孫 植，楊 謙，胡文競，王 芳，吳江生，劉 超

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家油菜工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油菜遺傳育種重點實驗室，武漢 430070)

利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)生產(chǎn)雜交種是作物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑之一，可顯著提高作物的產(chǎn)量[1-2]。植物CMS一般是由線粒體基因組重排產(chǎn)生異常嵌合基因?qū)е碌?，嵌合基因編碼的多肽進(jìn)一步影響了花粉的正常發(fā)育[3]。油菜(BrassicanapusL.)是中國乃至世界上最重要的油料作物之一，加強油菜雜種優(yōu)勢利用將有利于中國油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，進(jìn)而保障中國食用油供給安全[4-5]。目前，在油菜中已被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型有10多種，譬如ogu、pol、nap、shan2A、Nca、Nsa、hau和inap等[6]。盡管它們中部分已實現(xiàn)三系配套[7-13]，但是僅有pol CMS和ogu CMS在油菜生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用[14]。目前中國油菜雜交種配制仍然以pol CMS為主，ogu CMS在歐洲和北美等地的油菜雜交種生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[15]，但是因?qū)＠麊栴}，導(dǎo)致其在中國的應(yīng)用受到限制。目前中國在油菜雜種優(yōu)勢上已經(jīng)形成了細(xì)胞質(zhì)單一化的局面，油菜品種的遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，對油菜的安全生產(chǎn)存在潛在威脅[16]。因此創(chuàng)建新型優(yōu)良胞質(zhì)不育類型，并獲得其配套的保持系和恢復(fù)系，對豐富油菜遺傳基礎(chǔ)，選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油菜新品種具有重要的現(xiàn)實意義。

WJS01A是利用本課題組在芥菜型油菜(Brassicajuncea)農(nóng)家品種‘玉溪高棵’中發(fā)現(xiàn)的天然雄性不育株育成的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系[17]。進(jìn)一步通過回交轉(zhuǎn)育獲得了甘藍(lán)型油菜遺傳背景的不育系WNJ01A，同時在WNJ01A與白菜(Brassicarapa)遠(yuǎn)緣雜交后代中選育獲得了恢復(fù)系‘Hui01’，該恢復(fù)系可以完全恢復(fù)WNJ01A的育性。本研究對WJS01A進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，研究結(jié)果將有助于揭示其敗育機制，為該不育系在油菜育種中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用實驗材料均列于表1，其中NRO4270A是我們在蘿卜甘藍(lán)(Raphanusbrassica, RRCC)與甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交后代中發(fā)現(xiàn)的一種CMS類型[18]。實驗材料種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田，以及湖北省長陽縣、巴東縣和甘肅省和政縣等油菜夏季繁殖基地。

表1 實驗用到的材料

1.2 形態(tài)觀察和育性鑒定

在盛花期對不育系WJS01A及其衍生不育系WNJ01A的花粉育性開展調(diào)查，育性調(diào)查的分級標(biāo)準(zhǔn)采用楊光圣、傅廷棟[19]制定的方法，并觀察其是否存在死蕾現(xiàn)象。

1.3 恢保關(guān)系測定

在開花期選取7個恢復(fù)系以及3個甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種，分別與WNJ01A、Pol、Ogu 和Kos進(jìn)行測交，收獲F1雜種并于下一種植季種植于田間。在開花期對每個單株至少5朵花進(jìn)行不少于3次的育性調(diào)查，采用育性分級標(biāo)準(zhǔn)鑒定[19]，以保證調(diào)查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 花藥石蠟切片

取不育系WJS01A的花蕾制作石蠟切片，具體步驟參照植物顯微技術(shù)的方法操作[20]：(1)取材和固定：在油菜開花期，取大小不同花蕾浸沒于FAA固定液(70%酒精90 mL，福爾馬林5 mL，冰醋酸5 mL)中，固定24 h；(2)染色和清洗：將固定后花蕾中的花藥剝離，加入愛式蘇木精染料進(jìn)行整染4 d，用蒸餾水漂洗3～5次，每次0.5～1 h；(3)乙醇脫水：按照30%、50%、70%、85%和95%不同濃度乙醇的順序分別對材料進(jìn)行逐級脫水處理1 h，再用無水乙醇脫水2次，每次1 h；(4)氯仿透明：按照20%、40%、60%和80%不同濃度氯仿分別對材料進(jìn)行逐級透明處理1 h，再用氯仿處理2次，每次1 h；(5)浸蠟和包埋：加入碎蠟后在37 ℃恒溫箱中溫育2 d，隨后在金屬盒中進(jìn)行逐級浸蠟，50%石蠟(48 ℃)溫育2 h，75%石蠟(53 ℃)溫育2 h；純蠟A(56 ℃)，純蠟B(56 ℃)，純蠟C(56 ℃)，每級溫育0.5～1 h；(6)切片：將包埋好的蠟塊在輪轉(zhuǎn)式切片機(KD-2508)上切片，隨后用蛋清甘油粘片和展片，并放置37 ℃烘片3 d以上；(7)脫蠟和封片：二甲苯脫蠟處理0.5～1 h后用加拿大樹膠封片，放置37 ℃烘箱烘片3 d以上。利用Nikon Ds-Ri1全自動顯微鏡對切片進(jìn)行觀察并照相。

1.5 多重PCR鑒定

參考多重PCR區(qū)分油菜不同細(xì)胞質(zhì)類型的鑒定方法[21]，以WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol等5種雄性不育材料以及衍生不育系WNJ01A DNA為模板，用等量混合的3對引物進(jìn)行多重PCR，分別鑒定線粒體基因orf138、orf222/nad5c和orf224[21]。多重PCR采用的反應(yīng)體系為：50 ng模板DNA，2 μL 10×PCR 緩沖液，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 U Taq DNA聚合酶，6 μL混合引物，添加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸70 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物加5 μL上樣緩沖液，用2%的瓊脂糖凝膠電泳。100 V電壓下電泳35 min左右，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

1.6 不同胞質(zhì)類型的RFLP分析

1.6.1 基因組DNA的提取和酶切取WJS01A、Pol、Ogu、Kos和NRO4270A的新鮮葉片5g，采用CTAB方法[22]提取總DNA。用EcoRI和BamHI(Fermentas)進(jìn)行總DNA酶切，酶切體系為：15 μg模板DNA，5 μL 10× buffer，3 μL限制性內(nèi)切酶(10 U/μL)，添加ddH2O至50 μL。在37 ℃條件下過夜酶切，然后加入1/10體積的上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)。

1.6.2 電泳與轉(zhuǎn)膜將酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳(電壓35 V)20 h 后，轉(zhuǎn)移凝膠至0.25 mol/L HCl中處理10 min，直至溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色(脫嘌呤)；蒸餾水漂洗后用0.4 mol/L的NaOH處理10 min，重復(fù)1次(30 min)后再用蒸餾水漂洗；然后用0.4 mol/L NaOH轉(zhuǎn)膜緩沖液將凝膠DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜上；最后用2×SSC溶液漂洗尼龍膜20 min，于80 ℃烘箱中烘烤2 h后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 探針的制備與標(biāo)記根據(jù)已知的油菜線粒體全基因組序列[23]，利用軟件Primer 3.0設(shè)計atp1、atp6、atp9和cox1等4對線粒體引物(表2)。通過PCR擴增得到探針后用DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep)回收探針DNA。標(biāo)記探針采用隨機引物法，先將2.0 μL探針添加11.0 μL ddH2O，沸水處理5 min；冰浴5 min后，依次加入2.5 μL 10×buffer，2.5 μL dNTPs(-dCTP)，1.0 μL Klenow Fragment，2.0 μL隨機引物，2.0 μL[α-32P]dCTP(10Ci/μL)，置于37 ℃水浴2～4 h；沸水變性10 min后，置于冰上備用。

表2 用于RFLP的線粒體探針引物

1.6.4 探針雜交與放射自顯影將已標(biāo)記的探針加入65 ℃預(yù)熱的300 μL預(yù)雜交液，放入雜交爐中，65 ℃條件下與尼龍膜雜交12～16 h；取出尼龍膜，用30 mL洗膜液A(2×SSC、0.1% SDS)，洗膜8～10 min，重復(fù)2次；再用洗膜液B(0.5×SSC、0.1% SDS、65 ℃預(yù)熱)洗膜30 min，重復(fù)2次。將雜交尼龍膜壓在磷屏(Fujifilm BAS-MS 2025)上處理6～8 h，然后用多功能成像系統(tǒng)(Fujifilm FLA-9000)掃描磷屏檢測雜交結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 WJS01A花器官形態(tài)觀察及育性鑒定

對不育系WJS01A及正常芥菜型油菜3340花序和花器官進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，它們的花序結(jié)構(gòu)差異不大，然而對于花器官，WJS01A的花蕾相較于3340略顯瘦小，且它的花朵張開度、花瓣長度和寬度略小于3340(圖1, A、B)。WJS01A的雌蕊發(fā)育正常，柱頭高于雄蕊，花絲縮短，花藥變小、白化且表面無花粉(圖1, C)。而3340的柱頭稍低于花藥，且花絲粗壯，花藥飽滿，表面布滿大量黃色花粉(圖1, D)。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)WJS01A來源的甘藍(lán)型油菜背景不育系WNJ01A花器官的花絲短小，且花藥呈現(xiàn)不同程度的白化并縮小為三角狀[17]。

為鑒定WJS01A不育表型對環(huán)境的敏感性，連續(xù)多年多代(2010—2021)對其了進(jìn)行育性調(diào)查。結(jié)果表明WJS01A的不育性穩(wěn)定，在湖北省武漢市、長陽縣、巴東縣和甘肅省和政縣種植的不育系WJS01A育性標(biāo)準(zhǔn)為0級，不受環(huán)境條件的影響，不育率和不育度均為100%，且無死蕾現(xiàn)象。

2.2 恢保關(guān)系的分析

在開花期，將7個恢復(fù)系(25cc1、9A001C、7-5、91-恢5900、‘恢5148’、298033和Hui01)以及3個甘藍(lán)型油菜品種(‘華雙4號’、‘華油8號’和‘中雙9號’)，分別與WNJ01A、Pol、Ogu、Kos進(jìn)行測交，鑒定F1的育性。結(jié)果表明：91-恢5900、7-5、‘恢5148’和298033只能恢復(fù)Pol的育性，表明Pol與WNJ01A、Ogu、Kos有不同的恢保關(guān)系；恢復(fù)系25cc1、9A001C均能恢復(fù)Ogu和Kos的育性，卻不能恢復(fù)WNJ01A和Pol的育性，說明Ogu和Kos恢保關(guān)系相同[18]，但與WNJ01A和Pol有不同的恢保關(guān)系；同樣地，Hui01只能恢復(fù)WNJ01A的育性，卻不能恢復(fù)Pol、Ogu和Kos的育性。此外，‘華雙4號’等3個甘藍(lán)型油菜品種均不能恢復(fù)這4種不育系的育性。以上結(jié)果說明WJS01A具有與Pol、Ogu和Kos明顯不同的恢保關(guān)系(表3)。

表3 不同胞質(zhì)類型恢保關(guān)系鑒定結(jié)果

2.3 芥菜型油菜不育系WJS01A的細(xì)胞學(xué)分析

通過對不育系WJS01A花蕾橫切石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，它在花藥發(fā)育的早期階段未出現(xiàn)孢原細(xì)胞和造孢細(xì)胞的形成和分化，整個花藥在表皮以內(nèi)都由性質(zhì)均一的細(xì)胞組成。而且4個長雄蕊和2個短雄蕊的發(fā)育形態(tài)不完全一樣，長雄蕊花藥呈長梭形，短雄蕊花藥則呈近似方形(圖2, A、C、D)。同時，觀察到花藥的藥隔維管束，沒有孢原細(xì)胞和壁細(xì)胞的形成。表皮內(nèi)部充滿薄壁組織，且發(fā)生液泡化，沒有形成典型的蝶形花藥結(jié)構(gòu)(圖2, B)。當(dāng)花藥繼續(xù)發(fā)育時，其外形和體積均有所增大，但除藥隔維管束外，表皮以內(nèi)仍保持無任何分化的薄壁細(xì)胞狀態(tài)，而且維管束的韌皮部和木質(zhì)部不發(fā)達(dá)(圖2, C、D)。此外也發(fā)現(xiàn)少數(shù)材料的花藥在孢原細(xì)胞早期停止發(fā)育，但表型仍表現(xiàn)為完全敗育。由此認(rèn)為，不育系WJS01A屬無花粉囊型不育系，主要特點是不能形成正常的孢原細(xì)胞進(jìn)而分化出花粉囊等花藥結(jié)構(gòu)，具體的敗育時期應(yīng)為花藥原基到孢原細(xì)胞時期。

2.4 多重PCR結(jié)果分析

利用多重PCR對WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol 等雄性不育材料以及WJS01A來源不育系WNJ01A進(jìn)行鑒定和區(qū)分。結(jié)果顯示(圖3)，常規(guī)‘華雙5號’僅在1 000 bp左右處存在特異條帶。而Ogu和Kos胞質(zhì)則在500 bp和1 000 bp左右存在特異條帶的組合；NRO4270A胞質(zhì)僅在500 bp左右處有一條特異條帶，且與Ogu和Kos胞質(zhì)的特異條帶之一相同。Pol胞質(zhì)在750 bp左右有一條特異條帶，在500 bp左右有一條較淡的條帶。

正常的芥菜型油菜3340在500 bp左右和1 000 bp左右處有2條較淡的條帶。WJS01A和WNJ01A胞質(zhì)的擴增結(jié)果與3340相同。從以上結(jié)論可以看出多重PCR標(biāo)記可以將WJS01A與其他不育胞質(zhì)類型的材料進(jìn)行區(qū)分，但不能與正常的芥菜型油菜進(jìn)行區(qū)分。

2.5 WJS01A線粒體基因組RFLP分析

利用atp1、atp6、atp9、cox1與限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I組成的8種探針/酶組合，對不同油菜不育胞質(zhì)類型的線粒體基因組進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果顯示(圖4)，在所有探針/酶組合中WJS01A與Ogu、Pol、Kos、NRO4270A不育胞質(zhì)類型存在著顯著不同數(shù)目或大小的條帶。其中，在atp9/BamH I探針/酶組合中，盡管WJS01A與Kos、Ogu和Pol存在2條相似條帶，但WJS01A仍存在另外1條特異條帶(圖4, F)。因此，這些細(xì)胞質(zhì)類型材料的線粒體基因組間存在著顯著的差異，而以上的探針/酶組合可以明顯地區(qū)分WJS01A與其他不育類型，說明WJS01A是一種不同于Ogu、Pol、Kos、NRO4270A的胞質(zhì)類型。

3 討 論

本研究中細(xì)胞質(zhì)雄性不育系WJS01A來源于芥菜型油菜農(nóng)家品種中的天然不育株，該不育類型在不同的生態(tài)壞境下均表現(xiàn)為徹底敗育，不受光照和溫度的影響，且無死蕾現(xiàn)象。由此表明將WJS01A在育種上利用可以解決部分油菜不育胞質(zhì)類型在雜交種制種中存在的微粉問題。

利用細(xì)胞生物學(xué)方法探究雄性不育花藥敗育過程中重要的結(jié)構(gòu)變化，有助于對不育基因調(diào)控花粉敗育發(fā)生機制的解析[24]。WJS01A花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果顯示，在花藥發(fā)育早期階段無孢原細(xì)胞和造孢細(xì)胞的形成與分化，同時，少數(shù)材料的花藥在孢原細(xì)胞早期出現(xiàn)異常發(fā)育。因此，WJS01A敗育時期為花藥原基到孢原細(xì)胞時期。Pol花藥敗育時期為孢原細(xì)胞分化期[25]，而Ogu敗育大多受阻于小孢子四分體至單核花粉時期[26]。與Pol和Ogu相比，WJS01A在花藥發(fā)育上有明顯的不同，因此它是不同于Pol和Ogu的一種不育胞質(zhì)類型。此外，研究發(fā)現(xiàn)WJS01A與另外3種同屬芥菜型油菜來源的不育系hau、歐新A和orf220-type在花器官形態(tài)和花藥敗育特征均有差異[27-29]。其中，hau的不育性由不育基因orf288控制[30]，它的雄蕊退化為花瓣狀，且其敗育關(guān)鍵時期是雄蕊原基分化期[27]；歐新A的不育性由不育胞質(zhì)和核內(nèi)1對隱性基因控制，它的花蕾表現(xiàn)為“突柱段”的柱頭外露[31]；orf220類型不育系受線粒體基因orf220控制，它的雄蕊退化為瓣狀和心皮狀等不同變異類型[29]。同時，我們的研究觀察發(fā)現(xiàn)WJS01A的花藥維管束不發(fā)達(dá)，這與前人在大量雄性不育材料中發(fā)現(xiàn)維管束組織異常的現(xiàn)象相一致[32]。

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育通常是由線粒體基因組重排產(chǎn)生的異常嵌合基因?qū)е碌?，不同敗育胞質(zhì)類型往往具有其特異的異常嵌合基因，因而不同胞質(zhì)類型間的敗育機理存在著較大的差異[3]。本研究利用線粒體基因多重PCR方法對WJS01A、NRO4270A、Kos、Ogu和Pol等雄性不育材料以及WJS01A甘藍(lán)型油菜背景不育系WNJ01A進(jìn)行鑒定和區(qū)分。結(jié)果表明多重PCR標(biāo)記可以將WJS01A與其他不育胞質(zhì)類型區(qū)分開，但卻無法和正常的芥菜型油菜進(jìn)行區(qū)分，證實了該WJS01A與orf138、orf222/nad5c和orf224不育基因并無關(guān)聯(lián)，但他與正常芥菜型油菜線粒體基因組之間依然存在高度同源，因此需進(jìn)一步篩選特定多重PCR標(biāo)記方可區(qū)分兩者之間的差異。此外，利用RFLP對WJS01A及Pol、Ogu、Kos和NRO4270A等不育材料的線粒體基因組進(jìn)行分析，檢測結(jié)果顯示在所有的探針/酶組合中，WJS01A在條帶數(shù)量和大小上均顯示出與其他4種不育胞質(zhì)類型的顯著差異。以上結(jié)果說明不育系WJS01A與其他不育胞質(zhì)類型的線粒體基因組存在顯著變異，是一種不同的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型。WJS01A細(xì)胞質(zhì)不育類型的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了中國油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，而且將有利于拓寬目前油菜雜種優(yōu)勢利用的遺傳基礎(chǔ)。