武曉瑞， 尹一淑， 劉軍蓮， 范全春， 趙 爽， 李勇枝*

(1.中國航天員科研訓練中心， 北京 100094； 2.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程系， 哈爾濱 150001)

1 引言

航天環(huán)境下的應激因素是多方面的，如超重、失重、噪聲、輻射和晝夜節(jié)律改變等物理應激源，血液重分布、肌肉廢用和骨質(zhì)丟失等生理性應激源，空間狹小、社會隔離、限制、睡眠剝奪、工作高負荷、高危險等心理應激源，乘員異質(zhì)性、性格沖突、文化與性別差異、人際摩擦等人際應激源。 這些應激因素產(chǎn)生的一系列反應均影響著乘員的心理和生理健康，影響飛行任務的完成，甚至可能造成災難性后果。

Bremner研究表明，慢性應激引起下丘腦－垂體－腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis， HPA axis)功能長期異常，糖皮質(zhì)激素持續(xù)處于高水平導致神經(jīng)干細胞增值受到抑制，神經(jīng)元受損萎縮引起神經(jīng)結構和功能損傷。 陳海龍等檢測了尾吊一周SD 大鼠腦區(qū)記憶相關蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)學習相關蛋白通路活化能力減弱；Iqbal 等通過比較O16/O18 標記的綜合蛋白質(zhì)組學策略，檢測了7 d 尾吊大鼠模型的差異蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)了132 個差異表達蛋白，其中25 個蛋白與各種信號級聯(lián)相關并且涉及重要的內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能，表明微重力環(huán)境對腦部信號傳遞產(chǎn)生了一定的影響。 因此長期處于航天應激環(huán)境下會引起機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的生化改變，出現(xiàn)情緒異常，甚至導致大腦器質(zhì)性損害。 而與情緒密切相關的是大腦皮層和邊緣系統(tǒng)，在應激反應中是高位調(diào)節(jié)中樞，更是應激反應最容易累積的敏感區(qū)域。

近年來有關航天復合應激的實驗研究很少公開發(fā)表。 抗體芯片技術是一種高通量技術，能夠利用少量樣品篩選差異表達蛋白，全面、定量地分析蛋白種類和數(shù)量的改變，并且通過結合生物信息學方法進行分析，即可預測航天應激環(huán)境的影響機制。 本文通過神經(jīng)組織形態(tài)學、抗體芯片檢測技術及通路富集分析，對模擬長期航天應激環(huán)境下大鼠大腦皮層及相關蛋白表達的變化進行探究，為進一步探究航天復合應激環(huán)境對大鼠大腦皮層的影響提供實驗依據(jù)。

2 方法

2.1 動物與試劑

實驗選用健康成年6 周齡雄性SD 大鼠，SPF級，體重(200±10)g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。 實驗動物購入后，適應性常規(guī)飼養(yǎng)一周。

主要試劑:尼氏染色試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)；PBS(美國Hyclone 公司)；RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)；KAM－850 antibody microarray 試劑盒(加拿大Kinexus公司)；發(fā)光液(美國Millipore 公司)；辣根酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；GAPDH 抗體(sc－47724)(美國Santa Cruz 公司)；BDNF (ab75040)(美國Abcam 公司)；PI3K(4249)、 p-PI3K (2971)、 AKT (9272)、 p-AKT(9271)、mTOR (2983)、p-mTOR (2971)、GSK－3β(9315)、p-GSK－3β(9336)、CREB (9197)、p-CREB (9198)、JNK(3708)、p-JNK (4668)、p38(8690)、p-p38 (4511)(美國CST 公司)。

主要器材:全自動真空脫水機、組織包埋機、石蠟切片機、載玻片(德國Leica 公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；KAM－850 抗體芯片(加拿大Kinexus 生物信息公司)；激光陣列掃描儀(美國Perkin-Elmer 公司)；低溫高速離心機(德國EPPENDORF 公司)；旋渦混勻器(北京六一儀器廠)；勻漿儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；超微量紫外分光光度計(美國Quawell 公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)。

2.2 動物分組與造模

大鼠隨機分為2 組，分別為空白對照組(Control，Ctrl)與航天復合應激模型組(Model，Mod)，每組10 只。 其中，Ctrl 組每籠放入5 只大鼠，在正常條件下飼養(yǎng)，每日保持12 h 光照和12 h 黑暗晝夜交替。 模型組在模擬航天復合應激環(huán)境下飼養(yǎng)。 模擬航天復合應激條件包括:孤養(yǎng)、尾吊、噪聲、晝夜節(jié)律改變。 每籠飼養(yǎng)1 只大鼠，可自由活動和進食水，尾吊籠四周安裝毛玻璃，使籠中大鼠不能看到外部，造成相對幽閉隔離的環(huán)境。 采用改進的尾部懸吊法使大鼠軀體與水平呈30°角，后肢懸垂不碰觸地面。 動物房的四角各放置1 個揚聲器，用白噪聲發(fā)生器發(fā)出穩(wěn)態(tài)噪聲，經(jīng)均衡器、功率放大器傳至揚聲器，聲強控制在(65±2)dBA 范圍內(nèi)，每天持續(xù)播放12 h。 利用微電腦時控開關設置照明為45 min 開和45 min 關交替，模擬近地軌道90 min 繞地一周的晝夜節(jié)律變化。造模時間共持續(xù)6 周。

2.3 尼氏染色觀察大腦皮層形態(tài)

造模完成后，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。 先用生理鹽水灌注，待大鼠肝臟變白后，換成4%多聚甲醛灌流，直到大鼠肝臟變硬，尾巴僵硬為止。 大鼠斷頭處死，在冰上剝離全部大鼠大腦及皮層組織。 取4 只大鼠皮層組織放入4%的多聚甲醛溶液中，浸泡24 h 后漂洗、脫水、石蠟包埋并切片，余下的6 只用于后續(xù)抗體芯片分析及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。 將腦片置于焦油紫溶液中，室溫下染色30 min。 放入Nissl Differentiation 中進行分化，在顯微鏡下觀察至背景接近于無色為止。 另外，熒光顯微鏡下對皮層進行組織學觀察及拍照，并對不同尼氏染色陽性神經(jīng)元區(qū)域進行雙盲計數(shù)。

2.4 抗體芯片篩選差異蛋白

取剩余6 只大鼠大腦皮層組織在冰浴中進行勻漿，并超聲粉碎。 4 ℃環(huán)境下，離心轉速為12 000 r/min，旋轉10 min，取上清于1.5 mL 離心管中。 用紫外分光光度計測定樣品蛋白濃度。 分裝一半用于抗體芯片分析，其余用于蛋白免疫印跡分析。

用KAM－850 antibody microarray 芯片進行各組件無偏差信號蛋白特征分析。 將各組抽提后的蛋白質(zhì)用試劑盒中提供的Cy5 和Cy3 兩種不同顏色的熒光分子分別標記，洗去多余標記分子。將KAM－850 抗體芯片在封閉緩沖液中封閉1 h，在孵化緩沖液中將芯片與蛋白樣品孵育2 h，用激光陣列掃描儀在540 nm 處掃描抗體芯片，搜索差異蛋白相對應的基因。 選用京都基因與基因組( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫的信號通路，采用超幾何分布的計算方法，用錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate，F(xiàn)DR)校正P-value，選取的閾值為0.05，最后獲得差異表達基因顯著富集的KEGG 信號通路。

2.5 蛋白免疫印跡分析

將加入上樣緩沖液的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)。 電壓80 V，30 min 左右時待條帶跑至分離膠時，將電壓改為120 V，繼續(xù)進行90 min。剪取適合大小，厚度為0.22 μm 的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜，放入甲醇浸泡10 s，之后和濾紙、轉膜夾、海綿一起浸泡于預冷的轉膜液中進行轉膜。 恒定電流300 mA，根據(jù)目標蛋白分子大小進行，電轉60 ～90 min 后將PVDF 膜迅速放入封閉緩沖液中，室溫封閉2 h，然后用TBST 洗膜5 min。 按照抗體說明書的稀釋比例，用含1% BSA 的TBST 配置2 mL 一抗溶液。根據(jù)蛋白Marker 切下與目的蛋白相應的PVDF膜，放入一抗中，于4 ℃冰箱輕搖孵育過夜。 之后在TBST 中洗膜3 次，每次10 min。 用封閉緩沖液配制辣根過氧化酶標記的二抗孵育液，濃度1 ∶5000。 將PVDF 膜加入二抗孵育液中，室溫下?lián)u床孵育2 h。 之后在TBST 中洗膜4 次，每次10 min。將Millipore 發(fā)光液A 液和B 液按1 ∶1比例加入孵育盒中混勻，將待測PVDF 膜浸泡其中2 min，取出后放入化學凝膠成像系統(tǒng)中顯影、曝光，并用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示，采用SPSS17.0 軟件進行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析進行多樣本間比較，用Bonferroni 修正差別檢驗法進行兩組間比較，并用GraphPad Prism 5 作圖。

3 結果

3.1 大鼠大腦皮層形態(tài)

顯微鏡下對尼氏染色的大腦皮層組織切片進行觀察，如圖1 所示。 與Ctrl 組相比，Mod 組神經(jīng)元數(shù)目減少，間隙變大，尼氏染色相對較弱。

圖1 模擬航天復合應激對大鼠大腦皮層組織形態(tài)的影響Fig.1 Effects of simulated spaceflight composite stress on the morphology in cerebral cortex

對皮層神經(jīng)元數(shù)目進行計數(shù)，并統(tǒng)計分析，見圖2。 與Ctrl 組相比，Mod 組神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(＜0.01)，提示模擬長期航天應激環(huán)境會造成大鼠大腦皮層神經(jīng)元損傷(其中＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義)。

圖2 模擬航天復合應激對大鼠大腦皮層神經(jīng)元數(shù)目的影響Fig.2 Effects of simulated spaceflight composite stress on the numbers of intact neurons in cerebral cortex

3.2 大鼠大腦皮層蛋白表達

3.2.1 抗體芯片掃描圖像

用激光陣列掃描儀對抗體芯片進行掃描，得到圖3。 左側為Ctrl 組皮層組織的掃描圖像，右側為Mod 組皮層組織的掃描圖像。 其中，紅色點表示豐度增加，綠色點表示豐度降低，紅綠混合表示豐度沒有變化。

圖3 抗體芯片掃描圖像Fig.3 Antibody-based protein microarray scanning images

3.2.2 抗體芯片檢測蛋白變化

抗體芯片共檢測了854 個蛋白分子。 根據(jù)Kinexus 公司的標準，同時滿足Z-ratio ≥±1.5%，Error Range ≤30， Globally Normalized Median Value ≥271 和Flags ＝0 四個指標要求的分子才被認為發(fā)生了顯著變化，其中Z-ratio 表示對照樣品和處理樣品之間的最大變化，Error Range 表示全局歸一化網(wǎng)絡信號強度的緊密程度，Globally Normalized Median Value 代表全局標準化中值，F(xiàn)lag 表示形態(tài)和背景的斑點質(zhì)量。 結果發(fā)現(xiàn)大腦皮層組織中，Mod 組與Ctrl 組相比，顯著差異蛋白有28 個，其中表達上調(diào)的有21 個，表達下調(diào)的有7 個，如表1 所示。

表1 大腦皮層Mod 組與Ctrl 組差異蛋白列表Table 1 Expressed differential proteins between Mod and Ctrl groups in cerebral cortex

3.2.3 抗體芯片檢測差異蛋白的通路活性

通過搜索芯片差異蛋白相對應的基因，進行KEGG 通路富集分析，得出發(fā)生顯著改變的信號通路。 圖4 為大腦皮層組織顯著改變的通路，軸表示為富集分析統(tǒng)計顯著性值p value 進行－log轉換后的值，且數(shù)值越大表示富集分析越顯著。 Mod 組和Ctrl 組相比，變化較為顯著的信號通路有脂肪細胞因子(Adipocytokine)、MAPK、p53等信號通路。

圖4 模擬航天應激環(huán)境模型影響大腦皮層組織的信號通路Fig.4 Altered signaling pathways in different groups in cerebral cortex

3.3 Western Blot 驗證差異蛋白

在抗體芯片中，Mod 組大腦皮層MAPK 信號轉導通路活性發(fā)生了明顯變化。 在哺乳動物機體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的5 種MAPK 信號轉導通路中，ERK1/2通路調(diào)控細胞生長和分化，JNK 和p38-MAPK 通路在炎癥和細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用。 為了證實這種變化，本文用免疫印跡法對MAPK 的3 個亞族ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 進行了檢測。

圖5 為大腦皮層組織的免疫印跡檢測結果，發(fā)現(xiàn)在大腦皮層組織中，與Ctrl 組相比，Mod 組ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 的磷酸化水平發(fā)生微弱提高。 結果提示模擬長期航天飛行可能對MAPK 通路產(chǎn)生一定程度的影響。

圖5 模擬航天應激環(huán)境對MAPK 通路關鍵蛋白表達的影響Fig.5 Effects of spaceflight composite stress on the expression of key proteins in the MAPK pathway

4 討論

考慮到長期太空飛行特殊和復雜的極端環(huán)境，本文通過尾吊、時序變化、孤養(yǎng)、噪聲因素模擬航天環(huán)境，建立慢性應激大鼠模型，致力于構建一個比較理想和全面的航天復合應激環(huán)境模型，能夠更貼合地模擬空間站中環(huán)境，盡管如此，本模型仍舊具有一定的局限性，如難以模擬飛行乘組人員之間的人際關系等。

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結構，是蛋白質(zhì)合成的場所，主要合成更新細胞器所需的結構蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類等神經(jīng)調(diào)質(zhì)，結構異常與情緒抑郁、認知損害等癥狀密切相關。 郭純等研究發(fā)現(xiàn)，慢性應激大鼠海馬尼氏體減少，顏色變淺，細胞間隙增加。 本文用尼氏染色法觀察模擬航天復合應激環(huán)境模型大鼠大腦皮層的神經(jīng)元形態(tài)的改變。 結果發(fā)現(xiàn)模型大鼠大腦皮層神經(jīng)元數(shù)量減少，結構有明顯改變，提示模擬航天復合應激環(huán)境會造成大鼠皮層組織神經(jīng)元損傷。

高通量蛋白質(zhì)組學技術是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)，能預測生命活動規(guī)律的物質(zhì)基礎，為疾病機制的闡明提供理論依據(jù)和解決途徑，還被廣泛用來確定藥物的細胞信號分子和靶標蛋白。 抗體芯片是最常用的蛋白質(zhì)芯片中的一種，通過芯片上的抗體和待測樣品中的抗原進行特異性免疫反應，實現(xiàn)一次檢測成百上千種蛋白表達豐度。 其特異性強，敏感度高，已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)學、藥學、生物學等多個領域。 本文研究應用抗體芯片技術檢測模擬航天復合應激環(huán)境后大鼠大腦皮層的蛋白變化，發(fā)現(xiàn)有顯著差異的蛋白28 個，其中21 個表達上調(diào)，7 個表達下調(diào)。接著利用KEGG 數(shù)據(jù)庫進行了通路富集分析，發(fā)現(xiàn)了其中與神經(jīng)系統(tǒng)相關的MAPK 信號通路變化較為明顯。

MAPK 通路控制著細胞的多種生理過程，在信號網(wǎng)絡中起重要作用。 ERK1/2 通路和p38－MAPK 通路都屬MAPK 通路。 ERK 通路發(fā)揮促細胞生長及分化的作用，p38－MAPK 通路在應激反應中促細胞凋亡。 Li 等研究表明Ras/ERK/p38－MAPK 信號通路參與慢性應激抑郁模型大鼠神經(jīng)可塑性和抑郁樣行為的調(diào)節(jié)。 本文也對此通道上的多個蛋白進行了免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)其磷酸化水平均有提高的趨勢。 因此可以合理推測，模擬航天復合應激環(huán)境會導致大鼠大腦皮層腦組織形態(tài)發(fā)生改變，也會影響皮層組織中相關蛋白的改變，這種改變可能是通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路造成的。

5 結論

本文探究了航天復合應激環(huán)境對模型大鼠大腦皮層腦組織形態(tài)及相關蛋白的影響，結論如下:

1)模擬航天復合應激環(huán)境會造成模型大鼠皮層組織神經(jīng)元損傷。

2)模擬航天復合應激環(huán)境后大鼠大腦皮層的蛋白發(fā)生明顯變化，其中MAPK 和p53 通路的變化較為明顯。