劉 婷， 王柏輝， 劉 暢， 段 艷， 蘇 琳， 田建軍， 素布達， 靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特010018 2 烏拉特中旗農(nóng)牧和科技局 內(nèi)蒙古巴彥淖爾015300）

反芻動物具有較為特殊的消化器官， 除了瘤胃，腸道也是重要的微生物發(fā)酵消化場所，起到營養(yǎng)物質(zhì)補償、參與機體的消化代謝的作用[1]。 胃和小腸消化后未被利用的淀粉、 纖維物質(zhì)以及一些不溶性蛋白等都能繼續(xù)進入大腸中發(fā)酵， 隨后產(chǎn)生葡萄糖、 揮發(fā)性脂肪酸等能為機體提供營養(yǎng)的能量物質(zhì)[2]。 Malmuthuge 等[3]發(fā)現(xiàn)飼喂不同飼糧會改變奶牛胃腸道菌群的組成及結(jié)構(gòu)， 斷奶前小奶牛大腸內(nèi)的細(xì)菌豐富度顯著高于小腸內(nèi)的細(xì)菌豐富度[4]。

有研究表明飼糧的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)對羊肉中氨基酸、脂肪酸的結(jié)構(gòu)和含量都有顯著影響[5]。 劉傳發(fā)等[6]發(fā)現(xiàn)牦牛后腸道內(nèi)有大量促進短鏈脂肪酸生成的益生微生物群， 進一步提高了食物中營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化率。趙方舟等[7]發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的干預(yù)能夠提高仔豬盲腸菌群的多樣性， 改變短鏈脂肪酸的含量并改善盲腸菌群結(jié)構(gòu)。 乳酸菌能增強動物機體免疫能力并起到抗氧化的功效[8]。 郭春燕等[9]在研究乳酸菌對反芻動物胃腸道中活菌比例、 揮發(fā)性脂肪酸含量的影響中發(fā)現(xiàn)： 瘤胃中外源乳酸菌能提高胃中總活菌比例。 本試驗采用高通量測序技術(shù)檢測腸道菌群菌落中的物種， 比較飼糧中添加乳酸菌對蘇尼特羊腸道細(xì)菌多樣性、 肉的理化感官指標(biāo)及營養(yǎng)品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物飼養(yǎng)及樣本采集 從烏拉特中旗農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)育種園區(qū)內(nèi)隨機選取12 只3～4月齡蘇尼特羊并將其分為2 組，每組6 只【公母各半，體質(zhì)量均為（16.94±1.29）kg】。

對照組：10 kg 精飼糧、8 kg 青貯飼糧和5 kg葵花餅；乳酸菌組：乳酸菌添加量為對照組總飼糧（精飼糧+青貯飼糧+葵花餅）的0.50%。 乳酸菌為乳安邦復(fù)合微生態(tài)制劑 （活菌數(shù)≥1.5×109CFU/g），其成分主要包括干酪乳桿菌HM-09、植物乳桿菌HM-10 （Lactobacillus casei HM-09、Lactobacillus plantarum HM-10）。

在90 d 飼喂后宰殺放血并采集500 g 蘇尼特羊背最長肌用于羊肉品質(zhì)分析； 蘇尼特羊盲腸糞便樣品用50 mL 無酶無菌離心管進行采集， 采集后直接貯存在干冰中， 盲腸樣品用作后期腸道微生物分析，所用樣品采集帶回后均保存在-80 ℃冰箱。

1.1.2 儀器與設(shè)備 5424R 高速臺式冷凍離心機，Eppendorf 公司； 氣相色譜GC-質(zhì)譜聯(lián)用儀MS、NanoDrop2000 超微量分光光度計，Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6C 電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmp700 型PCR 儀，ABI 公司；Illumina Miseq MISEQ 測序儀，Illumina 公司；固相微萃取頭，Supelco 公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 主要試劑及其來源 精飼糧， 恒牧飼糧科技有限公司；青貯飼糧、葵花餅為蒙古牧民自制；乳安邦，內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司；DNA抽提試劑盒，Omega Bio-Tek 公司；FastPfu 聚合酶，TransGen 公司；DNA 凝膠提取試劑盒，Axygen公司；土壤基因組DNA 提取試劑，MP 公司；37 種脂肪酸甲酯的混標(biāo)，Sigma 公司；正己烷、甲醇為色譜純級，其余試劑如無水硫酸鈉、氫氧化鈉、三氟化硼-乙醚絡(luò)合物、乙醚、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀和鹽酸均為國產(chǎn)分析純級， 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道微生物菌群的測定 按照DNA 提取試劑盒說明書提取微生物群落總DNA， 利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取的質(zhì)量，利用超微量分光光度計進行樣品DNA 濃度及純度測定；使用 （515F 和926R，515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；926 R：5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’） 對16S rDNA 基因V4-V5 可變區(qū)進行PCR 擴增。

Illumina Miseq 測序及后期優(yōu)化數(shù)據(jù)處理參照王柏輝[5]的方法。

1.2.2 營養(yǎng)品質(zhì)的測定 肉中脂肪酸的測定參照袁倩等[10]的方法；氨基酸的測定參照GB 5009.124-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》的方法。

1.2.3 感官品質(zhì)測定 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定參照李文博等[11]的方法；肉品質(zhì)基礎(chǔ)感官指標(biāo)及理化指標(biāo)（色差、pH 值、剪切力和熟肉率）的測定參照羅玉龍等[12]的方法。 在肉羊在屠宰后，用胴體直插式pH 計分別在45 min 和24 h 測定背最長肌的pH 值，記作pH45min和pH24h。 測定肉樣色澤時肌肉切成3 cm×3 cm×1 cm 的立方體，其中L*表示亮度值；a*表示紅度值；b*表示黃度值。 取50 g 左右的肉樣，在肉樣中心插入溫度計，在水浴鍋中85℃煮制40 min，待肉樣中心溫度達到75 ℃后吸去表面水分，按照下式計算熟肉率。

熟肉率（%）=m1/m2×100

式中，m1——煮前質(zhì)量，g；m2——煮后質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 22.0 版本軟件進行單因素方差分析及樣本t 檢驗。 飼喂乳酸菌后胃腸道菌群的Alpha 多樣性及Beta 多樣性利用FastTree 軟件進行統(tǒng)計分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群多樣性分析

由于反芻動物飼糧組成和機體能量代謝的不同， 腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化和肉中化學(xué)組成變化緊密相關(guān)[14]。 具有益生作用的飼糧能在反芻動物消化系統(tǒng)中建立有利于自身生長發(fā)育的優(yōu)勢菌群[15]。 同一品種的反芻動物在不同腸段的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)中均具有顯著差異性[16]，可能造成各個胃腸段的微生物群落豐度以及組成不同。

通過微生物物種豐富度和均勻度來表示腸道微生物多樣性，Shannon 指數(shù)越大細(xì)菌多樣性越高[17]，Ace 和Chao 1 指數(shù)越大，微生物群落豐富度越高[18]。 由表1 數(shù)據(jù)得出對照組與乳酸菌組的Shannon、Chao 1、Ace 指數(shù)具有顯著差異性（P＜0.05），試驗表明通過在飼糧中添加乳酸菌可以增加蘇尼特羊腸道微生物豐富度。 兩組樣品覆蓋深度約達到99%， 當(dāng)前測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種信息， 乳酸菌組微生物豐富度顯著高于對照組， 本研究基因序列質(zhì)量滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

表1 乳酸菌對蘇尼特羊瘤胃菌群α-多樣性的影響Table 1 Effect of lactic acid bacteria on the α-diversity of rumen microbe in Sunit sheep

2.2 腸道菌群群落組成分析

Beta 多樣性分析表示不同分組條件下樣本之間微生物結(jié)構(gòu)的相似性或差異性。 基于樣本屬水平分類，由共享菌群繪制的聚類熱圖1 可知，乳酸菌組和對照組的菌落能明顯區(qū)分開， 乳酸菌組主要以擬桿菌門、疣微菌門為主，根據(jù)兩組樣本部分有聚類的趨勢， 說明這兩組從腸道區(qū)系劃分都為盲腸，有一定的同源性和相似性。

圖1 兩組間共享屬聚類熱圖Fig.1 Shared genus cluster heatmap between two groups

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 菌群門水平分布 在門水平腸道主要物種組成豐度依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌 門（Actinobacteria）、變 形 菌 門（Proteobacteria），從表2 中可以看出12 個樣品的優(yōu)勢菌群均以厚壁菌門和擬桿菌門為主，這與杜瑞等[19]在研究盲腸微生物多樣性中的結(jié)果相同。 其中乳酸菌組的擬桿菌門及疣微菌門均顯著高于對照組（P＜0.05），厚壁菌門、放線菌門、變形菌門在兩組中無顯著差異。

表2 乳酸菌對蘇尼特羊盲腸菌群的影響（門水平，%）Table 2 Effect of lactic acid bacteria on the cecal flora of Sunit sheep （phylum level，%）

反芻動物胃腸道中擬桿菌門升高能夠減輕宿主食源性肥胖的癥狀， 因為擬桿菌門可以提高動物對碳水化合物的利用增加宿主體內(nèi)脂肪的降解速率[20]。 有研究表明在動物腸道菌群多樣性分析試驗中， 無論單胃還是多胃動物的胃腸道菌群內(nèi)都存在共性[21]。 蘇尼特羊腸道菌群內(nèi)容物中瘤胃菌屬占比大， 而一些瘤胃球菌屬能夠產(chǎn)生許多種碳水化合物降解酶， 具有降解碳水化合物的活性物質(zhì)[22]。 疣微菌門存在于不同腸段，其遺傳因子在不同部位有差異性表達， 可以使用數(shù)百種酶來消化藻類多糖，能夠獨自降解糖類營養(yǎng)物質(zhì)[23]。

變形菌門中主要包含大腸桿菌等致病菌[24]，試驗結(jié)果表明乳酸菌組中的變形菌門含量較少，添加乳酸菌后可能促進了放線菌門及疣微菌門的生長，一定程度上抑制了變形菌門的生長。

2.3.2 菌群屬水平分布 在屬水平腸道物種分布相對豐度大于1%的微生物主要有9 個屬，如表3所示， 兩組菌屬按照占比降序排列依次為克里斯滕森菌科R-7_group、擬桿菌屬、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌、瘤胃球菌屬UCG_013、 瘤胃球菌屬UCG_002、阿克曼菌屬等。

從本試驗驗結(jié)果總體來看， 腸道中乳酸菌組的物種豐富度較高， 其中擬桿菌屬和阿克曼菌屬較為突出，兩者豐度比例顯著高于對照組（P＜0.05），其功能不僅局限于發(fā)酵碳水化合物，還可能影響著代謝產(chǎn)物和免疫之間的平衡。 阿克曼菌屬可以合成糖苷酶降解黏蛋白， 其菌膜上具有一種耐高溫的細(xì)菌蛋白能抑制過度肥胖的發(fā)生，腸腔內(nèi)產(chǎn)生的丙酸和丁酸作用于G 蛋白偶聯(lián)受體起到改善宿主對營養(yǎng)物質(zhì)吸收、 脂肪酸沉積以及轉(zhuǎn)運代謝等功能， 進一步基于腸道菌群提高羊肉品質(zhì)[25]。 克里斯滕森菌科、瘤胃球菌屬于厚壁菌門，乳酸菌組與對照組之間二者豐度無顯著差異，在動物腸道及黏膜中廣泛存在， 前者促進宿主脂肪代謝沉積[26]，后者主要發(fā)酵代謝產(chǎn)物為乙酸和甲酸， 以瘤胃球菌屬為主的腸型中細(xì)菌主要靠吸收單糖和降解黏蛋白來獲取能量。瘤胃球菌屬、消化鏈球菌科均會產(chǎn)生短鏈脂肪酸， 短鏈脂肪酸除了能作為能源物質(zhì)， 還能隨著血液到肌肉組織當(dāng)中降低肉的pH 值[27]。對照組中另枝菌屬豐度顯著高于乳酸菌組（P＜0.05），另枝菌屬對動物疾病和精神健康有著重要的作用， 研究表明高脂飲食（HFD）能促進另枝菌屬中2 種與結(jié)直腸癌有關(guān)的致病菌富集，在大腸癌中具有致病性[28]。 從表3 分析可知， 與對照組相比飼喂乳酸菌能提高蘇尼特羊盲腸中有益菌屬的豐度。 有研究表明羊肉中的脂肪沉積與擬桿菌屬和厚壁菌屬的比例有著密切的關(guān)系， 菌的代謝產(chǎn)物能進一步調(diào)控脂代謝途徑相關(guān)基因，繼而影響脂肪沉積水平[29]。 吳瓊等[30]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在草原紅牛瘤胃菌群功能預(yù)測中，糖代謝、氨基酸代謝相關(guān)的基因較為富集，可能與相關(guān)微生物含有大量的木質(zhì)纖維素降解酶基因有關(guān)。

表3 乳酸菌對蘇尼特羊盲腸菌群的影響（屬水平，%）Table 3 Effect of lactic acid bacteria on the cecal flora of Sunit sheep （genus level， %）

2.4 乳酸菌對蘇尼特羊肉品質(zhì)的影響

肉的pH 值對胴體肌肉中蛋白質(zhì)降解、 細(xì)菌繁殖、肉色、系水力等指標(biāo)均有影響。 宰后肌肉活動的主要能量來源取決于糖原和磷酸肌酸的分解，其分解產(chǎn)物分別是乳酸、磷酸和肌酸。 由于酸性物質(zhì)會在肌肉中貯存， 最終導(dǎo)致肌肉的pH 值下降，測定pH 值時間分別為45 min 和24 h。 PSE肉是指動物宰后肌肉出現(xiàn)色澤灰白（pale）、質(zhì)地松散（soft）和肉表面滲水（exudative），DFD 肉是指動物宰后肌肉顏色暗黑（dark）、質(zhì)地堅硬（firm）和表面干燥（dry），二者均是劣質(zhì)肉的主要表現(xiàn)。 pH45min可以鑒別生理正常肉和PSE 肉。而pH24h可以反映羊肉是否成為了DFD 肉，乳酸菌能夠在反芻動物瘤胃中進行定植并與其它菌群互作， 生長繁殖過程中還能產(chǎn)生乳酸等酸性代謝產(chǎn)物， 不斷增強腸道蠕動，使鈣、鎂等營養(yǎng)元素處于較易吸收的離子狀態(tài)。此外，乳酸菌在動物消化系統(tǒng)中會生成一部分活性物質(zhì)供機體更好地吸收代謝礦物質(zhì)元素，如活性肽， 能夠通過協(xié)同螯合作用增加無機鈣、鎂、鐵離子的含量，最終使畜禽肉中鈣、鎂蓄積[31]。乳酸菌對蘇尼特羊肉中pH 值的影響， 如表4 所示。 乳酸菌組pH24h值顯著低于對照組，說明乳酸菌可以產(chǎn)生一些酸性代謝產(chǎn)物， 可能增加羊肉中有機微量礦物質(zhì)含量。

肌肉色澤， 可以作為直觀評價肉品好壞的指標(biāo)。 肌肉顏色變化主要是受到血紅素的狀態(tài)以及鐵離子的氧化還原程度的影響， 鐵離子的氧化還原能夠引起3 種肌紅蛋白（Mb）的轉(zhuǎn)化，并在低氧分壓下與氧結(jié)合生成MbO2， 使得肉色呈鮮紅色。然而隨著年齡的增加以及飼糧的不同， 動物的肉色會發(fā)生變化。 機體內(nèi)能夠自身產(chǎn)生多種抗氧化酶，能夠保護機體免受自由基的損傷，自由基數(shù)量的減少能夠保護肌肉中含磷脂的細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化的傷害， 延緩分割肉中肌紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白的速率[32]。 在乳酸菌的背最長肌的a*值和L*值略高于對照組，b*值在兩組中均無顯著差異（P＞0.05），說明飼喂乳酸菌可以減緩肉色變暗的速度，使得肉質(zhì)顏色更加鮮紅。

肉的嫩度是指肉易切割的程度， 肉的嫩度主要取決于肌肉組織中肌纖維類型的基因表達及肌纖維的類型組成。 pH 值、離子強度和某些外源性酶類都能夠影響肌纖維中的肌球蛋白， 使其發(fā)生改變。有研究表明肌原纖維的形態(tài)、結(jié)締組織以及肌內(nèi)脂肪的含量對肉的嫩度有著重要的影響[33]。肌肉嫩度增加， 肉質(zhì)口感變好是由于肌纖維的密度降低，肌肉組織結(jié)構(gòu)較為松散所導(dǎo)致[34]。 乳酸菌組的剪切力顯著低于對照組（P＜0.05），肉的剪切力值越小，嫩度則越大。飼喂乳酸菌可以改善羊肉的嫩度， 可能是乳酸菌通過調(diào)整蘇尼特羊腸道菌群結(jié)構(gòu)，影響脂肪酸代謝，進而使肉中脂肪沉積。

熟肉率也是評價肉品質(zhì)指標(biāo)之一， 熟肉率越高，表明加熱后肉的失重少，水分流失少，縮水率低，乳酸菌組與對照組的熟肉率均無顯著差異（P＞0.05）。

風(fēng)味作為肉的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)能直接影響消費者對羊肉接受程度。 風(fēng)味由各種有機小分子揮發(fā)性物質(zhì)共同形成，主要包括醛、醇、酮、酯、硫類化合物等[35]。 如表4 所示，醇、醛兩類占比最大，乳酸菌組烴類、酮類、酯類以及其它風(fēng)味物質(zhì)均顯著高于對照組（P＜0.05），乳酸菌組的揮發(fā)性風(fēng)味成分優(yōu)于對照組，使得羊肉的風(fēng)味品質(zhì)更好[36]。

表4 乳酸菌對蘇尼特羊肉感官及營養(yǎng)指標(biāo)的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria on sensory and nutritional indexes of Sunit sheep

氨基酸是肉香味的前體物質(zhì)以及呈味物質(zhì)，其種類和比例能衡量羊肉的營養(yǎng)價值， 并維系人體的正常的生命活動。 氨基酸在加熱條件下經(jīng)過脫羧、 脫氨等化學(xué)反應(yīng)， 最終分解形成呈味氨基酸，刺激人體味覺傳感器使其具有甜味、苦味、鮮味和酸味， 一般熟知的呈特殊鮮味的氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6 種[37]。 由表5 可知，乳酸菌組的總氨基酸含量顯著高于對照組，羊肉的營養(yǎng)品質(zhì)得到提高。

表5 乳酸菌對蘇尼特羊肉營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 5 Effect of lactic acid bacteria on nutritional quality of Sunit sheep

必需脂肪酸是人體維持正常代謝不可缺少的，同時必須通過食物供給的脂肪酸，其中n-3 系列多不飽和脂肪酸 （PUFA） 主要包括α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等。 乳酸菌組中PUFA 以及n-3 PUFA 的含量顯著高于對照組（P＜0.05），乳酸菌組中EPA的含量顯著高于對照組（P＜0.05），n-3 多不飽和脂肪酸能通過不同代謝途徑降低人體血清中低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平， 預(yù)防人體心血管疾病和炎癥的發(fā)生。 花生四烯酸（AA）屬于n-6 系列多不飽和脂肪酸， 影響著機體骨代謝以及肉中風(fēng)味物質(zhì)的形成， 乳酸菌組AA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。 本研究中乳酸菌組中多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸顯著高于對照組 （P＜0.05），這與乳酸菌影響腸道菌群代謝產(chǎn)物調(diào)控脂肪酸代謝有關(guān)。

3 結(jié)論

飼糧中添加乳酸菌會使蘇尼特羊腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 而腸道菌群代謝產(chǎn)物的改變繼而影響肉品質(zhì)。 整體上乳酸菌組腸道微生物豐富及均勻度更高， 門水平厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌群， 屬水平擬桿菌屬和阿克曼菌屬豐度高且均與脂肪代謝有關(guān)， 在飼糧中添加乳酸菌還可以顯著提高肉的a*紅度值、L*亮度值、 降低肉的剪切力、提高肌肉中風(fēng)味物質(zhì)、氨基酸以及不飽和脂肪酸的含量，起到改善羊肉品質(zhì)的效果。