冷雨澤，張璐莎，孫偉，李夢瑤，薛岳進，陳璐，王虹

外周血管疾病是由于外周動脈血管狹窄或閉塞導致的肢體缺血性疾病，已成為威脅人類健康的主要疾病之一[1]。缺氧是組織缺血后最主要的病理表現(xiàn)，組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號分子可動員骨髓內皮祖細胞（EPCs）至外周循環(huán)，并歸巢于損傷內皮參與新生血管的形成。Morishita等[2]研究表明，EPCs可分化為成熟內皮細胞，在心肌缺血和血管損傷時，EPCs可誘導血管生成和血管修復。在機體缺血或細胞因子的作用下，EPCs動員到外周循環(huán)并歸巢至缺血組織，在局部分泌血管新生相關的因子，分化、增殖形成內皮細胞與新生血管，促進內皮損傷修復[3]。激活基質金屬蛋白酶9（MMP9）通路可動員骨髓EPCs進入血液循環(huán)，以修復血管內皮[4]；肝細胞生長因子（HGF）其刺激有絲分裂、細胞運動和基質侵襲的能力使其在血管生成、腫瘤發(fā)生和組織再生中發(fā)揮中心作用，能夠顯著提高EPCs的遷移能力[5]，CXC型趨化因子配體16（CXCL16）及其受體介導EPCs募集和血管形成，EPCs通過分泌單核細胞趨化性蛋白1（MCP-1）提供血管生成環(huán)境[6,7]。由于缺血區(qū)細胞存活率較低，且EPCs擴增能力及自我更新能力有限，因此如何促進EPCs動員仍需進一步的研究。千層紙素A（又名千層紙黃素，木蝴蝶素），屬于次生代謝產(chǎn)物，為黃酮類化合物。本課題組前期研究結果表明，千層紙素A可通過內皮依賴的一氧化氮途徑發(fā)揮舒張血管的作用[8]，提示千層紙素A可用于外周血管疾病的治療。證據(jù)表明，內皮祖細胞從骨髓動員到外周血液中，遷移到缺血部位發(fā)揮促血管新生的作用[9,10]。本研究采用小鼠后下肢缺血模型，通過激光多普勒成像儀（USA）觀察到千層紙素A對后下肢缺血損傷小鼠血流具有恢復作用，從而進一步發(fā)現(xiàn)千層紙素A可促進后下肢缺血小鼠腓腸肌組織中EPC的動員，最終發(fā)現(xiàn)千層紙素A可上調血管新生相關的蛋白或因子基質金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、CXCL16、MCP-1、HGF的表達。表明千層紙素A通過促進EPCs動員來改善缺血癥狀可能與調節(jié)血管新生相關蛋白或因子有關，可為治療缺血性疾病提供臨床前證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物30只SPF級健康ICR小鼠，雄性，體質量（30±2）g，8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。實驗動物于天津市中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學放射工程研究所動物房中分籠飼養(yǎng)，自由進食，飼養(yǎng)溫度22～25℃，相對濕度40%～60%。

1.1.2 藥物與試劑千層紙素A，天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院藥學部提供，由中藥杜仲中分離提取，經(jīng)核磁共振（NMR）譜數(shù)據(jù)分析鑒定；辛伐他汀（杭州默沙東制藥有限公司，批號L0233822）；avertin（美國Sigma公司）；流式抗體PE-Flk-1，APC-Cy7-Sca-1（Becton，Dickin-son and Company；貨號分別為555308、560654）。實驗用水為去離子水。全蛋白提取試劑盒，甘氨酸（glycine），Amresco公司；SDS，Sigma公司；5×SDS上樣緩沖液，碧云天公司；Anti-MMP-9 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-MMP-3 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-beta Actin antibody（美國Abcam公司，貨號ab6276）；小鼠肝細胞生長因子檢測試劑盒（北京索萊寶公司，貨號:SEKM-0089）。

1.1.3 儀器體式顯微鏡LEICA S8APO（德國Leica公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）；小動物手術器械包（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；COMPAC5小動物多功能麻醉機（美國VETEQUIP）；純水系統(tǒng)，美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單側后肢缺血模型（HLI）的建立根據(jù)文獻方法建立小鼠單側后肢缺血損傷模型。以15 mg/ml阿佛丁（16.5 ml/kg）腹腔注射行全身麻醉，取仰臥位固定后備皮。自右后肢腹股溝處做橫向切口，鈍性分離肌肉，暴露股動脈、股靜脈和伴行神經(jīng)，其中股動靜脈起源于髂外動脈終止于隱靜脈和隱動脈，以7/0號絲線結扎骨深動脈起始處血管，離斷并剪掉股動脈及其分支，逐層縫合肌肉和皮膚，左側后肢作為非缺血肢體對照。術后腹腔注射0.2 ml濃度為5 mg/ml抗生素，防止感染。采用激光多普勒掃描成像系統(tǒng)檢測小鼠結扎并離斷股動脈前后結扎部位的血流速度，術后血流速度降至術前的10%以下，且血流的頻譜發(fā)生明顯的改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標準，將小鼠置于37 ℃電熱毯上直至蘇醒。

1.2.2 實驗分組及用藥按照隨機雙盲的方法，將后下肢缺血模型造模成功的小鼠分成三組：模型組、千層紙素A組（Oroxylin A）和辛伐他汀組（Sim），每組各10只。為便于分組及觀察，在小鼠尾部涂上橫條紋，以示不同號碼。模型組采用0.2%CMC-Na的生理鹽水灌胃；千層紙素A組采用千層紙素A 10 mg/kg·d，灌胃；辛伐他汀組采用辛伐他汀10 mg/kg·d，灌胃。術后1 h給藥；模型組給予同體積的0.2%CMC-Na的生理鹽水，連續(xù)給藥3、7、14、28 d。

1.2.3 相關檢測方法

1.2.3.1 激光多普勒高分辨點掃描檢測小鼠后肢血流灌注為評價各組小鼠結扎肢體血流灌注恢復程度，采用激光多普勒灌注成像儀來測量術前、術后及給藥后3、7、14、28 d這6個不同時間點的缺血側（右側后肢）的血流灌注情況與未缺血對側（左側后肢）的血流灌注。用分析軟件（moor LDI laser Doppler Imager Review V 6.0）分析血流灌注情況，通常把背景閾值設置為0.2，以閾值調整去除背景噪音，選擇目的檢測區(qū)域經(jīng)過軟件表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一時間點的缺血側與未缺血側的血流灌注情況的比值表示這只小鼠的缺血下肢血流恢復情況。

1.2.3.2 染色法檢測缺血小鼠腓腸肌組織形態(tài)將各組小鼠的腓腸肌組織，浸入10%多聚甲醛溶液中，備用于組織切片，經(jīng)脫蠟、切片、脫蠟脫水、清洗、染色等步驟處理后，組織鏡檢觀察標本著色情況。若著色較好，染色核漿分明，紅藍適度，透明潔凈，可用中性樹膠封片；晾片后可閱片拍照。

1.2.3.3 流式細胞術檢測EPCs動員采用FACS流式細胞儀檢測單個核細胞懸液，每份標本檢測10萬個細胞，以GFP+/Flk-1+/Sca-1+細胞占單核細胞的比例表示外周血內皮祖細胞數(shù)量，采用Cell Quest軟件分析并記錄外周血單個核細胞中GFP+/Flk-1+/Sca-1+內皮祖細胞的比例。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血管新生相關因子嚴格按照說明書要求規(guī)范操作，采用ELISA法分別測定術后3、7、14 d，小鼠血漿中血管新生相關因子HGF的表達水平，酶標儀檢測吸光度值，應用標準曲線計算濃度。

1.2.3.5 蛋白芯片檢測血管新生相關蛋白按照蛋白芯片（R＆D公司，貨號：ARY028）說明書操作，檢測術后3、7、14 d，CXCL16、MCP-1蛋白的變化。

1.2.3.6 蛋白免疫印跡法檢測血管新生相關蛋白提取骨髓總蛋白，BCA法測定骨髓組織總蛋白的濃度，分裝蛋白樣品。通過電泳、轉膜、封閉、加入一抗Anti-MMP 9 antibody（1:500）、Anti Anti-MMP 3 antibody（1:500）、-beta Actin antibody（1:5000）孵育，加入對應二抗（1:10000）顯色，膠片掃描分析后分析MMP3、MMP9蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 千層紙素A對后下肢缺血損傷小鼠血流恢復作用課題組前期實驗中，應用小鼠后下肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)千層紙素A中劑量（10 mg/kg·d）組較低劑量組和高劑量組效果顯著，本研究采用中劑量進一步探討千層紙素A促血管新生的作用機制。模型組（Model）、千層紙素A組和辛伐他汀組（Sim）小鼠單側后肢缺血損傷模型術前、術后及術后3、7、14、28 d，采用激光多普勒成像儀測定小鼠下肢血流，激光多普勒成像系統(tǒng)采集小鼠股動脈結扎前、結扎后、給藥后1、3、7、14、28 d的血流灌注情況和小鼠股動脈結扎側與正常側后肢血流比值動態(tài)分析結果圖。如圖1A所示，與模型組相比，千層紙素A組小鼠下肢血流明顯改善，術后14、28 d，與模型組相比，千層紙素A組和辛伐他汀組缺血組織血流恢復顯著提高，圖1B為量化結果。給藥28 d，小鼠腓腸肌組織HE染色結果如圖1C所示，后下肢缺血小鼠給予千層紙素A治療，與模型組相比，肌肉組織形態(tài)較規(guī)則，肌束間隙明顯變小，有較明顯的腓腸肌缺血損傷修復作用。結果表明，術后14、28 d，千層紙素A可促進小鼠缺血下肢血流恢復。

圖1 千層紙素A對后下肢缺血小鼠血流恢復的影響

2.2 千層紙素A對HLI小鼠腓腸肌組織中EPC動員的影響應用流式細胞術采集小鼠股動脈結扎前后、給藥1、3、7 d的外周血中內皮祖細胞數(shù)量，外周血中GFP+/Sca-1+/Flk-1+細胞比例動態(tài)分析結果見圖2，圖2 B結果顯示，給藥1 d，千層紙素A組（3.67±3.03）和假手術組（2.67±1.73）外周血內皮祖細胞比例顯著高于模型組（0.88±0.75），P＜0.05。

圖2 千層紙素A對后下肢缺血小鼠內皮祖細胞動員的影響

2.3 千層紙素A對HLI小鼠血管新生相關蛋白及HGF因子的影響

2.3.1 千層紙素A對小鼠缺血腓腸肌MMP3，MMP9蛋白表達的影響給藥14 d時缺血腓腸肌組織Western blot結果顯示（圖3），在給藥第3 d時與模型組比較，千層紙素A治療組MMP3、MMP9的表達量均顯著下降；給藥第14 d時與模型組相比較，千層紙素A組MMP3的表達量呈現(xiàn)顯著下降趨勢；千層紙素A對后下肢缺血小鼠血漿中HGF因子濃度的影響如圖4所示。給藥第3 d時與模型組比較，千層紙素A治療組HGF的濃度顯著上升（P＜0.05）。

圖3 Western blot檢測后下肢缺血小鼠給藥3、7、14 d缺血肌肉組織MMP3、MMP9蛋白和血漿HGF因子的表達

2.3.2 千層紙素A對小鼠缺血腓腸肌CXCL16、MCP-1蛋白表達及血漿中HGF因子的影響給藥14 d時缺血腓腸肌組織蛋白芯片結果如圖4所示，在給藥第3 d時與模型組比較，千層紙素A治療組CXCL16的表達量顯著上升（P＜0.001）；給藥第14 d時與假手術組相比較，模型組的CXCL16表達量呈現(xiàn)顯著上升趨勢（P＜0.001）；給藥第7 d時與假手術組比較，模型組的MCP-1的表達量顯著下降（P＜0.01），千層紙素A組與模型組比較表達量顯著上升（P＜0.05）。

圖4 蛋白芯片和ELISA檢測后下肢缺血小鼠給藥14 d缺血肌肉組織CXCL16和MCP-1蛋白的表達

3 討論

本研究首先通過實驗發(fā)現(xiàn)千層紙素A對后下肢缺血損傷小鼠具有血流恢復作用，進一步得到千層紙素A可以動員內皮祖細胞促進血管新生，其作用機制可能與促進EPCs動員和血管新生的關鍵調節(jié)蛋白或因子MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1有關。內皮祖細胞與缺血性疾病有密切關聯(lián)，組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號分子可動員骨髓EPCs至外周循環(huán)，并歸巢于損傷內皮參與新生血管的形成，從而改善后下肢缺血的癥狀[11]。

內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，具有多向分化潛能，是一類能增殖、分化為血管的內皮細胞，臨床價值巨大。在某些生理或病理因素的刺激下，從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復[12]。MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1是促進EPCs動員和血管新生的關鍵調節(jié)因子。研究顯示，間充質干細胞通過產(chǎn)生肝細胞生長因子（HGF）、基質金屬蛋白酶MMP-9和MMP-3提供血管生成環(huán)境，并在小鼠中與內皮祖細胞共注射時誘導血管形成[13]。

新生血管通過兩種機制產(chǎn)生：一是先前存在的微血管內皮細胞的復制和重組；二是重新招募內皮祖細胞，這些內皮祖細胞隨后并入現(xiàn)有組織，分化為成熟的功能性內皮細胞[14]。人類和小鼠的內皮祖細胞已被證明可表達CXCL16受體CXCR6[15]，且CXCL16和MCP-1均具有促進血管生成的作用[16]。一定條件下，EPCs可誘導分化為血管內皮細胞，還可分泌大量與血管新生相關的生長因子，作用于自身和體細胞調節(jié)血管再生。因此，血管新生相關因子的分泌對于緩解缺血情況，改善缺血性疾病的癥狀尤為重要。

千層紙素A給藥后，外周血中代表內皮祖細胞的GFP+/Sca-1+/Flk-1+細胞數(shù)量明顯高于模型組，提示千層紙素A通過改善缺血組織微環(huán)境來促進骨髓內皮祖細胞的動員。在第7 d時，千層紙素A增加對HLI小鼠腓腸肌組織中血管新生相關因子或蛋白CXCL16，MCP-1的表達，提示千層紙素A可提供更好的血管生成環(huán)境，募集EPC,促進血管生成。病理狀態(tài)下，模型組MMP調節(jié)功能下降，不利于內皮細胞遷移功能的發(fā)揮，使得血管新生功能降低。而千層紙素A組基質金屬蛋白酶MMP3，MMP9蛋白的表達升高，提示千層紙素A可能通過激活MMP-9通路動員骨髓EPCs進入血液循環(huán)，修復血管內皮，一定程度上可促進血管新生，緩解下肢缺血。此外，MMP還是一種炎性介質，適當調節(jié)MMP表達有利于新生血管的結構與功能的穩(wěn)定。結果顯示，在給藥后第3 d，與模型組比較，千層紙素A治療組HGF的濃度顯著上升，提示千層紙素A可能提高了EPCs的遷移能力，使其更好的促進血管生成。

綜上可知，千層紙素A能夠促進EPCs分泌釋放血管新生所必需的因子MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1，可能是千層紙素A促進EPCs介導的血管新生作用機制之一。然而千層紙素A促進骨髓EPCs動員的機制及其促血管新生的具體過程尚待進一步研究。本研究結果對于千層紙素A用于治療缺血性疾病提供了實驗依據(jù)。