張 俊，陳夢佳，閆 茜，陳莫斯楠，李政達，盧嘉卡，石德順，陸鳳花 (廣西大學 動物科學技術(shù)學院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004)

在卵泡發(fā)育研究中，大多數(shù)研究者都集中在顆粒細胞上，而關(guān)于內(nèi)膜細胞(theca cells，TCs)的研究相對較少。TCs在卵泡發(fā)育中起至關(guān)重要作用，一方面TCs在卵泡生長發(fā)育過程中起物理支撐作用，另一方面TCs在促黃體素(LH)作用下合成雄激素作為顆粒細胞合成雌激素的底物[1-7]，而合成卵泡發(fā)育所需雄激素是TCs的主要功能。關(guān)于低氧培養(yǎng)對動物干細胞和生殖細胞功能的影響，目前已有諸多研究報道。有研究表明，低氧能提高水牛脂肪間充質(zhì)干細胞增殖、干性維持和重編程效率[8]。也有研究報道，低氧可激活HIF-TWIST信號通路軸進而提高水牛骨髓間充質(zhì)干細胞間質(zhì)特性維持[9]。更有研究顯示，低氧能促進水牛早期胚胎的體外發(fā)育[10]。但低氧對水牛卵泡TCs雄激素合成的影響，目前尚未見有報道。本研究通過低氧條件培養(yǎng)水牛TCs，探討低氧對水牛TCs雄激素合成相關(guān)基因表達和雄激素分泌水平的影響，進而研究低氧對水牛TCs雄激素合成能力影響以及其調(diào)控機制，以期從低氧培養(yǎng)角度為進一步研究水牛卵泡發(fā)育類固醇激素分泌機制提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制細胞培養(yǎng)基(DMEM)和血清(FBS)購自Gibco公司；其他試劑無特別說明均購自Sigma公司。細胞培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS+60 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素，用0.22 μm 微孔濾膜濾器過濾。

1.2 材料來源及處理

1.2.1水牛卵巢的收集 從南寧市屠宰場收集中國沼澤型水牛卵巢，收集后放置盛有37℃生理鹽水的保溫瓶，確保2～3 h內(nèi)送達實驗室。75%酒精浸泡30 s，眼科剪刀將卵巢周圍的脂肪組織去除，高壓過生理鹽水清洗2～3次。注意只選取卵泡直徑8～10 mm、血管豐富的健康卵泡進行水牛TCs的分離培養(yǎng)試驗。

1.2.2水牛TCs的分離培養(yǎng) 用眼科剪刀和鑷子將水牛卵巢大卵泡對半剪開，再用鑷子將卵泡內(nèi)膜輕輕撕開。將撕下的內(nèi)膜組織置于雙抗鹽酸鹽緩沖液(PBS)，用1 mL槍頭(剪去槍頭尖端部分)反復(fù)吹打內(nèi)膜層組織，PBS清洗2～3次，0.25%胰蛋白酶消化10 min，用細胞培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS)終止消化，用1 mL槍頭輕輕吹打去掉內(nèi)膜層黏附的顆粒細胞。用PBS清洗2～3次，0.3%膠原蛋白酶Ⅱ消化45 min，移液槍反復(fù)吹打直至內(nèi)膜層完全溶解，最后用細胞培養(yǎng)基終止膠原酶消化。將所獲得細胞懸液用孔徑40 μm細胞篩過濾，并收集到離心管，1 200 r/min離心3 min，棄上清后用PBS重懸清洗細胞，如此反復(fù)1次，最后將清洗干凈的水牛TCs接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)(DMEM+10% FBS)。選取第3代生長狀態(tài)良好水牛TCs，傳至12孔板中，確保每孔細胞貼壁后匯合度至少達到80%，進行后續(xù)低氧培養(yǎng)相關(guān)試驗。

1.3 細胞免疫熒光將水牛原代TCs接種到4孔板分別在常氧(20% O2)和低氧(5% O2)條件下進行培養(yǎng)約48 h，待細胞匯合度達到80%左右，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min；阻斷液(含100 mmol/L甘氨酸和0.3% BSA的PBS)清洗3次，加入1% Tritonx-100室溫透化15 min；5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h；TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗3次，加入一抗4℃孵育過夜；第2天室溫孵育30 min，TBP清洗3次，加入二抗室溫孵育1 h；TBP清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時定量RT-PCR使用TRIzol試劑裂解已收集的水牛TCs，氯仿和異丙醇抽提，75%酒精清洗，DEPC水溶解即得到細胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ RT Super Mix合成cDNA，SYBP Premix Ex TaqTMⅡ試劑進行qRT-PCR。所用引物序列如表1所示，使用GAPDH作為內(nèi)參基因標準化其他基因表達。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)收集水牛TCs培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明書(江蘇晶美生物科技有限公司)要求進行樣品預(yù)處理和后續(xù)步驟，用酶標儀檢測D450值。根據(jù)所做標準曲線圖，求出水牛TCs培養(yǎng)液睪酮含量。

表1 水牛TCs qRT-PCR引物序列及條件反應(yīng)

1.6 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 22.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行處理并分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，同一試驗處理中用相互獨立的水牛TCs進行至少3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 水牛卵泡TCs的分離、培養(yǎng)和鑒定直徑在8～10 mm之間的水牛卵泡用于分離水牛TCs(圖1A)，結(jié)果顯示：水牛原代TCs貼壁后呈現(xiàn)成纖維細胞狀，傳代5次后，仍能保持典型TCs形態(tài)(圖1B)；免疫熒光試驗表明水牛TCs能表達其特異性蛋白CYP17A1(圖1C)。 由此說明，本研究所分離獲得細胞為高純度水牛TCs，可作為后續(xù)研究的試驗材料。

A.直徑8 ～ 10 mm竇狀健康卵泡用于分離水牛TCs；B.原代水牛TCs以及第1～5代水牛TCs貼壁后細胞生長狀態(tài)；C.細胞免疫熒光顯示水牛TCs表達其特異性蛋白CYP17A1

2.2 低氧對水牛TCs形態(tài)的影響水牛TCs分別在常氧(normoxia，20% O2)和低氧條件(hypoxia，5% O2)下培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察水牛TCs的細胞形態(tài)。結(jié)果顯示(圖2)：相對常氧組(20% O2)，低氧組(5% O2)水牛TCs細胞形態(tài)與常氧組水牛TCs細胞形態(tài)基本沒有變化。由此說明，低氧(5% O2)對水牛TCs細胞形態(tài)沒有明顯影響。

圖2 常氧和低氧條件下水牛TCs的細胞形態(tài)

2.3 低氧對水牛TCs雄激素合成相關(guān)基因表達的影響水牛TCs分別在常氧(20% O2)和低氧條件(5% O2)下培養(yǎng)48 h后，qRT-PCR檢測水牛TCs雄激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和Star)表達情況。結(jié)果顯示(圖3)：相對常氧組(20% O2)，低氧組(5% O2)水牛TCs顯著上調(diào)雄激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表達(P<0.05)，但顯著下調(diào)Star表達(P<0.05)。由此說明，低氧(5% O2)能提高水牛TCs雄激素合成相關(guān)基因的表達。

注：字母不同均表示差異顯著(P<0.05)；字母相同均表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 低氧對水牛TCs雄激素分泌水平的影響水牛TCs分別在常氧(20% O2)和低氧條件(5% O2)下培養(yǎng)48 h后，ELISA檢測水牛TCs培養(yǎng)液中睪酮分泌水平。結(jié)果顯示(圖4)：相對常氧組(20% O2)，低氧組(5% O2)水牛TCs顯著提高培養(yǎng)液中睪酮的分泌水平(P<0.05)。由此說明，低氧(5% O2)能提高水牛TCs雄激素睪酮的分泌水平。

圖4 ELISA檢測水牛TCs培養(yǎng)液中睪酮分泌水平

2.5 低氧影響水牛TCs對LH的敏感性水牛TCs分別在常氧(20% O2)和低氧條件(5% O2)下培養(yǎng)48 h后，qRT-PCR檢測水牛TCs促黃體素受體基因LHR的表達。結(jié)果顯示(表5)：相對常氧組(20% O2)，低氧組(5% O2)水牛TCs顯著上調(diào)促黃體素受體基因LHR表達(P<0.05)。由此說明，低氧(5% O2)能增強水牛TCs對LH激素的敏感性。

圖5 qRT-PCR檢測水牛TCs促黃體素受體基因LHR表達

3 討論

水牛是我國南方主要大家畜之一，因其具有適應(yīng)性強、耐高溫、耐高濕、抗病力強、耐粗飼易飼養(yǎng)、乳品價值高和使用年限長等生物學特性，而具有巨大經(jīng)濟效益和社會效益[11-15]。然而目前水牛存在繁殖率低，種群生產(chǎn)性能低下等問題，因此，開展水牛卵泡發(fā)育激素分泌機制相關(guān)研究可為提高水牛繁殖力以及加快水牛遺傳改良步伐等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

根據(jù)雙細胞-雙促性腺激素理論，卵巢內(nèi)雄激素主要由TCs分泌，在LH的作用下，TCs分泌雄激素進入顆粒細胞，促卵泡素刺激顆粒細胞芳香化酶活性，在該酶催化下雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素[16-17]。TCs合成雄激素是在LH調(diào)控下，細胞表達雄激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和Star，其中CYP17A1編碼雄激素合成的限速酶[2,4,18-20]。本研究結(jié)果表明，低氧不但提高水牛TCs雄激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP17A1和3β-HSD表達，而且促進水牛TCs培養(yǎng)液中睪酮分泌水平。該結(jié)果說明低氧能提高水牛TCs雄激素的合成能力，這與顆粒細胞條件液影響水牛TCs雄激素合成的研究結(jié)果類似[21]。

TCs合成雄激素主要由LH調(diào)控，TCs對LH的敏感性可影響其合成雄激素的能力[22-24]。LH調(diào)控TCs雄激素合成和分泌水平呈劑量依賴性，適當劑量LH能調(diào)控雄激素合成相關(guān)基因表達和雄激素分泌水平[25-26]。本研究結(jié)果顯示，低氧能提高水牛TCs促黃體素受體LHR表達，即說明低氧可增強水牛內(nèi)膜細胞對LH的敏感性，該結(jié)果也與顆粒細胞影響TCs雄激素合成能力的研究結(jié)果類似[21,27]。綜合上述研究表明，低氧通過增強水牛TCs對LH的敏感性進而提高水牛TCs雄激素的合成能力。

有研究報道，在TCs合成類固醇激素的生理過程中，首先LH與LH受體結(jié)合，然后激活PI3K/AKT信號通路，進而促進TCs雄激素的合成[28-30]。那么低氧調(diào)控水牛TCs雄激素合成中，低氧啟動HIF信號通路后，是否是通過激活PI3K/AKT信號通路進而促進水牛TCs雄激素合成，這是本課題組下一步重點研究內(nèi)容。隨著低氧調(diào)控水牛TCs雄激素合成機制研究的不斷深入，將為進一步研究水牛TCs雄激素分泌機制提供理論依據(jù)。