李林杰 謝譚芳 王昱涵 王志萍 黎芳 王孝勛 馮橋

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）04-0439-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.10

摘 要 目的 建立壯藥金母顆粒的指紋圖譜并進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，并測(cè)定其中3種成分的含量。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法，以蘆丁為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》繪制10批金母顆粒的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià);通過(guò)與混合對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確定共有峰;采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析，以變量重要性投影（VIP）值>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選影響金母顆粒質(zhì)量的標(biāo)志成分;采用HPLC法測(cè)定金母顆粒中落新婦苷、虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果 10批金母顆粒共有22個(gè)共有峰，相似度為0.962～0.997;共指認(rèn)出5個(gè)共有峰，分別為沒食子酸（2號(hào)峰）、虎杖苷（9號(hào)峰）、蘆?。?1號(hào)峰）、落新婦苷（13號(hào)峰）、山柰酚（20號(hào)峰）。聚類分析結(jié)果顯示，10批金母顆?？删蹫?類，S1、S3～S4聚為一類，S5～S6、S9聚為一類，S2、S7～S8、S10聚為一類;主成分分析結(jié)果顯示，模型解釋參數(shù)為0.951，預(yù)測(cè)能力參數(shù)為0.723，分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。正交偏最小二乘-判別分析的分類結(jié)果也與聚類分析結(jié)果基本一致，VIP值>1的共有峰依次為7號(hào)峰、11號(hào)峰（蘆?。?、17號(hào)峰、13號(hào)峰（落新婦苷）、3號(hào)峰、8號(hào)峰、6號(hào)峰、16號(hào)峰。落新婦苷、虎杖苷、鹽酸小檗堿檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.012 6～1.225 0、0.010 8～1.052 5、0.020 0～1.562 5 mg/mL（R 2均為0.999 9），精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%，平均加樣回收率分別為99.48%（RSD=2.67%，n=9）、98.57%（RSD=1.77%，n=9）、100.84%（RSD=2.49%，n=9），含量分別為1.221 0～7.011 6、2.251 1～4.462 9、1.252 4～3.328 7 mg/g。結(jié)論 所建指紋圖譜和含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，可用于壯藥金母顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 壯藥;金母顆粒;高效液相色譜法;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析;正交偏最小二乘法-判別分析;含量測(cè)定

Establishment of fingerprint， chemometric analysis and multi-component content determination of Zhuang medicine Jinmu granules

LI Linjie1，2，XIE Tanfang1，2，WANG Yuhan1，2，WANG Zhiping1，2，LI Fang1，2，WANG Xiaoxun1，F(xiàn)ENG Qiao3（1. School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China; 2. Key Laboratory of Generic Technology Research and Development of Traditional Chinese Medicine Preparations in Colleges and Universities in Guangxi， Nanning 530200， China; 3. Dept. of Dermatology， Guangxi International Zhuang Medicine Hospital， Nanning 530200， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish the fingerprint of Zhuang medicine Jinmu granules and carry out chemometric analysis， and determine the contents of three components. METHODS High performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted. Using rutin as the reference， HPLC fingerprints of 10 batches of Jinmu granules were drawn and similarity evaluation was performed by Similarity Evaluation of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2012 edition）; the common peak was determined by comparing with mixed control; SPSS 21.0 software was used for cluster analysis， and SIMCA 14.1 software was used for principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis. The differential components affecting the quality of Jinmu granules were screened by taking the variable? importance in projection （VIP） value >1 as the standard; the HPLC method was used to determine the contents of astilbin， polydatin and berberine hydrochloride in Jinmu granules. RESULTS There were 22 common peaks in 10 batches of Jinmu granules， and the similarities were 0.962-0.997; five common peaks were identified， namely gallic acid （peak 2）， polydatin （peak 9）， rutin （peak 11）， astilbin （peak 13） and kaempferol （peak 20）. The results of cluster analysis showed that 10 batches of Jinmu granules could be clustered into 3 categories： S1 and S3-S4 were grouped into one category; S5-S6 and S9 were grouped into one category; S2， S7-S8 and S10 were grouped into one category. The results of principal component analysis showed that the parameter of model interpretation was 0.951 and that of prediction ability was 0.723. The classi- fication results were basically consistent with cluster analysis. The classification results of orthogonal partial least squares- discriminant analysis were also basically consistent with clus- ter analysis. The common peaks with VIP value >1 in the order were peak 7>peak 11 （rutin）>peak 17>peak 13 （astilbin）>peak 3>peak 8>peak 6>peak 16 respectively. The linear ranges of astilbin， polydatin and berberine hydrochloride were 0.012 6- 1.225 0， 0.010 8-1.052 5 and 0.020 0-1.562 5 mg/mL， respectively （all R 2=0.999 9）. RSDs of precision， stability （24 h） and repeatability tests were all less than 3%. The average recoveries were 99.48% （RSD=2.67%， n=9）， 98.57% （RSD=1.77%， n=9） and 100.84% （RSD=2.49%， n=9）. The contents were 1.221 0-7.011 6， 2.251 1-4.462 9， 1.252 4-3.328 7 mg/g， respectively. CONCLUSIONS Established fingerprint and the method of content determination are accurate， stable and simple. Combined with chemometric analysis， it can be used for the quality control and evaluation of Zhuang medicine Jinmu granules.

KEYWORDS? ?Zhuang medicine; Jinmu granules; high performance liquid chromatography; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; content determination

壯藥金母顆粒由壯醫(yī)坐浴方加減而來(lái)[1]，含金剛刺（又名菝葜）、火炭母、土茯苓、虎杖、苦參、大血藤、黃柏、犁頭草等多味壯藥，主要用于臨床治療濕熱毒引起的腹痛腹脹、月經(jīng)不調(diào)等慢性盆腔炎癥性疾病。根據(jù)壯醫(yī)藥理論，方中金剛刺、土茯苓均為主藥，主要成分均為落新婦苷，具有清熱毒、通水道、除濕毒、調(diào)谷道之功效[2-3];火炭母亦為主藥，主要含有山柰酚、槲皮素和沒食子酸等成分，能除濕毒、清熱毒、涼血止痛，外治宮頸炎、皮炎濕疹、霉菌性陰道炎等癥[2];虎杖為幫藥，指標(biāo)成分為虎杖苷，具有通谷道/氣道/水道、解熱毒之功效[2];苦參同為幫藥，主要含有苦參堿、氧化苦參堿和蘆丁，能祛風(fēng)毒、通谷道、除濕毒和清熱毒[4];大血藤亦為幫藥，主要含有酚類成分，具有祛風(fēng)止痛、清熱解毒、活血的功效[2];黃柏為帶藥，主要成分為鹽酸小檗堿，具有瀉火除蒸、清熱燥濕、解毒療瘡之功效[4];犁頭草亦為帶藥，主要含有黃酮類成分，具有清熱解毒、散瘀消腫的功效[5]。

目前，關(guān)于金母顆粒已有制劑工藝、藥效學(xué)等研究[6-7]，但該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。指紋圖譜是一種可量化的且具有高度專屬性的綜合鑒定手段，能較為全面地反映中藥及其制劑所含化學(xué)成分間的相對(duì)關(guān)系[8-9]。化學(xué)計(jì)量學(xué)分析主要包括主成分分析、聚類分析和正交偏最小二乘法-判別分析等，其與指紋圖譜聯(lián)合使用可較好地反映中藥及其制劑的整體特征[10]。為全面控制金母顆粒的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立了壯藥金母顆粒的指紋圖譜，同時(shí)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，并測(cè)定其中落新婦苷、虎杖苷、鹽酸小檗堿的含量，旨在為金母顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及上市提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-2030 Plus型HPLC儀及配備的紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、Labsolutions5.97色譜工作站（日本Shimadzu公司），JM-A5002型電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司），UPH-Ⅳ-20TN型優(yōu)普系列超純水、98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽酸小檗堿、虎杖苷、落新婦苷對(duì)照品（批號(hào)分別為MUST-19072501、MUST-19062702、MUST-20032410，純度分別為98.38%、98.26%、98.14%）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;沒食子酸、蘆丁、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)分別為110831-201906、100080-202012、110861-202013，純度分別為91.5%、91.7%、95.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

10批金母顆粒[編號(hào)S1～S10，批號(hào)20191201～ 20201010，每包10 g（相當(dāng)于生藥36.3 g）]均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制劑工程中心研制。上述顆粒所用金剛刺、土茯苓、火炭母、大血藤、虎杖、犁頭草、黃柏、苦參飲片均購(gòu)自廣西寶正藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院韋松基教授鑒定，分別為拔葜科植物菝葜Smilax china L.的干燥根狀莖，百合科植物光葉菝葜S. glabra Roxb.的干燥根莖，蓼科植物硬毛火炭母Polygonum chinense L. var. hispidum Hook. f.或火炭母P.chinense L.的干燥全草，木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata（Oliv.）Rehd. et Wils.的干燥藤莖，蓼科植物虎杖P. cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根莖和根，堇菜科植物戟葉堇菜Viola betonicifolia J. E. Smith.、長(zhǎng)萼堇菜V. inconspica Bl.或心葉堇菜V. concordifolia C. J. Wang.的新鮮或干燥全草，蕓香科植物黃皮樹Phellodendron sinii Schneid.的干燥樹皮，豆科植物苦參 Sophora flavescens Ait.的干燥根。金剛刺、土茯苓、火炭母、大血藤、犁頭草飲片均產(chǎn)自廣西，虎杖、苦參飲片均產(chǎn)自陜西，黃柏飲片產(chǎn)自四川。各單味飲片的來(lái)源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 金母顆粒的HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、虎杖苷、蘆丁、落新婦苷、山柰酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成上述5種成分質(zhì)量濃度分別為0.067、0.572、0.635、0.522、0.668 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取金母顆粒，混勻，取適量，研細(xì)。取上述粉末約2 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min使完全溶解，放冷，再次稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 各單味飲片溶液的制備 取金剛刺等各單味飲片適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備單味飲片溶液。

2.1.4 色譜條件 以Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～40 min，5%A→8%A;40～60 min，8%A→14%A;60～95 min，14%A→19%A;95～110 min，19%A→30%A;110～135 min，30%A→60%A;135～145 min，60%A→95%A;145～150 min，95%A→5%A）;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以蘆丁（11號(hào)峰）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取金母顆粒（編號(hào)S1），共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以蘆?。?1號(hào)峰）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時(shí)按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以蘆丁（11號(hào)峰）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，22個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 指紋圖譜的建立 取10批金母顆粒，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行色譜峰匹配，以分離度好、峰面積相對(duì)較大的色譜峰為共有峰，采用中位數(shù)法，以0.1 min為時(shí)間窗寬度、S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)色譜圖多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（R）和10批金母顆粒的疊加指紋圖譜。結(jié)果顯示，10批金母顆粒共有22個(gè)共有峰。金母顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜見圖1。

2.1.9 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批金母顆粒進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.997、0.976、0.991、0.987、0.985、0.990、0.962、0.993、0.978、0.985，表明10批樣品的相似度良好，金母顆粒的制備工藝穩(wěn)定。

2.1.10 共有峰指認(rèn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將供試品（編號(hào)S1）的HPLC圖與混合對(duì)照品溶液的HPLC圖進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)了5個(gè)共有峰，分別為沒食子酸（2號(hào)峰）、虎杖苷（9號(hào)峰）、蘆?。?1號(hào)峰）、落新婦苷（13號(hào)峰）、山柰酚（20號(hào)峰）。由于蘆丁的峰面積較大且分離度較好，故選擇蘆丁為參照峰。結(jié)果見圖2。

2.1.11 共有峰與各單味飲片的相關(guān)性 取“2.1.3”項(xiàng)下各單味飲片溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將S1樣品的HPLC圖與上述各單味飲片溶液的HPLC圖進(jìn)行比對(duì)，初步判斷各共有峰的歸屬情況。結(jié)果見圖3、表2。

2.2 聚類分析

以10批金母顆粒中22個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，使用SPSS 21.0軟件，采用Ward連接法以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為5時(shí)，10批金母顆?？删蹫?類，其中S1、S3～S4聚為一類，S5～S6、S9聚為一類，S2、S7～S8、S10聚為一類。結(jié)果見圖4。

2.3 主成分分析

以10批金母顆粒中22個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量構(gòu)成22×10階矩陣，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件建立主成分分析模型，提取4個(gè)主成分，得到模型解釋參數(shù)（R 2X）為0.951，表明提取的主成分可解釋95.1%的原始變量;模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q 2）為0.723，即預(yù)測(cè)模型能力為72.3%，提示該模型穩(wěn)定、可靠[11]。采用相同方法繪制主成分分析得分圖，詳見圖5。由圖5可知，10批壯藥金母顆?？煞譃?類，S1、S3～S4為一類，位于得分圖的左側(cè);S5～S6、S9為一類，位于得分圖的中部;S2、S7～S8、S10為一類，位于得分圖的右側(cè)。這表明不同批次金母顆粒化學(xué)成分的含量存在一定差異。

2.4 正交偏最小二乘-判別分析

為進(jìn)一步尋找導(dǎo)致金母顆粒質(zhì)量差異的標(biāo)志成分，本研究將10批金母顆粒中22個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，以Pareto算法進(jìn)行特征縮放，獲得正交偏最小二乘-判別分析模型。結(jié)果顯示，模型解釋參數(shù)（R 2X、R 2Y）分別為0.920、0.678，表明模型對(duì)X變量的可解釋率為92.0%，對(duì)Y變量的可解釋率為67.8%;Q 2為0.493，表明模型的預(yù)測(cè)能力為49.3%。采用SIMCA 14.1繪制得分矩陣圖，詳見圖6。由圖6可知，10批金母顆?？煞譃?類，S1、S3～S4為一類，位于得分圖的右下側(cè);S5～S6、S9為一類，位于得分圖的中上方;S2、S7～S8、S10為一類，位于得分圖的左側(cè)。

采用SIMCA 14.1軟件，以置換檢驗(yàn)（n=200）對(duì)當(dāng)前正交偏最小二乘-判別分析模型進(jìn)行驗(yàn)證，詳見圖7。由圖7可知，模型驗(yàn)證參數(shù)（R 2、Q 2）分別為（0，0.333）、（0，-0.446），Q 2點(diǎn)的回歸線與垂直軸（左側(cè)）相交于0以下，表明所建正交偏最小二乘-判別分析模型擬合良好[12]，可用于分析金母顆粒的質(zhì)量差異成分。

變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP值越高，表示對(duì)應(yīng)化合物對(duì)組間質(zhì)量差異的影響越大[12]。采用SIMCA 14.1軟件，以VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選影響金母顆粒質(zhì)量的標(biāo)志成分[13]。結(jié)果顯示，VIP值>1的共有峰依次為7號(hào)峰、11號(hào)峰（蘆?。?、17號(hào)峰、13號(hào)峰（落新婦苷）、3號(hào)峰、8號(hào)峰、6號(hào)峰、16號(hào)峰，表明這8個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)的成分可能是造成金母顆粒質(zhì)量差異的標(biāo)志成分。結(jié)果見圖8。

2.5 金母顆粒中虎杖苷、落新婦苷的含量測(cè)定

2.5.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取虎杖苷、落新婦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入60%乙醇溶解并稀釋，制成上述2種成分質(zhì)量濃度分別為0.413、0.496 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.5.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按金母顆粒的制備工藝分別制備缺金剛刺、土茯苓、虎杖的陰性顆粒，再按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備缺虎杖和缺金剛刺、土茯苓的陰性對(duì)照溶液。

2.5.4 色譜條件 以Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（15 ∶ 85，V/V）為流動(dòng)相;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.5.5 專屬性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及各陰性對(duì)照溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖9。由圖9可知，各色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)不低于3 000，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.5.6 線性關(guān)系考察 取各對(duì)照品適量，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備虎杖苷質(zhì)量濃度分別為0.010 8、0.027 0、0.067 4、0.168 4、0.421 0、1.052 5 mg/mL，落新婦苷0.012 6、0.031 4、0.078 4、0.196 0、0.490 0、1.225 0 mg/mL的系列線性工作溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得虎杖苷的回歸方程為Y=3.539 7×107X-115 346.622 7（R 2=0.999 9），落新婦苷的回歸方程為Y=2.209 8×107X-104 101.031 7（R 2=0.999 9），表明虎杖苷、落新婦苷檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.010 8～1.052 5、0.012 6～1.225 0 mg/mL。

2.5.7 精密度試驗(yàn) 取“2.5.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，虎杖苷、落新婦苷峰面積的RSD分別為0.20%、0.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，虎杖苷、落新婦苷峰面積的RSD分別為1.53%、2.27%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取金母顆粒（編號(hào)S3）約2 g，共6份，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，虎杖苷、落新婦苷含量的RSD分別為2.34%、2.44%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的金母顆粒（編號(hào)S3）約1 g，精密稱定，共9份，精密加入各單一對(duì)照品適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

2.5.11 樣品含量測(cè)定 取10批金母顆粒樣品，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。每樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果顯示，10批樣品中虎杖苷、落新婦苷的含量分別為2.251 1～4.462 9、1.221 0～7.011 6 mg/g，平均含量分別為3.022 7、2.958 9 mg/g。結(jié)果見表4。

2.6 金母顆粒中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加入60%乙醇溶解并稀釋，制成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為0.050 0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.6.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按金母顆粒制備工藝制備缺黃柏的陰性顆粒，再按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.6.4 色譜條件 以Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.3%磷酸溶液（每100 mL磷酸溶液中加入十二烷基硫酸鈉0.08 g）（50 ∶ 50，V/V）為流動(dòng)相;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.6.5 專屬性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖10。由圖10可知，鹽酸小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于4 000，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.6.6 線性關(guān)系考察 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，用60%乙醇稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.020 0、0.050 0、0.125 0、0.312 5、0.781 2、1.562 5 mg/mL的系列線性工作溶液，按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為Y=4.349 1×107X-218 508.214 8（R 2=0.999 9），表明鹽酸小檗堿檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.020 0～1.562 5 mg/mL。

2.6.7 精密度試驗(yàn) 取“2.6.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.26%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.12%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取金母顆粒（編號(hào)S3）約2 g，共6份，精密稱定，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿的平均含量為1.645 8 mg/g，RSD為2.63%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.6.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的金母顆粒（編號(hào)S3）約1 g，精密稱定，共9份，精密加入“2.6.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表5。

2.6.11 樣品含量測(cè)定 取10批金母顆粒，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。每樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果顯示，10批樣品中，鹽酸小檗堿的含量分別為1.324 3、1.840 8、1.644 2、2.642 4、3.089 7、3.328 7、1.355 1、1.843 6、3.317 8、1.252 4 mg/g，平均含量為2.163 9 mg/g。

3 討論

3.1 供試品制備與色譜條件優(yōu)化

本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在制備供試品溶液時(shí)，若樣品取樣量為1 g，加入60%乙醇50 mL，所得樣品中待測(cè)成分的含量波動(dòng)較大。為使檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，本研究將取樣量及溶劑均增加了1倍，結(jié)果顯示，所得樣品中待測(cè)成分的含量較為穩(wěn)定。同時(shí)，本課題組前期還對(duì)指紋圖譜所用流動(dòng)相體系進(jìn)行了比較，包括乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-磷酸溶液等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以甲醇為有機(jī)相時(shí)，各色譜峰分離度不佳且出峰時(shí)間較晚;當(dāng)以水為水相時(shí)，所得色譜圖的色譜信息較少、峰形較差;當(dāng)以乙腈-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜圖的色譜信息豐富，色譜峰保留時(shí)間適中且峰形及分離度均較好。此外，本課題組前期將供試品溶液于190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液于265、291、306、345 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收。因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，本課題組分別對(duì)上述波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，在265 nm波長(zhǎng)下，色譜圖中的色譜信息較少;在345 nm波長(zhǎng)下，各色譜峰分離度較差;在306 nm波長(zhǎng)下，色譜圖的基線發(fā)生漂移;而在291 nm波長(zhǎng)下，各色譜峰分離度良好，色譜信息豐富且特征性較強(qiáng)。綜合考慮，本研究最終選擇“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件。

3.2 指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

指紋圖譜結(jié)果顯示，10批金母顆粒樣品共有22個(gè)共有峰，相似度均大于0.960。共指認(rèn)了5個(gè)共有峰，分別為沒食子酸（2號(hào)峰）、虎杖苷（9號(hào)峰）、蘆丁（11號(hào)峰）、落新婦苷（13號(hào)峰）、山柰酚（20號(hào)峰）。聚類分析結(jié)果顯示，10批樣品可聚為3類，其中S1、S3～S4聚為一類，S5～S6、S9聚為一類，S2、S7～S8、S10聚為一類;主成分分析結(jié)果、正交偏最小二乘-判別分析結(jié)果與上述聚類分析結(jié)果基本一致;得到VIP值>1的共有峰依次為7號(hào)峰、11號(hào)峰（蘆丁）、17號(hào)峰、13號(hào)峰（落新婦苷）、3號(hào)峰、8號(hào)峰、6號(hào)峰、16號(hào)峰，表明這8個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)成分可能是造成金母顆粒質(zhì)量差異的成分，可作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的標(biāo)志成分。

3.3 指標(biāo)成分選擇與含量測(cè)定結(jié)果分析

有研究指出，落新婦苷為金剛刺、土茯苓共有的指標(biāo)成分，具有抑菌、抗炎的作用[14-15]，用于盆腔炎的療效顯著[16];虎杖苷為虎杖的指標(biāo)成分，可用于治療盆腔炎、子宮粘連等婦科疾病[17-18];鹽酸小檗堿為黃柏的活性成分，可用于臨床治療慢性盆腔炎、皮膚過(guò)敏等[19]。因此，本研究選擇這3種成分作為金母顆粒的指標(biāo)成分。含量測(cè)定結(jié)果顯示，10批金母顆粒中，落新婦苷、虎杖苷、鹽酸小檗堿含量分別為1.221 0～7.011 6、2.251 1～4.462 9、1.252 4～3.328 7 mg/g。每批含量測(cè)定結(jié)果均有差異，其原因可能與各批次藥材的采收時(shí)間、地點(diǎn)等不同有關(guān)。

綜上所述，所建指紋圖譜和含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，可用于壯藥金母顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

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（收稿日期：2021-09-12 修回日期：2022-01-18）

（編輯：陳 宏）