禹明均，鄭小鵬，李春江

（1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，Kpn）是一種革蘭氏陰性機會致病菌，主要在免疫功能低下的個體中引發(fā)疾病。此外，高毒性Kpn菌株會在健康個體中引發(fā)嚴重疾病，如支氣管炎、敗血癥、腹膜炎等，而莢膜多糖（Capsule Polysacharides，CPS）作為高毒性Kpn的主要毒力決定因素，保護細胞免受免疫系統(tǒng)的殺菌活性。碳青霉烯類是治療耐多藥腸桿菌科重癥感染最有效、最可靠的β-內(nèi)酰胺類藥物。近年來，碳青霉烯類藥物被認為是治療耐藥革蘭氏陰性細菌感染的最后一道防線。然而，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了許多對碳青霉烯類抗生素耐藥的細菌，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）就是其中之一。本研究主要綜述CRKP耐藥機制的研究進展。

1 Kpn的耐藥現(xiàn)狀

碳青霉烯酶的產(chǎn)生是全世界Kpn中碳青霉烯耐藥最常見的機制。分子診斷方法證實了絕大多數(shù)CRKP分離株攜帶碳青霉烯酶基因，如Kpn碳青霉烯酶或β-內(nèi)酰胺酶基因。雖然這些分離株的碳青霉烯耐藥性（Carbapenem Resistance，CR）差異很大，但碳青霉烯酶基因的存在的確預示了表型碳青霉烯的耐藥性。CR的這種變異可能由其他基因型因素驅(qū)動，這也有助于碳青霉烯酶和非碳青霉烯酶產(chǎn)生耐碳青霉烯腸桿菌（Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae，CRE）的CR。CRKP中觀察到的一些基因型變異，如碳青霉烯酶基因拷貝數(shù)的變化或轉(zhuǎn)座子亞型和啟動子區(qū)域的變化[1]，改變了碳青霉烯酶基因的表達水平，這可能解釋了碳青霉烯酶耐藥性中的某些變異。其他與碳青霉烯酶表達不相關(guān)的因素也可能增強碳青霉烯酶的耐藥性，包括擴展譜β-內(nèi)酰胺酶的表達，這可能與孔蛋白缺失引起的碳青霉烯膜通透性降低有關(guān)。

2 CRKP的耐藥機制

目前，全球CRKP感染不斷增加，臨床上有限的治療方式已不能滿足患者的需求。此外，CRKP通常會引起醫(yī)院感染，與碳青霉烯敏感的Kpn引起的感染相比，CRKP感染的患者死亡率更高，探究CRKP的耐藥機制迫在眉睫，以期為臨床指導用藥提供有效的理論依據(jù)。目前，已發(fā)現(xiàn)的Kpn對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制有5種：（1）產(chǎn)碳青霉烯酶，水解碳青霉烯類藥物，是產(chǎn)生耐藥性的主要機制；（2）高水平產(chǎn)頭孢菌素酶（Axiomatic Multi-Platform C，AmpC）/超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs）同時合并外膜孔蛋白（Outer Membrane Protein，OMP）缺失或表達量不足；（3）高親和位點青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin Binding Proteins，PBPs）的數(shù)量不足或親和力下降；（4）主動外排泵系統(tǒng)；（5）形成生物被膜[2]。

2.1 產(chǎn)碳青霉烯酶

β-內(nèi)酰胺酶的命名最初基于氨基酸序列被定義為Ambler分類，將β-內(nèi)酰胺酶分為4個主要類別：A、B、C、D[3]。其中，包含碳青霉烯酶的A、B、D是Kpn耐碳青霉烯類抗菌藥物的主要機制。

2.1.1 A類

A類即非金屬β-內(nèi)酰胺酶，可以水解碳青霉烯類、頭孢菌素、青霉素和氨曲南，標志著β-內(nèi)酰胺酶活性從主要針對青霉素和頭孢菌素的酶進化為水解碳青霉烯類的酶。A類絲氨酸碳青霉烯酶的代表包括酶NMC-A、IMI、SME和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase，KPC）。KPC已成為A類絲氨酸碳青霉烯酶中人們最熟悉的酶，多在腸桿菌科中被檢測到，對所有β-內(nèi)酰胺類（不包括碳青霉烯類和單內(nèi)酰胺類）有耐藥性。攜帶KPC基因的革蘭氏陰性菌可以攜帶在移動遺傳元件上，如轉(zhuǎn)座子（Tn4401b）和多種質(zhì)粒（IncFII、IncL/M和IncN）。表達KPC基因的生物體通常同時對其他類別的抗生素（如喹諾酮類和氨基糖苷類）具有耐藥性。KPC-2生產(chǎn)者引起的CRKP感染率更高，其中，ST11是最常見的譜系。

2.1.2 B類

B類即金屬β-內(nèi)酰胺酶（Metallo Beta Lactamases，MBL），已從不動桿菌屬和假單胞菌屬中分離出來，并逐漸與腸桿菌屬成員關(guān)聯(lián)，Kpn、催產(chǎn)桿菌、大腸埃希菌和腸桿菌屬MBL通常與維羅納整合子編碼的金屬β-內(nèi)酰胺酶、假單胞菌型和新德里MBL相關(guān)[4]。MBL通常由整合子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等移動遺傳元件表達，這些因素促進了MBL的傳播。MBL可有效地水解β-內(nèi)酰胺酶，并且不受β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（克拉維酸、他唑巴坦）的抑制。它們也不同于KPC，因為它們含有二價鋅離子，可在活性位點通過協(xié)調(diào)組氨酸/胞嘧啶/天冬酰胺殘基并激活結(jié)合的水/氫氧化物分子對易裂解酰胺的羰基碳進行親核攻擊來參與反應(yīng)。MBL已在不同國家被確定為Kpn醫(yī)院暴發(fā)的來源。

2.1.3 D類

D類即β-內(nèi)酰胺酶，由于其對β-內(nèi)酰胺的水解活性，最初被定性為苯唑西林酶，最近已成為臨床關(guān)注的問題。D類β-內(nèi)酰胺酶和鄰氯青霉素（Cloxacillin，OXA）變體具有可變但顯著的碳青霉烯酶活性，通常不被克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制（例外：OXA-2和OXA-32被他唑巴坦抑制但不被舒巴坦和克拉維酸抑制，OXA-53被克拉維酸抑制）[5]。近1/3的OXA變體水解碳青霉烯類。產(chǎn)OXA-48 Kpn的最初病例表現(xiàn)為高度耐藥菌株，因為它表達其他β-內(nèi)酰胺酶（A類ESBLs SHV-2a、窄譜內(nèi)酰胺酶TEM 1和OXA-47）[6]。雖然OXA-48是已知的對亞胺培南具有最高催化效率的β-內(nèi)酰胺酶，但含有質(zhì)粒介導的blaOXA-4基因的生物體可有效水解青霉素，而水解碳青霉烯類的水平較低，對超廣譜頭孢菌素的活性較弱，對頭孢他啶和頭孢吡肟的水解活性較差。OXA-163的序列與OXA-48的序列相比，缺少4個氨基酸，對應(yīng)OXA-48序列的位置DBL222至DBL225。目前，已有200多種OXA酶被報道，在Kpn中，OXA-48最常見。

2.2 高產(chǎn)AmpC/ESBLs酶合并OMP缺失或表達量不足

2.2.1 AmpC酶

AmpC β-內(nèi)酰胺酶是一種由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的酶，可以水解廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素，包括氨基青霉素和第一、第二以及第三代頭孢菌素，常見基因型包括blaACC、blaCIT、blaEBC、blaFOX、blaMOX和blaDHAgenes 6個家族[7]。在某些物種中，AmpC β-內(nèi)酰胺酶位于染色體和質(zhì)粒上。AmpC染色體基因向質(zhì)粒轉(zhuǎn)移產(chǎn)生pAmpC，賦予其耐藥性[8]。pAmpC相關(guān)耐藥性的流行率低于ESBLs。

2.2.2 ESBLs

近30年，臨床腸桿菌科分離株中的ESBLs顯著增加。近20年，CTX-M取代SHV，成為全球傳播的主要ESBL類型。亞洲、拉丁美洲和歐洲的研究顯示，大腸埃希菌和克雷伯菌對頭孢菌素的耐藥性急劇增加，這在很大程度上取決于CTX-M型ESBL的傳播[9]。在我國，blaCTX-M-14被確定為最常見的ESBL基因。有人提出，blaCTX-M的質(zhì)粒是產(chǎn)生CTX-M的腸桿菌科細菌增加的主要原因。blaCTX-M基因被發(fā)現(xiàn)與某些復制子類型的質(zhì)粒相關(guān)，主要包括IncF、IncI1、IncN、IncHI2、IncL/M和IncK。其中，IncF被認為在blaCTX-M-15基因的傳播中起重要作用，而IncF、IncK和IncI1在很大程度上有助于blaCTX-M-14基因的傳播。blaCTX-M-3基因主要包含在IncL/M和IncI1質(zhì)粒中，blaCTX-M-9基因主要包含在IncHI2質(zhì)粒中。醫(yī)院感染監(jiān)測系統(tǒng)報告稱，第三代頭孢菌素的耐藥性在5年內(nèi)提高了47%，ESBL的產(chǎn)生在其中起到了至關(guān)重要的作用。

2.2.3 OMP缺失或表達下降

在革蘭氏陰性菌中，OMP充當調(diào)節(jié)細胞外和細胞內(nèi)物質(zhì)（如鐵、營養(yǎng)素和抗生素）交換的通道。在臨床分離株中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)OMP丟失，尤其在產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科中。Kpn包含不同的OMP（OmpK35、36和37）。有報道稱，在Kpn中，兩種主要孔蛋白OmpK35和OmpK36的缺失或表達減少與廣泛的抗菌素耐藥性有關(guān)。在產(chǎn)AmpC β-內(nèi)酰胺酶的Kpn中，OmpK35和OmpK36雙重缺失的后果是產(chǎn)生對亞胺培南的廣泛耐藥性[10]。也有學者認為，Kpn的CR也歸因于孔蛋白丟失和AmpC產(chǎn)生的共同作用，僅這些蛋白質(zhì)中的缺陷不一定會導致臨床上的抗生素耐藥性[11]。

2.3 PBPs位點缺失或數(shù)量下降

PBPs是細菌中所有β-內(nèi)酰胺類抗生素的高親和力靶點。眾所周知，所有β-內(nèi)酰胺類都有相同的作用方式：它們通過充當PBP轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域的底物來抑制細菌細胞壁合成，與PBP的活性位點絲氨酸殘基形成穩(wěn)定的共價復合物。傳統(tǒng)上，PBPs被劃分為高分子質(zhì)量PBPs（HMW-PBPs，包括A和B）以及低分子質(zhì)量PBPs（LMW-PBPs），HMW-PBPs對細胞存活至關(guān)重要，并且是β-內(nèi)酰胺的實際靶標。A類PBP催化聚糖鏈的形成，A類和B類PBP催化細胞質(zhì)膜外側(cè)肽聚糖干肽的交聯(lián)，而LMW-PBPs的作用微乎其微。有報道稱，肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺的敏感性降低在很大程度上與PBP的序列變異相關(guān)，其中，PBP2在CRKP中最常見[12]。

2.4 主動外排泵

主動外排系統(tǒng)的過度表達對Kpn耐藥性的產(chǎn)生也有不可忽視的作用。外排泵，尤其是多藥外排，是藥物治療的主要關(guān)注點，因為它們可以排出多種具有臨床意義的藥物。外排泵在介導對多種藥物和生物膜結(jié)構(gòu)的抗性方面占主導地位[13]，其不僅將給定的抗生素擠出細菌細胞，還充當毒力因子，在感染期間賦予抗菌素耐藥性。簡言之，這些外排系統(tǒng)允許微生物通過排出有毒物質(zhì)（例如代謝物、抗菌劑和毒力決定簇的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)表達）來平衡內(nèi)部環(huán)境。到目前為止，acrAB、oqxAB和kexD外排系統(tǒng)與Kpn的抗生素耐藥性有關(guān)。除了acrAB、kexD、kdeA、kmrA、kpnEF和oqxAB，EefAB、ketM和CepA等少數(shù)其他外排基因也在Kpn中被報道。

2.5 生物膜

生物膜是生活在由多糖、蛋白質(zhì)和細胞外DNA組成的高度水合基質(zhì)中的細菌群落，這種生活方式賦予細菌許多優(yōu)勢（包括抵御外部威脅）。然而，它們也有助于提高細菌對抗菌素的耐藥性。據(jù)報道，19世紀80年代以來，Kpn能在體外作為生物膜生長。Kpn的耐藥性與生物膜形成能力之間存在一定的相關(guān)性已被證實。有研究表明，氨芐西林不能穿透野生型Kpn生物膜，而環(huán)丙沙星和非反應(yīng)性示蹤劑（氯離子）可快速穿透生物膜。氨芐西林只有在由缺乏β-內(nèi)酰胺酶的突變體形成時才能穿透生物膜，證明野生型和突變型Kpn生物膜對氨芐西林和環(huán)丙沙星的耐藥性提高并非由擴散緩慢所致。此外，也有研究證明，聚-b-連接的N-乙酰氨基葡萄糖可以介導生物膜的形成并發(fā)揮一定的作用。

3 結(jié)語

Kpn作為一種機會致病菌，是泌尿、呼吸道和血液感染的主要原因之一。近年來，由于抗生素的廣泛應(yīng)用，Kpn的多重耐藥性也隨之出現(xiàn)。CRKP感染患者的死亡率較高，如何處理CRKP是臨床上亟待解決的重要問題，開展CRKP對碳青霉烯類耐藥機制的研究、尋找有效的治療策略勢在必行。