歐詒丹 高元杰 陳靜 (儋州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571700)

帕金森病(PD)在60歲以上人群發(fā)病率約1%〔1〕，是以運(yùn)動(dòng)遲緩、僵硬、姿勢(shì)不穩(wěn)和震顫為特征的神經(jīng)退行性疾病〔2〕。建立PD模型細(xì)胞可研究PD發(fā)展的分子機(jī)制，為其治療提供分子靶點(diǎn)。

研究表明，miRNA參與PD相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與PD的發(fā)病過程，miRNA和lncRNA可能是PD的潛在治療靶點(diǎn)〔3〕。生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本(GAS)5在癌癥中廣泛存在，可抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔4〕。但目前GAS5對(duì)PD的影響還不清楚，需要進(jìn)一步研究。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-128可能是GAS5的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)miR-128在PD中起重要的作用，敲低miR-128表達(dá)小鼠可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)〔5〕。本研究通過以1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)處理SK-N-SH細(xì)胞24 h的方式建立PD細(xì)胞模型，檢測(cè)GAS5和miR-128對(duì)PD模型細(xì)胞活性和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH購自ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，MPP+、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和抗GAPDH抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；總RNA提取試劑TRIzol和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司；引物、GAS5過表達(dá)載體(pcDNA3.1-GAS5)、GAS5干擾物(si-GAS5)、miR-128模擬物(miR-128)、miR-128抑制劑(anti-miR-128)、陰性對(duì)照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、GAS5的野生型和突變型雙熒光素酶載體購自上海吉瑪基因；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、發(fā)光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合成單層時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2PD細(xì)胞模型建立〔6〕取對(duì)數(shù)生長期的SK-N-SH細(xì)胞進(jìn)行模型建立。分為對(duì)照(Con)組：SK-N-SH細(xì)胞正常培養(yǎng)；MPP+組：培養(yǎng)液中加入終濃度為2.50 mmol/L的MPP+，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MPP++轉(zhuǎn)染組：加入終濃度為2.50 mmol/L的MPP+培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將加入MPP+后培養(yǎng)24 h的SK-N-SH細(xì)胞，稀釋為1×106個(gè)細(xì)胞/ml，以每孔200 μl(2×105個(gè)/孔)接種于6孔板中，待細(xì)胞生長融合成單層時(shí)按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：GAS5抑制組(轉(zhuǎn)染si-NC和si-GAS5)，miR-128過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-128)，GAS5過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pcDNA3.1-GAS5)，GAS5和miR-128共抑制組(轉(zhuǎn)染si-GAS5+anti-miR-NC和si-GAS5+anti-miR-128)，GAS5野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(轉(zhuǎn)染miR-NC+WT-GAS5、miR-128+WT-GAS5、miR-NC+MUT-GAS5和miR-128+MUT-GAS5)，將各載體或片段轉(zhuǎn)入MPP+處理24 h的SK-N-SH細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 收集MPP+處理和(或)轉(zhuǎn)染后的各組SK-N-SH細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照 Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)合成miR-128 和GAS5，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 收集MPP+處理和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，稀釋后以2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔細(xì)胞的OD490 nm(A)值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集MPP+處理和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，按照流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集MPP+處理和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，冰浴超聲破碎細(xì)胞，離心收集蛋白，將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(Bcl-2抗體1∶2 000、Bax抗體1∶1 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4℃過夜孵育，PBST洗膜2次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，顯影，以GAPDH 為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MPP+處理對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的影響 與Con組相比，MPP+組處理的SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，細(xì)胞在24 h、48 h和72 h的OD值均顯著降低(均P<0.001)，見圖1、表1、圖2。

圖1 MPP+處理對(duì)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

表1 MPP+處理對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的影響

圖2 MPP+處理對(duì)SK-N-SH細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.2GAS5、miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞中的表達(dá) 與Con組相比，MPP+組處理的SK-N-SH細(xì)胞中GAS5含量顯著升高，miR-128含量顯著下降(均P<0.001)，見表2。

2.3抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的影響 與MPP++si-NC組相比，MPP++si-GAS5組SK-N-SH細(xì)胞中GAS5和Bax表達(dá)顯著下降，Bcl-2表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著下降，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(均P<0.001)，見表3、圖3、圖4。

表2 GAS5、miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞中的表達(dá)

表3 抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的影響

圖3 抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH 凋亡的影響

1，2：MMP+-si-NC組,MMP+-si-GAS5組圖4 抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH 凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.4GAS5靶向調(diào)控miR-128的表達(dá) miR-128的中含有與GAS5互補(bǔ)的序列，見圖5。與miR-NC組相比，過表達(dá)miR-128組野生型WT-GAS5的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)；而突變型MUT-GAS5的熒光素酶相對(duì)活性無顯著變化。見表4。qRT-PCR結(jié)果表明，與pcDNA3.1組(1.01±0.10)相比，過表達(dá)GAS5可使miR-128含量顯著下調(diào)(0.31±0.03，P<0.05)；與si-NC組(1.03±0.10)相比，抑制GAS5表達(dá)可上調(diào)miR-128含量(1.62±0.16，P<0.05)。

圖5 GAS5靶向miR-128

2.5過表達(dá)miR-128對(duì)MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的影響 與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-128組SK-N-SH細(xì)胞中miR-128和Bcl-2含量顯著升高，Bax表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(均P<0.001)，見圖6、圖7、表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖6 過表達(dá)miR-128對(duì)MPP+處理的SK-N-SH凋亡的影響

1，2：MMP+-miR-NC組，MMP++miR-128組圖7 過表達(dá)miR-128對(duì)MPP+處理的SK-N-SH凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.6抑制miR-128能逆轉(zhuǎn)抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的作用 與MPP++si-GAS5+anti-miR-NC組相比，MPP++si-GAS5+anti-miR-128組SK-N-SH細(xì)胞中GAS5和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.001)，miR-128和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著降低(均P<0.001)，見表6、圖8、圖9。

表5 過表達(dá)miR-128對(duì)MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的影響

表6 抑制miR-128能逆轉(zhuǎn)抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性及凋亡的影響

圖8 抑制miR-128能逆轉(zhuǎn)抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH凋亡的影響

1，2：MPP++si-GAS5+anti-miR-NC組,MPP++si-GAS5+anti-miR-128組圖9 抑制miR-128能逆轉(zhuǎn)抑制GAS5對(duì)細(xì)胞MPP+處理的SK-N-SH凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

PD影響著0.1%～0.2%的人類，是一種多因素導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能減退，影響患者正常生活，且大多在神經(jīng)元完全退化后期才被發(fā)現(xiàn)，缺乏早期診斷技術(shù)和后期治療策略，發(fā)現(xiàn)其早期診斷標(biāo)志物和后期治療靶點(diǎn)是疾病研究的熱點(diǎn)〔7〕。

越來越多的研究表明，lncRNA參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控不同的分子機(jī)制，調(diào)控從染色質(zhì)重塑為主的神經(jīng)干細(xì)胞分化到神經(jīng)元活動(dòng)，通過驅(qū)動(dòng)不同的調(diào)控機(jī)制觸發(fā)退行性神經(jīng)死亡和病變〔7〕。LncRNA GAS5是GAS5，其通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生命過程，與心肌梗死、腦卒中、高血壓等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)〔8〕，其在癌癥中多異常表達(dá)，過表達(dá)GAS5可抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔9〕。但GAS5在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究較少。最新研究表明，在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞中，高表達(dá)GAS5能促進(jìn)PC12細(xì)胞向Tuj1陽性神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，顯著抑制PC12細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，不影響PC12細(xì)胞的凋亡，提高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，促進(jìn)膽堿的釋放，GAS5可能有利于神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)〔10〕。GAS5在PD中的表達(dá)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，GAS5在MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞(PD模型)中含量顯著升高，MPP+可促進(jìn)SK-N-SH細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞活性，抑制GAS5可提高M(jìn)PP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡。說明，GAS可能在PD的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究通過TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-128 中含有與GAS5互補(bǔ)的序列，miR-128可能是GAS5的靶基因。miR-128在成年神經(jīng)元中通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和興奮性來調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)行為。在小鼠中，出生后神經(jīng)元miR-128表達(dá)的減少可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)活動(dòng)增加和致命的癲癇，miR-128的過度表達(dá)減弱了神經(jīng)元的反應(yīng)性，抑制了小鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，減輕了與PD和癲癇發(fā)作相關(guān)的運(yùn)動(dòng)異常〔11〕。在PD小鼠中，miR-128表達(dá)降低，其靶向負(fù)調(diào)控軸抑制蛋白(AXIN)1，高表達(dá)miR-128可抑制多巴胺神經(jīng)元的凋亡并促進(jìn)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)4的表達(dá)〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞(PD模型)中含量顯著下降，高表達(dá)miR-128可提高M(jìn)PP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡，與上述結(jié)論〔12〕類似。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和qRT-PCR結(jié)果表明，GAS5靶向負(fù)調(diào)控miR-128的表達(dá)，抑制miR-128逆轉(zhuǎn)了抑制GAS5對(duì)MPP+處理的SK-N-SH細(xì)胞活性和凋亡的影響，驗(yàn)證了最初的預(yù)測(cè)，在PD模型細(xì)胞中GAS5與miR-128之間具有調(diào)控關(guān)系。

綜上，在MPP+處理的PD模型細(xì)胞SK-N-SH中，lncRNA GAS5通過靶向miR-128調(diào)控PD模型細(xì)胞活性和凋亡，提示GAS5和miR-128是可能PD治療的潛在分子靶點(diǎn)。