蔡兆明，程春紅，廖靜靜，王殿東

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 重慶 408100)

細(xì)胞分裂素是一種重要的植物激素，可調(diào)控植物細(xì)胞分裂、蛋白合成、愈傷組織形成、分枝數(shù)目、響應(yīng)逆境脅迫等多個(gè)過程[1-5]，同時(shí)細(xì)胞分裂素在提高植物產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率方面具有很大潛力[6-8]。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl transferases，IPT)是合成細(xì)胞分裂素的關(guān)鍵限速酶，可分為兩類，一類以ATP/ADP為底物催化產(chǎn)生異戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine，iP)和反式玉米素(trans-zeatin)，另一類以tRNA為底物合成順式玉米素(cis-zeatin)[9]。在擬南芥中，共鑒定到9個(gè)AtIPT蛋白，其中AtIPT1和AtIPT3-8以ATP/ADP為原料合成細(xì)胞分裂素，AtIPT2和AtIPT9則以tRNA為原料合成細(xì)胞分裂素[10]。IPT基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御逆境脅迫過程中具有重要功能。在小麥中異源過表達(dá)來源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的IPT基因后，可顯著減少干旱脅迫造成的產(chǎn)量損失[11]，而將該基因在煙草中過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)為葉片衰老延緩的表型[12]。

目前，已在多個(gè)物種中克隆出了IPT基因，如在北沙參(Glehnialittoralis)中，GlIPT1基因被克隆并發(fā)現(xiàn)該基因在花中表達(dá)水平很高[13]。在杭菊(Chrysanthemummorifolium)中，CmIPT1被克隆出來并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)該基因可增加擬南芥的分枝[14]。在苜蓿(Medicagotruncatula)中，有21個(gè)IPT基因被鑒定出來，并發(fā)現(xiàn)MtIPT3可能參與根瘤數(shù)目調(diào)控過程[15]。在與苜蓿同為豆科植物的大豆(Glycinmax)中，有17個(gè)IPT基因被鑒定出來，并發(fā)現(xiàn)GmIPT3和GmIPT15參與對(duì)土壤氮元素的響應(yīng)[16]。這些研究為后續(xù)解析IPT基因在不同物種中的功能奠定了基礎(chǔ)。

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)是重慶地區(qū)主栽的經(jīng)濟(jì)作物之一，其莖部發(fā)生膨大(又名青菜頭)，是制作榨菜的主要原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；诩?xì)胞分裂素在調(diào)控植物細(xì)胞分裂和抵抗逆境脅迫方面的功能，對(duì)細(xì)胞分裂素合成基因IPT家族成員進(jìn)行研究可為提高莖瘤芥的瘤莖產(chǎn)量和培育優(yōu)質(zhì)抗逆栽培品種提供依據(jù)。本研究在全基因組水平對(duì)莖瘤芥IPT家族成員進(jìn)行了鑒定，并分析了它們的基因和蛋白結(jié)構(gòu)特性、系統(tǒng)進(jìn)化情況，以及在不同組織器官和主要逆境條件下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

為了檢測(cè)IPT基因在莖瘤芥不同器官中的表達(dá)水平，將栽培品種‘永安小葉’的種子播種在含有培養(yǎng)基質(zhì)(蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=3∶1)的7 cm直徑的花盆中，置于培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng)，溫度為22 ℃，光照時(shí)間16 h，黑暗8 h。對(duì)培養(yǎng)至生殖生長(zhǎng)期植株的根、莖、葉、花和種莢進(jìn)行取樣。每個(gè)器官取3株樣品的混合材料包于錫箔紙中，立即用液氮速凍后放入超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)總RNA提取及PCR檢測(cè)。

為檢測(cè)IPT基因在鹽脅迫條件下的基因表達(dá)模式，利用上述培養(yǎng)方法將‘永安小葉’培養(yǎng)2周，將200 mmol/L NaCl溶液50 mL澆至植株根部，分別在處理6、12、24和48 h后對(duì)植株根系進(jìn)行取樣，0 h對(duì)照為澆灌50 mL蒸餾水后立即進(jìn)行根系取樣，取樣方法同上。該取樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

為檢測(cè)IPT基因在根腫菌脅迫條件下的基因表達(dá)模式，以5 mLOD600為0.07的根腫菌休眠孢子提取液澆灌培養(yǎng)2周大的莖瘤芥幼苗根周，于處理后12、24、36和72 h對(duì)植株根系進(jìn)行取樣，0 h為對(duì)照，取樣方法同上。該取樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 生物信息學(xué)分析在擬南芥基因資源庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥IPT家族基因的蛋白序列，其基因ID見表1。以擬南芥IPT蛋白序列為搜索條件，在蕓薹屬網(wǎng)站(http://brassicadb.org/brad/)中的莖瘤芥全基因組(chromosome V1.5)中搜索與其序列一致性較高的蛋白，參數(shù)設(shè)置為E< 1e-10, 一致性> 70%，覆蓋度> 95%，其他參數(shù)選擇默認(rèn)。采用在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)獲得序列的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，去除冗余序列和不含腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA二甲丙烯基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的序列。利用在線分析工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算各蛋白的分子量和等電點(diǎn)。采用在線分析軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)。使用MEGA5軟件構(gòu)建莖瘤芥IPT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇鄰接樹算法，p距離模型，插入缺失處理方式選擇配對(duì)刪除，靴帶值(bootstrap)選擇1 000次重復(fù)。

表1 擬南芥IPT基因名和ID

1.2.2 莖瘤芥總RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)采用SimGEN公司(杭州，中國(guó))的植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，使用全式金公司(北京，中國(guó))的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄加入模板RNA的用量為500 ng，并將cDNA稀釋10倍用于qRT-PCR檢測(cè)。采用羅氏(Roche)Light Cycler 480 Ⅱ 熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒配制10 μL反應(yīng)體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，cDNA 0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)榍o瘤芥Bju18SrRNA(BjuA046942)，所用引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用2-ΔΔCt方法對(duì)qRT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。使用Heml軟件對(duì)IPT基因在莖瘤芥不同組織中的表達(dá)進(jìn)行熱圖分析，利用SigmaPlot 10.0軟件對(duì)鹽脅迫和根腫菌脅迫條件下IPT基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析并作圖，使用SPSS 16.0軟件，選則one-way ANOVA的單因素方差分析(LSD)檢驗(yàn)基因表達(dá)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖瘤芥IPT基因鑒定及特性分析

通過序列比對(duì)和篩選，在莖瘤芥基因組中共鑒定到27個(gè)IPT家族基因(表3)，它們的基因長(zhǎng)度在996 bp(BjuA041428)～5 326 bp(BjuA041927)之間，基因編碼序列(CDS)長(zhǎng)度在942 bp(BjuB010173)～2 172 bp(BjuB041047)之間，蛋白序列長(zhǎng)度在313 aa(BjuB010173)～723 aa(BjuB041047)之間。等電點(diǎn)和分子量分析結(jié)果表明，莖瘤芥IPT蛋白等電點(diǎn)在5.46(BjuB010173)～9.41(BjuB000734)之間，分子量在37.12 kD(BjuB007803)～81.67 kD(BjuB041047)之間(表3)。

表3 莖瘤芥IPT基因的基本信息

2.2 莖瘤芥IPT基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)化分析結(jié)果顯示，9個(gè)擬南芥IPT蛋白和27個(gè)莖瘤芥IPT蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹上可聚類為7個(gè)分支，IPT1/4分支包含擬南芥AtIPT1、AtIPT4和4個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT6/8分支包含擬南芥AtIPT6、AtIPT8和3個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT3分支包含擬南芥AtIPT3和4個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT5分支包含擬南芥AtIPT5和5個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT7分支包含擬南芥AtIPT7和5個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT2分支包含擬南芥AtIPT2和2個(gè)莖瘤芥IPT蛋白；IPT9分支包含擬南芥AtIPT9和4個(gè)莖瘤芥IPT蛋白(圖1)。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，IPT1/4、IPT3和IPT7三個(gè)分支中的基因只含一個(gè)外顯子；在IPT6/8分支中的4個(gè)莖瘤芥IPT基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，與擬南芥AtIPT8的基因結(jié)構(gòu)相同。在IPT5分支中除BjuB010173外(2個(gè)外顯子)，其余4個(gè)基因僅含1個(gè)外顯子。在IPT2分支中，BjuB026254與AtIPT2均含有10個(gè)外顯子，而BjuA016315則含有13個(gè)外顯子(圖1)。在IPT9分支中，BjuB045839與BjuA041490均含有12個(gè)外顯子，而BjuB041047與BjuA041927含有14個(gè)外顯子，它們的基因結(jié)構(gòu)與AtIPT9(11個(gè)外顯子)有較大差異(圖1)。

2.3 莖瘤芥IPT基因染色體定位分析

染色體定位分析結(jié)果表明，莖瘤芥IPT基因在全基因組18條染色體中的14條染色體上均有分布，其中A05、A06、A08和B04染色體上不含IPT基因(表 4)。B05染色體上含有的IPT基因數(shù)目最多(4個(gè))，其次在A01和A02染色體上各含有3個(gè)IPT基因。莖瘤芥A染色體組中共含有14個(gè)IPT基因，B染色體組含有13個(gè)IPT基因，IPT基因在兩個(gè)染色體組中的數(shù)目近似均等。

表4 莖瘤芥IPT家族基因染色體定位信息

2.4 莖瘤芥IPT家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，IPT1/4、IPT3、IPT5、IPT6/8和IPT7家族蛋白均含有一個(gè)PLN02165結(jié)構(gòu)域(圖2)，為腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(adenylate isopentenyl transferase)的典型結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)對(duì)于以ATP/ADP為底物和合成細(xì)胞分裂素的ADP/ATP型IPTs發(fā)揮功能十分重要。IPT2和IPT9家族蛋白均含有一個(gè)PLN02748結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)閠RNA二甲丙烯基轉(zhuǎn)移酶(tRNA dimethylallyl transferase)的典型結(jié)構(gòu)域。依據(jù)所含的主要保守結(jié)構(gòu)域可以判斷，在莖瘤芥中，IPT1/4、IPT3、IPT5、IPT6/8和IPT7家族蛋白全部成員為ADP/ATP型IPT，IPT2和IPT9家族蛋白全部成員為tRNA型IPT。此外，IPT2分支中的BjuA016315還含有一個(gè)transcrip_act結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該蛋白可能同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.5 莖瘤芥IPT家族基因在不同器官中的表達(dá)分析

為分析IPT家族基因在莖瘤芥不同組織中的表達(dá)模式，采用qRT-PCR的方法對(duì)不同器官中IPT家族基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，BjuB006281在各個(gè)器官中的表達(dá)水平均相對(duì)較高(圖3)，且在莖中的表達(dá)水平最高，說明該基因可能在調(diào)控瘤莖發(fā)育過程中發(fā)揮功能。相比于其他組織，BjuA027211、BjuB010173、BjuB010174和BjuA001839在根中的表達(dá)水平較高，推測(cè)它們主要對(duì)根的相關(guān)功能進(jìn)行調(diào)控；BjuA014415、BjuB022918、BjuA041428、BjuA044830、BjuA046449和BjuB007352主要在根和莖中表達(dá)。在葉和花中特異表達(dá)的IPT基因較少，僅BjuB041047在葉中表達(dá)高于其他組織；雖然在各器官中BjuA012640在花中的表達(dá)水平高于其他組織，但相比于內(nèi)參基因其表達(dá)量仍舊很低，推測(cè)在莖瘤芥中IPT對(duì)葉和花器官的調(diào)控作用可能較小。

2.6 莖瘤芥IPT基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)分析

為鑒定出響應(yīng)鹽脅迫的莖瘤芥IPT基因，選擇了18個(gè)在根中表達(dá)水平相對(duì)較高的IPT成員，并對(duì)它們?cè)?00 mmol/L NaCl脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的根中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果(圖4)表明，大部分的IPT基因均受鹽脅迫的下調(diào)表達(dá)。其中，BjuB006281、BjuA036403、BjuB010173、BjuB026254在鹽脅迫處理12～48 h顯著下調(diào)表達(dá)；BjuB022918和BjuB007352則在鹽處理24～48 h顯著下調(diào)表達(dá)；BjuA041428、BjuA044830、BjuA016315的表達(dá)水平在鹽脅迫處理6～24 h就受到顯著的抑制，說明它們可能在鹽脅迫早期即參與植物的響應(yīng)過程。與其他基因不同，BjuA014415在鹽處理6和12 h受到顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)該基因與其他基因在莖瘤芥相應(yīng)鹽脅迫過程中的功能不同。

2.7 莖瘤芥IPT基因在根腫菌脅迫下的表達(dá)分析

基于細(xì)胞分裂素在植物抗病方面的作用，為挖掘調(diào)控莖瘤芥在抗根腫病中可能發(fā)揮功能的IPT基因，選擇了18個(gè)在根中表達(dá)水平相對(duì)較高的IPT成員，檢測(cè)它們?cè)诟[菌處理后莖瘤芥根中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，大部分莖瘤芥IPT基因在12 h受到根腫菌侵染的顯著誘導(dǎo)，如BjuB006281、BjuA036403、BjuA014415、BjuB022918、BjuB002482、BjuB024133、BjuA046449、BjuB007352、BjuA001840、BjuA001839、BjuA016315和BjuB026254，說明這些IPT基因可對(duì)根腫菌侵染做出快速反應(yīng)；同時(shí)也有一些基因在侵染24～72 h表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。如BjuB022918和BjuB007352不僅在12 h被誘導(dǎo)表達(dá)，在24 h的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照；而BjuB024133雖然在12 h被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，但在72 h其表達(dá)水平則受到抑制(圖5)，說明該基因參與莖瘤芥對(duì)根腫菌侵染的響應(yīng)過程更為復(fù)雜。

3 討 論

目前已有多個(gè)物種的IPT家族基因被鑒定出來，如在水稻(Oryzasativa)[17]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[18]、麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)[19]、蘋果(Malusdomestica)[20]、白菜(Brassicarapa)[21]中分別鑒定到9、10、6、12、13個(gè)IPT家族成員。在莖瘤芥中鑒定到的IPT家族基因數(shù)目約為擬南芥和水稻的3倍，為白菜的2倍有余，這與莖瘤芥及其祖先在進(jìn)化過程中基因組擴(kuò)張有關(guān)。已有研究報(bào)道，在十字花科中，蕓薹屬植物由擬南芥進(jìn)化而來后又發(fā)生了一次基因組三倍化事件[22]，但白菜IPT基因數(shù)目遠(yuǎn)小于擬南芥的3倍，表明基因組三倍化后存在IPT基因的丟失[21]，而莖瘤芥作為白菜和黑芥異源雜交的變種在該進(jìn)化過程中又發(fā)生了一次染色體組加倍[23]，導(dǎo)致莖瘤芥IPT基因數(shù)目進(jìn)一步增加。此外，莖瘤芥A01染色體含有3個(gè)IPT基因，而白菜A01染色體僅含有2個(gè)IPT基因，推測(cè)基因的串聯(lián)重復(fù)也是導(dǎo)致莖瘤芥IPT基因數(shù)目進(jìn)一步增加的原因。由于不同IPT基因可能在合成細(xì)胞分裂素功能上存在冗余，加之莖瘤芥IPT基因的加倍化，后續(xù)對(duì)它們進(jìn)行功能研究需要著重考慮基因間功能互補(bǔ)產(chǎn)生的影響。

相比于其他組織，IPT3、IPT5和IPT7分支的絕大部分基因在根中的表達(dá)水平最高，可能與細(xì)胞分裂素主要在根部合成有關(guān)。在擬南芥和白菜中，同樣發(fā)現(xiàn)了這3個(gè)基因在根中的高表達(dá)[21, 24]，說明這3個(gè)亞家族的基因功能十分保守，均是根部細(xì)胞分裂素合成過程中的主要成員。

已有研究表明，鹽脅迫可導(dǎo)致擬南芥細(xì)胞分裂素含量降低，進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[25]。KNOX基因可以通過IPT3促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成，在玉米中，經(jīng)過鹽處理的根中差異表達(dá)的ZmKNOX基因絕大多數(shù)為下調(diào)表達(dá)，與本研究中鹽處理抑制大部分IPT基因的表達(dá)情況一致[26]。在擬南芥中，過表達(dá)IPT8后，植株活性氧含量增加，同時(shí)對(duì)鹽脅迫的耐受性降低[27]。在莖瘤芥中，鹽脅迫處理后，大部分IPT基因顯著下調(diào)表達(dá)，說明通過抑制IPT的表達(dá)來減少植株體內(nèi)細(xì)胞分裂素合成也是莖瘤芥響應(yīng)鹽脅迫的主要方式之一。

已有研究表明內(nèi)源或外源的細(xì)胞分裂素處理可增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性[28]，在擬南芥中過表達(dá)IPT1、IPT3、IPT5或IPT7均可以抑制病原菌Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000的生長(zhǎng)，此外，過表達(dá)IPT3還可使擬南芥在病原菌侵染后積累更多的胼胝體以抵御病原菌的侵害[29]。IPT作為合成細(xì)胞分裂素的主要基因同樣可能在莖瘤芥抗根腫病方面發(fā)揮功能。在檢測(cè)的莖瘤芥IPT家族基因中，大部分成員均在根腫菌侵染后上調(diào)表達(dá)，推測(cè)莖瘤芥在被侵染早期即可通過迅速增加內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量來抵御根腫菌的侵害。研究發(fā)現(xiàn)，根腫菌侵染白菜1 d后，根中的BrIPT1可被誘導(dǎo)表達(dá)8倍以上，與莖瘤芥大部分基因具有類似的被根腫菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)一致[30]。然而，莖瘤芥IPT1分支的基因在根中表達(dá)水平過低導(dǎo)致很難檢測(cè)得到，但多個(gè)其他分支的IPT基因在根部均受根腫菌侵染的顯著誘導(dǎo)，推測(cè)這些基因很可能與白菜BrIPT1一樣可在抵抗根腫菌侵染過程中發(fā)揮作用。

作者貢獻(xiàn)：蔡兆明和程春紅負(fù)責(zé)本研究的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃與執(zhí)行，廖靜靜負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)和部分結(jié)果分析，蔡兆明負(fù)責(zé)論文初稿寫作；王殿東是項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析以及論文的修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。