趙立群，田 文，田雅楠，曹玲玲，徐秀蘭

（1北京市農(nóng)業(yè)技術推廣站，北京 100029；2中國農(nóng)業(yè)大學植物病理系，北京 100093；3北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北京蔬菜種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100097）

0 引言

種苗生產(chǎn)集約化是蔬菜生產(chǎn)現(xiàn)代化的第一要素。中國每年育苗移栽蔬菜的種苗需求量約為6800億～7300億株，目前全國的集約化育苗量僅有1000億株，發(fā)展?jié)摿皠蓊^仍十分迅猛[1]。北方地區(qū)一般利用日光溫室進行蔬菜集約化育苗生產(chǎn)，可以在設施內(nèi)進行有效的環(huán)境調(diào)控，保證幼苗生長所需環(huán)境條件[2]。規(guī)?；s化育苗場年育苗量一般在500萬株以上，包括番茄、黃瓜、辣椒、茄子、西瓜、花椰菜、芹菜等多個品種[3-5]。由于蔬菜品種眾多，育苗數(shù)量較大且空間密集，各類病害可能隨種苗調(diào)運加速傳播，育苗場對環(huán)境消毒和病害防治尤為重視，以免對生產(chǎn)造成嚴重影響[6-7]。與常規(guī)蔬菜栽培生產(chǎn)溫室的消毒不同，育苗溫室無需進行土壤消毒[8-9]，而需著重對棚室內(nèi)環(huán)境，包括棚膜內(nèi)表面和育苗床架等進行消毒，目前尚未有利用辣根素對育苗溫室消毒處理的報道。

溫室消毒一般利用育苗淡季的7—9月間開展，高錳酸鉀+甲醛等藥劑熏蒸處理和廣譜性殺菌劑噴霧處理是最常見的2種育苗溫室消毒方式[7,10]。近年來，隨著提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和質(zhì)量安全的需求日益增加，減少使用高毒化學農(nóng)藥已成共識，生物源農(nóng)藥作為替代產(chǎn)品被越來越多地研究和應用。其中，辣根素是從辣根Armoracia rusticana(Lam.)Gaertn.,B.Mey.etScherb.等十字花科植物中提取出來的一類次生代謝產(chǎn)物，主要化學成分為異硫氰酸烯丙酯，其對倉儲害蟲、病原微生物、根結線蟲、雜草等有害生物都呈現(xiàn)出良好的生物活性[11]。已有研究表明，實驗室培養(yǎng)條件下，辣根素對26種常見的植物病原真菌、卵菌及細菌具有不同程度的熏蒸抑制活性[12]，應用于設施土壤消毒可以有效殺滅土壤中的微生物[13]，并減少草莓白粉病[14]、西瓜枯萎病的發(fā)病率[15]，辣根素與苦參堿復配悶棚處理可對線蟲病害進行防控[16]。

本試驗選取位于北京大興區(qū)、通州區(qū)的3家中大型育苗場的日光溫室，采用辣根素藥劑噴霧后悶棚處理方式進行棚室消毒，對比處理前后溫室環(huán)境、棚膜及育苗床架上微生物的數(shù)量及種類，并通過ITS測序明確病害種類，分析辣根素藥劑施用對育苗溫室的消毒效果，為生產(chǎn)實踐提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗地點

選擇位于北京通州和大興的3個育苗場的日光溫室（編號分別為溫室一、溫室二、溫室三），均進行多種果菜和葉菜類蔬菜作物的集約化育苗生產(chǎn)，育苗場年育苗量都在800萬株以上。3個育苗溫室面積及上個生產(chǎn)年度育苗作物分別如表1所列。

表1 實驗育苗溫室面積及生產(chǎn)情況列表

1.2 溫室消毒處理

試驗于各育苗溫室上茬生產(chǎn)結束后（2019年6月25日—28日）進行，溫室內(nèi)無作物。溫室消毒處理使用藥劑為：辣根素水乳劑（芥菜型，有效成分20%，云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司生產(chǎn)），兌水稀釋7.5倍使用，采用背負式常溫煙霧機噴施，用量為450 L/hm2，施藥后密閉悶棚48 h后放風再次取樣。

1.3 溫室空氣微生物檢測

采用自然沉降法進行溫室空氣中的微生物種類及數(shù)量檢測[17]。溫室消毒前和消毒后分別在固定位置放置營養(yǎng)肉汁酵母液瓊脂培養(yǎng)基(NBY)和乳酸馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(aPDA)平皿，每個溫室放置地點為兩端和中央（圖1），共6個位置（圖1中●位置），每個位置放置2種培養(yǎng)基各1個平板，開蓋自然沉降10 min后，用封口膜將培養(yǎng)皿密封。將培養(yǎng)皿編號后帶回實驗室，28℃培養(yǎng)觀察菌落并計數(shù)。

圖1 溫室采樣取樣點示意圖

1.4 溫室設施表面微生物檢測

通過無菌擦拭棒擦拭溫室設施內(nèi)表面收集表面真菌、細菌，再進行培養(yǎng)。具體操作如下：消毒處理前后分別在育苗溫室3處固定位置（圖1中▲位置）的棚膜及育苗床架使用無菌擦拭棒(3M SPONGE-STICK)進行擦拭取樣，每次擦拭面積約60 cm2，擦拭棒放回樣品袋密封帶回實驗室進行下一步操作。在樣品袋中加入30 mL PBS緩沖液，用均質(zhì)器震蕩30 s，將緩沖液轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，10000 r/min離心10 min，倒去上清液加入1 mL無菌水均勻懸浮沉淀，取適量懸浮液進行10倍梯度稀釋，每個稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂布到aPDA培養(yǎng)基及NBY培養(yǎng)基。每天觀察培養(yǎng)基真菌、細菌生長情況，并計數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)量推算出溫室設施表面的帶菌量（個/cm2），計算見公式(1)。

1.5 真菌、細菌種類鑒定

將分離到的不同種類的真菌轉(zhuǎn)移到aPDA培養(yǎng)基，細菌轉(zhuǎn)到NBY培養(yǎng)基上純化。真菌通過顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)，結合真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學特征，參考相關工具書和文獻鑒定到屬[18-19]，并通過真菌、細菌ITS通用引物進行PCR擴增、測序分析進一步鑒定到種[20]。詳細操作為：取真菌菌絲于1.5 mL離心管中，編號，放入液氮中充分冷卻后取出充分研磨，之后采用核酸提取試劑盒（博邁德）提取DNA。以上述提取總DNA為模板，用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增[21]。細菌ITS擴增引物為8F/1492R[20]。PCR擴增體系為2 × Easy Taq pcr Supermix 25 μL，引物2 μL，ddH2O 19 μL，檢測樣品2 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃（真菌ITS）或50℃（細菌ITS）退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，終止溫度為4℃。反應結束后取5 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳確認片段大小后，PCR產(chǎn)物送至公司測序（北京三博遠志生物技術有限公司）。測序結果進行BLAST序列比對，鑒定到屬或種。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗主要取得數(shù)據(jù)包括：消毒處理前后溫室空氣中真菌、細菌數(shù)量通過沉降平板檢測數(shù)據(jù)；溫室設施棚膜、育苗床表面通過擦拭采集培養(yǎng)獲得的真菌、細菌數(shù)量數(shù)據(jù)。溫室設施表面菌量數(shù)據(jù)進行l(wèi)og轉(zhuǎn)換后比較分析。采用Minitab軟件（版本：18）對總體消毒效果進行消毒處理、溫室地點的雙因素方差分析，對單個溫室的消毒處理效果進行單因素方差分析(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 消毒處理及不同溫室的消毒效果總體分析

綜合比較分析溫室之間與消毒處理對溫室環(huán)境微生物的影響發(fā)現(xiàn)：不同溫室間空氣中菌量即沉降平板菌量，不論真菌和細菌均存在顯著性差異，而設施表面菌量無顯著差異；消毒處理前后，溫室空氣中真菌數(shù)量及溫室設施表面細菌數(shù)量存在顯著差異，而溫室空氣中細菌數(shù)量及溫室設施表面真菌數(shù)量無顯著差異（表2）。

表2 消毒處理及不同溫室對菌落數(shù)影響的雙因素方差分析結果（P值）

2.2 消毒處理前后溫室空氣中真菌、細菌數(shù)量比較

鑒于2.1中分析得出不同溫室之間環(huán)境本身存在一定差異，分別對每個溫室消毒處理前后空氣的真菌、細菌數(shù)量進行了比較分析。結果表明：所有溫室的沉降平板真菌菌落數(shù)量在消毒處理后均顯著下降（圖2）。同時，除溫室一消毒處理前后細菌數(shù)量差異不顯著外，另2個溫室的沉降平板的細菌菌落數(shù)在消毒處理后也顯著降低（圖3）。

圖2 消毒處理前后沉降平板真菌菌落數(shù)比較分析

圖3 消毒處理前后沉降平板細菌菌落數(shù)比較分析

2.3 消毒處理對溫室表面細菌消毒效果

根據(jù)2.1中分析消毒處理后對溫室表面的真菌數(shù)量影響不顯著，因此單獨針對每個溫室的棚膜表面和育苗床表面細菌數(shù)量做了差異性比較與分析。結果表明：3個溫室中棚膜表面、育苗床表面細菌數(shù)量在消毒處理后均有所下降。尤其溫室二和溫室三中的育苗床表面細菌帶菌數(shù)量在處理后與處理前相比顯著降低，菌落總數(shù)約降低了1個數(shù)量級，達到90%以上的殺菌效果（表3）。

表3 消毒處理對溫室設施表面細菌消毒效果

2.4 溫室環(huán)境沉降真菌、細菌種類鑒定分析

通過ITS測序鑒定出的沉降平板真菌種類主要有5 種 ：Alternaria、Rhizopus、Aspergillus、Penicillium、Curvularia，其中溫室一檢測到上述全部真菌，溫室二檢測到上述前4種真菌，溫室三檢測到上述前3種真菌。在檢測到的真菌中，Alternaria中有2個種為植物致病菌，分別是 Alternaria tenuissima、Alternaria.Alternata，通過消毒處理前后的分析比較發(fā)現(xiàn)，主要真菌尤其是植物致病菌的數(shù)量在處理后都明顯下降（表4）。此外處理前后的主要菌群有明顯變化，如溫室二處理前主要是致病菌鏈格孢Alternaria分離比率最高，占40.84%，而處理后鏈格孢比率下降，曲霉Aspergillus比例上升至63.46%。

表4 沉降平板真菌種類消毒處理前后對比

沉降平板分離純化細菌，通過ITS測序鑒定細菌類別較多，共18種（表5），但未發(fā)現(xiàn)重要植物病原細菌。

表5 沉降平板細菌種類鑒定結果

3 結論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，辣根素噴霧對3個育苗溫室都有較好的消毒效果，雖然3個育苗場地理位置相近、生產(chǎn)作物相似，但溫室內(nèi)空氣帶菌量差異顯著，可能由于空棚期進行空氣采樣容易受到溫室周圍環(huán)境、溫室通風情況等影響；而苗床和棚膜等設施表面帶菌量無顯著差異，則可能由于設施表面的附著菌相對固定且較空氣中數(shù)量少，主要與作物種類、發(fā)病情況、生產(chǎn)和用藥習慣等相關。

已有研究表明，一定濃度的辣根素對真菌[12-13,22]、細菌[12]都具有顯著的抑制作用，而本研究也表明，所有溫室的沉降平板真菌菌落數(shù)量在消毒處理后均顯著下降，其中2個溫室的沉降平板的細菌菌落數(shù)也在消毒處理后顯著降低。同時，消毒處理后，所有溫室棚膜表面和育苗床表面的細菌總菌量也有所下降。尤其溫室二和溫室三中的育苗床表面帶菌量在處理后顯著降低，菌落總數(shù)甚至降低了將近1個數(shù)量級，達到90%以上的殺菌效果，顯示出辣根素熏蒸對溫室環(huán)境空氣、尤其是內(nèi)部及設備表面附著菌的殺菌效果非常顯著。

本實驗通過ITS測序鑒定出沉降平板真菌5種、細菌18種，其中含植物致病真菌鏈格孢屬2種。鏈格孢屬真菌是引起蔬菜發(fā)病的主要病原菌，可侵染約100種蔬菜，嚴重威脅著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[23]。本研究鑒定出的細極鏈格孢菌A.tenuissima、鏈格孢A.alternate2個植物致病菌種，分別可引發(fā)西蘭花黑斑病、白菜黑斑病[24]，番茄早疫病[25]及白菜黑斑病、甘藍黑斑病、青花菜黑斑病、番茄早疫病、茄子葉斑病、辣椒葉斑病[23]、甜椒黑斑病、甜椒早疫病[26]、番茄莖枯病[27]等多種病害。以番茄早疫病為例，其在集約化育苗生產(chǎn)中為常見病害，即使秧苗肉眼所見不發(fā)病，帶菌檢出率也可高達86.67%[28]。實驗結果再次證明蔬菜生產(chǎn)從苗期開始即容易接觸和攜帶病原菌，專業(yè)集約化育苗場更應從源頭重視環(huán)境消毒和病蟲害防治，或可建立對出圃幼苗進行常見病害抽檢，以培育無病健壯幼苗，減少苗期病害隨種苗調(diào)運傳播，危害田間生產(chǎn)。

辣根素是自然界的天然產(chǎn)物，易降解且對環(huán)境污染的可能性極小，推進以其為代表的植物源藥劑使用具有積極意義。本項研究采用辣根素進行育苗溫室消毒處理結果表明，處理后溫室環(huán)境空氣中的真菌及細菌數(shù)量均有顯著降低，溫室設施棚膜及育苗床表面細菌量均有所下降，部分溫室育苗床表面菌落數(shù)降低達到1個數(shù)量級，效果十分顯著。同時，消毒處理還顯著降低了5類測序鑒定出的真菌，尤其是2類植物致病真菌的數(shù)量和分離比率?？傊?，本實驗表明，辣根素作為育苗溫室消毒藥劑對溫室環(huán)境及設施表面具有較好的消毒效果，可在生產(chǎn)中進一步推廣應用，下一步將對辣根素作為溫室熏蒸藥劑對于植物病原細菌的殺滅效果進行研究驗證。