郭林霞，李樹鵬，趙國(guó)先 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000)

近年來(lái)，由于抗菌類藥物的使用不當(dāng)、飼料中霉菌毒素的影響以及免疫抑制病的廣泛存在，使得動(dòng)物免疫抑制越來(lái)越嚴(yán)重，很大程度上阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。因此，為了消除或緩解免疫抑制、提高機(jī)體抗病力、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，免疫增強(qiáng)劑得以廣泛運(yùn)用。腸道是體內(nèi)最大的淋巴組織，腸道免疫作用主要通過(guò)腸黏膜屏障(機(jī)械、化學(xué)、生物和免疫屏障)功能實(shí)現(xiàn)，其中機(jī)械屏障是腸黏膜屏障中最重要的屏障，緊密連接是維持機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]，由黏蛋白構(gòu)成的黏液層覆蓋腸上皮細(xì)胞，對(duì)緊密連接具有保護(hù)作用。有研究表明，免疫抑制會(huì)導(dǎo)致畜禽腸黏膜受損，緊密連接蛋白的表達(dá)量降低，腸通透性增加[3-4]，而植物多糖則可以有效修復(fù)這種損傷，但是目前棗多糖提取物(jujube polysaccharide extract,JPE)對(duì)蛋雛雞腸黏膜緊密連接蛋白的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)旨在通過(guò)探究JPE對(duì)環(huán)磷酰胺(Cy)所致的免疫抑制蛋雛雞空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響，為JPE作為免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)材料1日齡京紅1號(hào)蛋雛雞，由河北環(huán)山農(nóng)牧有限公司提供；JPE采用水提醇沉法提取[5]，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[6]，純度為21.73%。相對(duì)分子質(zhì)量為27.4 kDa，由森博材料技術(shù)研發(fā)中心檢測(cè)(液相色譜法)；單糖組成為葡萄糖(43.46%)、果糖(19.95%)、阿拉伯糖(16.45%)、半乳糖(8.35%)、半乳糖醛酸(3.71%)、木糖(3%)、甘露糖(2.8%)、鼠李糖(1.52%)、海藻糖(0.53%)和葡萄糖醛酸(0.24%)，由武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司進(jìn)行測(cè)定(液相色譜法)；Cy純度98%，購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，另設(shè)空白對(duì)照組(BC組)，選取體質(zhì)量相近且健康的1日齡京紅1號(hào)蛋雞750只，適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25只雞。Ⅰ組為空白對(duì)照組，在7～9日齡時(shí)皮下注射0.35 mL 生理鹽水，飼喂基礎(chǔ)日糧。Ⅱ～Ⅴ組在8～10日齡時(shí)皮下注射100 mg/kg Cy[7]，1次/d，誘導(dǎo)腸黏膜屏障損傷。分別在基礎(chǔ)日糧中添加0，400，800和1 600 mg/kg JPE[8-9]，試驗(yàn)期為5周?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

1.3 飼養(yǎng)管理進(jìn)雛前對(duì)雞舍進(jìn)行全面沖洗及消毒。試驗(yàn)過(guò)程按養(yǎng)雞場(chǎng)的常規(guī)管理程序進(jìn)行免疫、驅(qū)蟲、采光和通風(fēng)。采食方式、飲水方式和雞群密度按雞場(chǎng)程序調(diào)整。各組均勻分布于4層階梯式雞籠，消除位置引起的誤差。試驗(yàn)期內(nèi)每天08:00和15:00各喂1次料，自由采食和飲水。每天觀察雞群健康狀況，記錄死雞和病雞數(shù)量。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1空腸分泌因子含量 于試驗(yàn)的最后1 d從每個(gè)重復(fù)中選取1只與平均體質(zhì)量相近的雞，頸部放血致死，剖開(kāi)腹腔，迅速截取3 cm左右回腸，用生理鹽水沖洗干凈，放入凍存管中，-80℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行IL-1β和TNF-α含量測(cè)定。

1.4.2空腸緊密連接蛋白和黏蛋白的表達(dá)量 樣品采集如上1.4.1，利用TRIzol法提取總RNA，電泳檢測(cè)質(zhì)量，使用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，每組3個(gè)重復(fù)。參考GenBank雞Occludin、Claudins-1、ZO-1和Mucin-2基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以GAPDH為內(nèi)參基因。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物信息見(jiàn)表2。

表2 引物信息

2 結(jié)果

由表3可知，就Claudin-1表達(dá)量而言，與Ⅰ組比，Ⅱ～Ⅴ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ～Ⅴ組表達(dá)升高，其中Ⅲ組差異顯著(P<0.05)，其他差異極顯著(P<0.01)；Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)比Ⅲ組高，Ⅳ和Ⅴ組組間差異不顯著(P>0.05)。對(duì)Occludin而言，與Ⅰ組比，Ⅱ和Ⅲ組降低(P<0.01)，Ⅳ和Ⅴ組升高(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅳ和Ⅴ組升高(P<0.01)；Ⅳ和Ⅴ組比Ⅲ組高(P<0.01)；其他組間差異不顯著(P>0.05)。對(duì)ZO-1而言，組間差異不顯著(P>0.05) 。

表3 JPE對(duì)免疫抑制蛋雛雞空腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響

由表4可知，對(duì)Mucin-2表達(dá)量而言，與Ⅰ組比，Ⅳ和Ⅴ組表達(dá)升高(P<0.05)；與Ⅱ組比，Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)升高；Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)比Ⅲ組高；其他組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 JPE對(duì)免疫抑制蛋雛雞空腸黏蛋白mRNA表達(dá)量的影響

由表5可知，就IL-1β表達(dá)量而言，與Ⅰ組比，Ⅳ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ(P<0.05)和Ⅳ組(P<0.01)降低；Ⅴ組比Ⅲ和Ⅳ組高(P<0.01)，Ⅲ組比Ⅳ組高(P<0.05)；其他組間差異不顯著(P>0.05)。就TNF-α而言，與Ⅰ組比，Ⅲ和Ⅳ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ和Ⅳ組降低(P<0.01)；Ⅴ組比Ⅲ(P<0.01)和Ⅳ組(P<0.05)高；其他組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 JPE對(duì)免疫抑制蛋雛雞空腸IL-1β和TNF-α的影響 ng/g

3 討論

機(jī)械屏障是腸黏膜屏障中最重要的屏障，緊密連接是其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]。緊密連接是一種不通透連接，只允許水分和離子選擇性通過(guò)，有效抑制腸道病原微生物、有害大分子等的入侵，有效保護(hù)腸黏膜屏障的完整性[10-11]。細(xì)胞間的緊密連接蛋白的表達(dá)量越高，腸通透性越低[12]，腸道通透性增加則會(huì)使腸道免疫系統(tǒng)接觸到外來(lái)抗原，進(jìn)而影響免疫屏障功能；緊密連接蛋白表達(dá)受阻會(huì)破壞腸黏膜屏障的完整性，造成營(yíng)養(yǎng)代謝功能障礙，從而抑制畜禽生長(zhǎng)[13]。

研究表明，Cy可以抑制ZO-1、Occludin和 Claudin-1 mRNA 表達(dá)[3-4]，本試驗(yàn)結(jié)果與此基本一致，說(shuō)明Cy可以通過(guò)增加黏膜細(xì)胞間的通透性，破壞腸道的完整性，進(jìn)而增加局部免疫系統(tǒng)接觸外來(lái)抗原的可能性，破壞腸道免疫系統(tǒng)。另外有研究表明，魷魚墨多糖可以顯著增加ZO-1和Occludin的mRNA表達(dá)量[4]，冬蟲夏草多糖[14]、火麻仁多糖[3]、海藻多糖[15]、白術(shù)多糖和牛膝多糖等[16]均顯著增加腸道Occludin、ZO-1和Claudin-1的基因表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Cy組比，中高劑量組的Occludin和 Claudin-1表達(dá)量均顯著增加，說(shuō)明JPE可以通過(guò)促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)降低腸道的通透性，與上述結(jié)果一致。中高劑量JPE組的Occludin恢復(fù)到了BC組水平，即JPE對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的影響與劑量有關(guān)，800～1 600 mg/kg效果最好。

促炎因子IL-1β和TNF-α?xí)?dǎo)致腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)和分布發(fā)生變化，引起腸道通透性增加[17]。為了驗(yàn)證JPE對(duì)緊密連接蛋白的促進(jìn)作用是否與IL-1β、TNF-α有直接關(guān)系，本試驗(yàn)測(cè)定了腸道中這2種細(xì)胞因子的含量。YING等[18]在試驗(yàn)8～10 d給小鼠注入80 mg/kg的Cy，模型組小腸中IL-1β、TNF-α及緊密連接蛋白表達(dá)量均顯著降低。本試驗(yàn)中Cy對(duì)IL-1β和TNF-α的分泌均沒(méi)有顯著影響，與緊密連接蛋白的變化不一致。得出Cy對(duì)腸道通透性的影響可能與IL-1β和TNF-α的分泌無(wú)關(guān)，具體機(jī)理還需進(jìn)一步探討。尚慶輝等[6]研究表明，500 mg/kg苜蓿多糖可顯著降低仔豬空腸和回腸TNF-α和IL-1α的表達(dá)量，顯著提高小腸各段Occludin以及回腸ZO-1表達(dá)量；400,600 mg/L 的沙棘多糖顯著升高Occludin、ZO-1和Claudin-1表達(dá)量同時(shí)顯著降低IL-1β和TNF-α的水平[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Cy組比，低中劑量JPE組的IL-1β和TNF-α表達(dá)量顯著降低，與上述結(jié)果相似。且JPE各個(gè)劑量組IL-1β和TNF-α的含量均達(dá)到了BC組水平，且就TNF-α含量而言，添加量為400～800 mg/kg效果較好； IL-1β含量隨著JPE添加量的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，即存在最佳添加量(800 mg/kg)。

黏蛋白是構(gòu)成腸道化學(xué)屏障的重要骨架，由杯狀細(xì)胞分泌[20]。由黏蛋白構(gòu)成的黏液層覆蓋在腸上皮細(xì)胞上，對(duì)緊密連接具有保護(hù)作用[21]。付羽萍等[22]試驗(yàn)顯示，Cy對(duì)小鼠空腸和回腸中Mucin-2 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響，本試驗(yàn)結(jié)果也是如此。而薛然等[3]和BAI等[23]試驗(yàn)顯示，Cy使小鼠腸道中Mucin-2的表達(dá)水平降低，可能與Cy的注射時(shí)間及濃度有關(guān)。研究表明，滸苔多糖[24]和龍眼肉多糖[23]均可以促進(jìn)小鼠腸道黏蛋白Mucin-2 mRNA表達(dá)；苜蓿多糖[6]可以提高仔豬空腸和回腸Mucin-2 mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Cy組比，中高劑量JPE組Mucin-2 mRNA表達(dá)顯著升高，由此說(shuō)明，JPE可以提高腸黏膜化學(xué)屏障功能，與上述結(jié)果一致。JPE的各個(gè)劑量組均達(dá)到了BC組水平，且JPE的劑量為800～1 600 mg/kg時(shí)效果較好。

JPE對(duì)黏蛋白的影響與緊密連接蛋白變化基本一致，說(shuō)明JPE可能通過(guò)提高M(jìn)ucin-2 mRNA表達(dá)來(lái)保護(hù)緊密連接，維持腸黏膜屏障的完整性。