽孢桿菌目(norank_f_norank_o_Bacillales)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.1 mg·L-1HDPE暴露組腸桿菌屬(Enterobacter)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；5 mg·L-1暴露組未定義到屬的副衣原體科(norank_f Parachlamydiaceae)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、假紅游動(dòng)菌屬(Pseudorhodoplanes)、norank_f_JG30-KF-CM45、諾卡菌屬(Nocardioides)、井桿菌屬(Phreatobacter)、微單胞菌屬(Micromonospora)、未定義到屬的衣藻科(norank_f_Holosporaceae)和鏈霉菌屬(Streptomyces)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖6(a)和(b))。

圖6 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道微生物屬水平物種組成(a)及組間差異(b)注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 6 Composition of intestine microbiota at the Genus level of O. niloticus (a) and differences between groups (b) after exposure to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

根據(jù)KEGG基因功能預(yù)測(cè)分析可知，0.1 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚的腸道菌群中雙組分系統(tǒng)(two-component system)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、氨?；?1RNA生物合成(aminoacyl-1RNA biosynthesis)和同源重組(homologous recombination)通路與對(duì)照組相比顯著上調(diào)(P<0.05)，5 mg·L-1HDPE暴露組中脂肪酸降解(fatty acid degradation)和色氨酸代謝(tryptophan metabolism)通路與對(duì)照組相比顯著上調(diào)(P<0.05)(圖7)。

圖7 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道菌群KEGG功能預(yù)測(cè)分析注：*表示P<0.05。Fig. 7 KEGG prediction analysis of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05.

3 討論(Discussion)

本研究中，高密度聚乙烯微塑料未導(dǎo)致尼羅羅非魚死亡，且與對(duì)照組相比，尼羅羅非魚的增重、成活率和肝體比均無顯著變化，這和前人的研究結(jié)果相似[22,27-29]。也有報(bào)道稱，MPs可以降低金鯛魚的生長(zhǎng)[14]，這可能與MPs的粒徑大小有關(guān)，有研究表明，MPs粒徑越小對(duì)機(jī)體的危害越大[15,30]。

當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧平衡被打破，產(chǎn)生過多的過氧化產(chǎn)物[31]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量水平可作為機(jī)體過氧化程度的指標(biāo)[32]。SOD、CAT、GST和T-AOC等構(gòu)成機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)。在本研究中，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚肝臟中MDA含量和GST酶活性顯著升高，但SOD、CAT和T-AOC酶活性無顯著變化。這與金魚暴露于聚氯乙烯微塑料4 d后，肝臟中的MDA含量和GST活性顯著升高的結(jié)果一致[33]。當(dāng)鯛魚暴露于低密度聚乙烯微塑料21 d后，肝臟中GST酶活性也顯著升高[34]。以上結(jié)果表明，在聚乙烯的MPs脅迫下，會(huì)引起尼羅羅非魚的氧化應(yīng)激，激活機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)。

AChE是一種與神經(jīng)沖動(dòng)傳遞有關(guān)的必需酶，當(dāng)機(jī)體暴露于環(huán)境污染物時(shí)，其活性易被抑制[35]。本研究結(jié)果顯示，75 μm HDPE暴露28 d后，對(duì)羅非魚沒有神經(jīng)毒性效應(yīng)。這與以往的研究不同，據(jù)報(bào)道，當(dāng)0.1 μm聚苯乙烯暴露14 d后，紅羅非魚AChE活性被抑制[22]；在飼料中添加10～600 μm的聚乙烯后，斑馬魚會(huì)因?yàn)樯窠?jīng)損傷產(chǎn)生癲癇的癥狀[13]；暴露于100～400 μm聚乙烯和聚丙烯混合物，對(duì)楔形蛤(Donaxtrunculus)產(chǎn)生神經(jīng)毒性[35]。推測(cè)這可能和MPs粒徑大小和模式生物有關(guān)。研究表明，粒徑小的MPs可以通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到機(jī)體的不同組織[27,29]，當(dāng)MPs通過血腦屏障進(jìn)入腦組織中時(shí)就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生神經(jīng)抑制，而粒徑大的MPs無法通過血液屏障，因此主要存在于胃腸道中[36-37]。此外，相較于底棲動(dòng)物，尼羅羅非魚的生物累積效應(yīng)低，且具有較強(qiáng)的解毒能力，所以推測(cè)HDPE對(duì)尼羅羅非魚的神經(jīng)毒性影響較小。

魚類在抵抗外界脅迫的過程中，主要依靠其非特異性免疫防御系統(tǒng)進(jìn)行防御[38]。非特異性防御機(jī)制是通過免疫相關(guān)酶來抵抗異物的侵入，從而提高自身免疫力，其中磷酸酶是非常重要的非特異性免疫酶[39]，也是動(dòng)物體內(nèi)的解毒體系[40]，可通過直接溶解或消化外源物質(zhì)達(dá)到防御目的[41]。根據(jù)磷酸酶催化作用最適pH的特性，可分為酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)[42]。在本研究中，尼羅羅非魚在HDPE暴露28 d后對(duì)AKP活性并未造成顯著影響，而0.1 mg·L-1HDPE暴露組的ACP活性顯著升高。有研究表明當(dāng)黑海參(Holothuriaatra)暴露于MPs后，AKP活性沒有顯著變化[43]，而ACP活性升高，表明MPs會(huì)影響機(jī)體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)。

腸道微生物可以調(diào)節(jié)宿主的生長(zhǎng)代謝、免疫防御，屏蔽病原微生物入侵，對(duì)宿主健康起著非常重要的作用[18]。研究表明，MPs可以在腸道內(nèi)累積，對(duì)腸道微生物群結(jié)構(gòu)和宿主健康存在威脅[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚腸道微生物的Alpha多樣性與對(duì)照組相比無顯著差異，此外，羅非魚腸道菌群Veen圖顯示隨HDPE暴露濃度的升高腸道菌群OTU數(shù)逐漸減少。以上結(jié)果表明，HDPE脅迫后可能會(huì)引起尼羅羅非魚腸道菌群紊亂，且高濃度HDPE暴露組效應(yīng)最明顯。

據(jù)報(bào)道，變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門是羅非魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群[44-45]，其中變形菌門和擬桿菌門豐度下降會(huì)降低機(jī)體的免疫防御功能[46]。在本研究中，尼羅羅非魚腸道中變形菌門、擬桿菌門的豐度隨著HDPE暴露濃度增加而減少，表明HDPE對(duì)尼羅羅非魚腸道菌群的免疫功能造成潛在影響，且與暴露濃度有關(guān)。藍(lán)細(xì)菌門能產(chǎn)生自由基分解MPs[47]，在本研究中，其豐度減少表明高濃度HDPE暴露可以降低尼羅羅非魚腸道降解MPs的能力。此外，5 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚腸道菌群中衣原體門豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。衣原體作為一種致病菌，可以感染的宿主非常多[48]，許多衣原體對(duì)動(dòng)物和人類都有致病性，可作為疾病傳播的媒介，構(gòu)成人畜共患病[49]。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物而言，衣原體可以引起魚類產(chǎn)生上皮樣囊腫，上皮樣囊腫是一種新型的水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病，其特征是在魚類的鰓或皮膚上形成細(xì)胞質(zhì)包涵體，引發(fā)魚類的鰓粘膜粘連壞死或組織增生進(jìn)而導(dǎo)致魚體死亡，且衣原體在魚類中感染率可達(dá)4%～100%[50]，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖動(dòng)物健康[51-52]。當(dāng)尼羅羅非魚暴露于高濃度MPs后，衣原體門豐度顯著升高，表明聚乙烯MPs對(duì)尼羅羅非魚的腸道健康造成危害。未定義到屬的芽孢桿菌目和腸桿菌屬屬于腸道益生菌，具有免疫增強(qiáng)作用[53-54]，小單胞菌屬、鏈霉菌屬和放線菌屬可以產(chǎn)生抗菌和抗腫瘤特性物質(zhì)[55]。當(dāng)腸道菌群受到MPs脅迫時(shí)，其豐度增加，可能與機(jī)體的免疫防御反應(yīng)有關(guān)。其中，在高濃度HDPE暴露組中，未定義到屬的副衣原體科含量增加最為明顯，表明高濃度MPs可以危害尼羅羅非魚腸道健康，進(jìn)而對(duì)尼羅羅非魚的機(jī)體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)。

KEGG通路功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，機(jī)體受到MPs脅迫后0.1 mg·L-1HDPE暴露組雙組分系統(tǒng)、嘧啶代謝、氨?；?tRNA生物合成和同源重組通路與對(duì)照組相比，顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，雙組分系統(tǒng)通路屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可以使細(xì)菌接收和響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外的各種物理、化學(xué)和生物刺激[56]，其通路上調(diào)說明MPs刺激腸道內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)；嘧啶代謝和癌細(xì)胞增殖有關(guān)，在癌細(xì)胞中嘧啶代謝酶會(huì)過度表達(dá)；氨酰基-tRNA生物合成和同源重組屬于翻譯功能，氨酰基tRNA合成酶(AARS)是翻譯機(jī)制的重要組成部分，可以催化氨基酸特異性附著在同源tRNA上[57]，為蛋白質(zhì)生物合成提供原料，也可為細(xì)胞增殖提供所需的酶[58]。因此，推測(cè)聚乙烯微塑料會(huì)誘導(dǎo)尼羅羅非魚腸道內(nèi)腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞增殖。以上4條通路均滿足了癌細(xì)胞快速增殖的條件，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

在5 mg·L-1HDPE暴露組中，尼羅羅非魚腸道中脂肪酸降解和色氨酸代謝通路顯著高于對(duì)照組。魚類主要依賴脂代謝為機(jī)體提供能量[59]，當(dāng)魚類暴露于MPs后機(jī)體脂代謝增加，表明機(jī)體通過調(diào)動(dòng)儲(chǔ)備能量來維持生存，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體儲(chǔ)備能量降低。此外，腸道中色氨酸代謝產(chǎn)物可參與腸道通透性、炎癥調(diào)節(jié)和宿主免疫反應(yīng)[60]，還可介導(dǎo)宿主的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫[61]。色氨酸代謝通路上調(diào)表明尼羅羅非魚暴露于聚乙烯微塑料后，其腸道免疫防御系統(tǒng)被激活，這可能是MPs引起機(jī)體儲(chǔ)備能量降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降所致。

綜上所述，HDPE暴露尼羅羅非魚后對(duì)其生長(zhǎng)、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)沒有顯著影響，但可以造成氧化損傷，使其腸道菌群發(fā)生紊亂，其中，腸道菌群中衣原體門豐度的增加會(huì)危害腸道和機(jī)體健康。在本研究中已經(jīng)檢測(cè)到KEGG功能通路的變化，但其具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。