徐碩，何穎慧，張子豪，賀明，翟玉涵，于少軒

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 山東 淄博 255049)

還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-半胱氨酸、γ-L-谷氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，是機體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)[1-2],因含有巰基、γ-谷氨?；榷喾N官能團而表現(xiàn)出抗氧化、解毒、清除自由基、抗輻射、維護蛋白質(zhì)和免疫系統(tǒng)功能正常等作用[3]。但GSH在體內(nèi)循環(huán)周期短、易氧化、不能穿過細胞膜, 這限制了其在保健、醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用[4-5]。研究表明，微納米包埋技術(shù)能夠有效提高GSH穩(wěn)定性和透過細胞膜的能力[6]。杜歌[7]以明膠和阿拉伯膠為壁材，利用復(fù)合凝聚法制備包埋GSH的微膠囊，包埋率較高，且在高溫下對GSH具有一定的保護作用。Naji-tabasi等[8]利用羅勒籽膠對GSH進行了包埋，制備的GSH納米顆粒在胃腸道環(huán)境中仍具有很好的穩(wěn)定性。另外，Joy等[9]發(fā)現(xiàn)包埋到納米脂質(zhì)體中的GSH能夠增強藥物進入大腦的傳遞能力。

脂質(zhì)體作為一種由脂質(zhì)雙分子層包裹水溶液形成的微型囊泡體,不僅能夠包埋親脂性化合物，還能包埋親水性化合物[10]。當GSH被包埋到脂質(zhì)體中時，雙分子層能夠減少氧氣、金屬離子等環(huán)境因素對其的影響，增加GSH的穩(wěn)定性；另外，由于磷脂雙分子層與細胞膜有很高的親和力, 所以更容易將GSH輸送到細胞內(nèi), 同時可以避免GSH被分解破壞, 使GSH能夠緩慢釋放,提高生物利用度[11]。將GSH包埋到脂質(zhì)體中的方法有很多，如pH梯度法、乙醇注入法、反相蒸發(fā)法、薄膜-超聲法等[12]。本文采用薄膜-超聲法制備還原型谷胱甘肽納米脂質(zhì)體，以包埋率為指標，通過單因素實驗和響應(yīng)面法對各個影響因素(如卵磷脂的添加量、吐溫-80的添加量、GSH的添加量、超聲時間以及卵磷脂與膽固醇的比例)的相互作用進行研究，以期得到高包埋率GSH納米脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝參數(shù)，為其在食品和醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

還原型谷胱甘肽(GSH)，山東金城生物藥業(yè)有限公司；大豆卵磷脂，上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇，索萊寶生物科技有限公司；吐溫-80，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；還原型谷胱甘肽含量檢測試劑盒，索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY99-ⅡD超聲破碎儀，北京佳源興業(yè)科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；5039R型離心機，德國Eppendorf公司；FE20pH儀，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 GSH標準曲線的繪制

GLip能和5-5-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)生成2-硝基-5-巰基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物，2-硝基-5-巰基苯甲酸呈現(xiàn)黃色，且在波長412 nm處有最大吸收值[13]。取1 mg GSH標準品用1 mL蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的GSH儲備溶液。取適當?shù)膬淙芤合♂尦少|(zhì)量濃度梯度為12.5、25、50、100、200 μg/mL的標準品溶液，然后按照還原型谷胱甘肽含量檢測試劑盒的說明書，在離心管中順序加入20 μL標準品溶液、140 μL還原型谷胱甘肽含量測試試劑盒中試劑二、40 μL試劑三，混合均勻，靜置2 min后在412 nm處測定其吸光度。以GSH的質(zhì)量濃度為橫坐標，以412 nm處的吸光度為縱坐標，繪制GSH的標準曲線。

1.3.2 還原型谷胱甘肽納米脂質(zhì)體的制備

本文根據(jù)Lasicd[14]的薄膜-超聲法制備包埋了GSH的納米脂質(zhì)體 (GLip)。稱取一定量的卵磷脂、膽固醇和吐溫-80溶于15 mL的無水乙醇中，將混合溶液倒于圓底燒瓶，并在50 ℃、-0.1 MPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機相，在瓶壁形成均勻透明的薄膜。然后，加入20 mL、0.05 mol/L、pH 6.0的PBS溶液在50 ℃、常壓的條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水合30 min洗膜；薄膜洗下來后，將磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液在冰浴中以250 W的功率進行超聲處理，處理時采用工作1 s暫停1 s的工作模式，在20 ℃靜置2 h，得到GLip，將得到的GLip樣品轉(zhuǎn)移到超濾離心管(截留分子量的大小為10 kDa)的內(nèi)管中，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，收集超濾離心管外管中的濾液。向內(nèi)管中加入2 mL蒸餾水，將GLip濃縮溶液重新分散后，在3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下再次離心20 min，并收集超濾離心管外管中的濾液。為了將未形成GLip的物質(zhì)與GLip分離，該步驟重復(fù)3次。最后，將超濾離心管內(nèi)管中的GLip濃縮溶液全部移出，將收集到的濾液全部混合，并在4 ℃下貯存，等待測定。

1.3.3 GLip包埋率的測定

準確吸取超濾離心管外管濾液100 μL，適當稀釋后，根據(jù)1.3.1中描述的測定方法及GSH的標準曲線測定濾液中游離GSH的含量，并根據(jù)式(1)計算GLip中GSH的包埋率。

(1)

式中：Wtotal為制備時加入的GSH總量；Wfree為測得的游離GSH的量。

1.3.4 工藝參數(shù)的優(yōu)化

以包埋率為指標，對GLip制備過程中卵磷脂的添加量(100、150、200、250、300、350 mg)、吐溫-80的添加量(40、60、80、100、120、140 mg)、GSH的添加量(30、40、50、60、70、80 mg)、超聲時間(5、10、15、20、25、30 min)以及卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1)等參數(shù)進行單因素實驗，并根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取卵磷脂的添加量、GSH的添加量、吐溫-80的添加量為自變量，設(shè)計三因素三水平17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗。

1.3.5 GLip粒徑的測定

取1 mL GLip樣品用超純水稀釋10倍,然后用電位-粒度分析儀測定樣品的粒徑和表面電荷，測定溫度為20 ℃，磷脂和分散介質(zhì)的折射比值為1.330。每個樣品平行測定3次以上。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，擬合二階多項式方程，對回歸線性方程的系數(shù)進行顯著性檢驗(F檢驗)，分析總結(jié)選取的單因素對GLip中GSH包埋率的影響。利用Design-Expert V8.0.6軟件將獲得的二階多項式方程轉(zhuǎn)化為響應(yīng)曲面，進一步分析實驗因素及水平對GLip包埋率的影響[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH含量的測定

根據(jù)1.3.1繪制的GSH標準曲線如圖1所示。由圖1可以看出，在0～200 μg/mL的范圍內(nèi)，GSH的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.002 1x+0.004 7，R2=0.999 2。根據(jù)標準曲線計算出樣品中GSH的質(zhì)量濃度，進而求出GSH的質(zhì)量。

圖1 GSH標準曲線圖

2.2 GLip平均粒徑

GLip平均粒徑為(77.70±0.87) nm，PDI為(0.219±0.005)，Zeta電位為(-27.20±0.031) V。此納米級GLip顆粒的粒徑分布比較均勻，較穩(wěn)定。

2.3 單因素實驗對GLip包埋率影響

2.3.1 卵磷脂的添加量對包埋率的影響

根據(jù)預(yù)實驗，固定卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，吐溫-80的添加量為100 mg，GSH的添加量為70 mg，研究卵磷脂的添加量為100、150、200、250、300、350 mg時對GLip包埋率的影響。由圖2可以看出，當卵磷脂的添加量小于200 g時，GLip的包埋率與卵磷脂的添加量成正比，這主要是因為卵磷脂增多后可以形成更多的磷脂雙分子層，進而包裹更多的GSH，使GLip的包埋率提高；當卵磷脂的添加量為200 g時，GLip的包埋率達到最高，約為63%；當卵磷脂的添加量大于200 g時，GLip的包埋率基本不變，這可能是由于磷脂雙分子層包埋GSH有一定的限度，達到包埋GSH的最大量后趨于飽和。另外，本文采用薄膜-超聲法制備GLip，如果制備體系中卵磷脂的添加量過高,則會造成旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后成膜不均勻，用PBS溶液洗膜時較困難。

圖2 卵磷脂添加量對GLip包埋率的影響

2.3.2 卵磷脂與膽固醇的比例對包埋率的影響

固定卵磷脂的添加量為200 mg，吐溫-80的添加量為100 mg，GSH的添加量為70 mg,研究卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1)對GLip包埋率的影響。如圖3所示，隨著卵磷脂和膽固醇比例的增加，GLip的包埋率先升高后降低，當卵磷脂和膽固醇的比例為4∶1 時，GLip的包埋率達到最大，約為55%。這主要是由于膽固醇是一種脂類物質(zhì)，可以進入磷脂雙分子層內(nèi)部，增強磷脂雙分子排列的緊密程度，使得成膜穩(wěn)定，提高Glip包埋率。但是當添加的卵磷脂和膽固醇的比例大于4∶1時，隨著加入膽固醇的增多，磷脂雙分子層不穩(wěn)定，導(dǎo)致膜的通透性增加，甚至成膜困難，從而導(dǎo)致GSH滲出，使得GLip的包埋率降低[16]。

圖3 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對GLip包埋率的影響

2.3.3 吐溫-80添加量對包埋率的影響

固定卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為4∶1,卵磷脂的添加量為200 mg，GSH的添加量為70 mg,研究吐溫-80添加量(40、60、80、100、120、140 mg)對GLip包埋率的影響。如圖4所示，隨著吐溫-80添加量的增加，GLip的包埋率整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當吐溫-80的添加量為100 mg時，GLip的包埋率達到最大，約為60%。吐溫-80是一種非離子表面活性劑，可以在脂質(zhì)體的水相和脂相均勻分配并包入脂質(zhì)雙層，形成較厚的膜，使得磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。因此，當吐溫-80的添加量小于100 mg時，隨著吐溫-80添加量增加，GLip的包埋率提高；但是當吐溫-80的添加量太高時，卵磷脂逐漸與吐溫-80的膠束增溶形成混和膠團，磷脂雙分子層遭到破壞，反而使得GSH包埋率下降[17]。

圖4 吐溫-80對GLip包埋率的影響

2.3.4 GSH的添加量對包埋率的影響

固定卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為4∶1,卵磷脂的添加量為200 mg，吐溫-80的添加量為100 mg，研究谷胱甘肽添加量(30、40、50、60、70、80 mg)對GLip包埋率的影響。如圖5所示，隨著GSH添加量的增加，GLip的包埋率先升高后降低，當GSH的添加量為70 mg時，GLip的包埋率達到最大，約為60%。這主要是因為谷胱甘肽是一種水溶性藥物，能夠進入磷脂雙分子層內(nèi)部水相中，提高GSH脂質(zhì)體的包埋率。但脂質(zhì)體囊泡的體積是有限的，包埋的谷胱甘肽的量是一定的[18]。當谷胱甘肽的添加量大于70 mg時，脂質(zhì)體水相的體積趨于飽和，很難再溶解更多的谷胱甘肽，從而使得GLip包埋率降低。

圖5 GSH添加量對GLip包埋率的影響

2.3.5 超聲時間對包埋率的影響

固定卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為4∶1,卵磷脂的添加量為200 mg，吐溫-80的添加量為100 mg，GSH添加量為70 mg，研究超聲時間對GLip包埋率的影響。由圖6可知，隨著超聲時間的增加，GLip的包埋率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當超聲時間為10 min時，GLip的包埋率達到最大，約為56%。在制備脂質(zhì)體的過程中，通常需要利用超聲波使體系中的粒子再分散，從而獲得粒徑小且分布均勻的脂質(zhì)體，以增加體系的穩(wěn)定性[19]。但是，當超聲時間太長時，超聲波的作用增強，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)被破壞，GSH泄漏，反而使GLip的包埋率降低。

圖6 超聲時間對GLip包埋率的影響

2.4 GLip制備參數(shù)的優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken 設(shè)計

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果可知，改變卵磷脂添加量、GSH添加量和吐溫-80添加量的GLip最大包埋率大于改變卵磷脂與膽固醇比例和超聲時間的GLip包埋率，所以選取卵磷脂的添加量、GSH的添加量和吐溫-80的添加量為自變量，以GLip的包埋率為因變量，根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計的因素和水平

2.4.2 模型方程的建立及顯著性檢驗

以GLip的包埋率為響應(yīng)值，對表2中數(shù)據(jù)進行分析，擬合得到二次多項式回歸方程模型為：Y=63.92+3.20A+3.11B-0.52C+2.40AB-0.75AC+1.54BC-3.74A2-2.28B2-1.64C2。通過回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗得到的結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

表3 GLip包埋率回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗及方差分析

由回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗及方差分析可知，P<0.000 1，所以響應(yīng)面回歸方程模型達到極顯著水平；又因為R2=0.983 5，表明98% 的數(shù)據(jù)可以

用此模型方程解釋，失擬項的P值為0.160 9，不顯著，說明該實驗所選模型適用于GLip的制備，二次回歸方程模型是有意義的，因此可以求得脂質(zhì)體的包埋率，優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝。各項方差分析表明A、B、AB、BC、A2、B2、C2對GLip的包埋率均有極顯著的影響,各影響因素標準回歸系數(shù)的大小為A>B>C。模型的變異系數(shù)CV=1.40%，表明該預(yù)測值與實驗值差異較小。

2.4.3 制備工藝優(yōu)化結(jié)果分析

響應(yīng)面法(RSM)的圖形是特定的響應(yīng)面 (Y) 與對應(yīng)的因素A、B、C構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖, 每個響應(yīng)面對其中兩個因素進行分析, 另外一個因素固定在零水平。由于該圖形可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響,因此從試驗所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們在制備GLip過程中的相互作用[20]。GLip制備工藝中卵磷脂的添加量、GSH的添加量和吐溫-80的添加量三個因素之間的相互作用對GLip包埋率的影響如圖7—圖9所示。

圖7 卵磷脂添加量和GSH添加量交互作用對GLip包埋率的影響

圖8 卵磷脂添加量和吐溫-80添加量交互作用對GLip包埋率的影響

圖9 GSH添加量和吐溫-80添加量交互作用對GLip包埋率的影響

如圖7所示，從響應(yīng)面圖中可以看出坡度比較陡，這說明卵磷脂添加量和GSH添加量的交互作用對GLip的包埋率影響比較明顯。由圖7中的等高線可知，橢圓在卵磷脂添加量區(qū)域排列更密集，說明卵磷脂添加量對包埋率的影響大于GSH添加量對包埋率的影響。當GSH的添加量不變時，隨著卵磷脂添加量的不斷增加，其包埋率先升高后降低；當卵磷脂的添加量在225～250 mg時，包埋率達到最大。當卵磷脂的添加量不變時，隨著GSH添加量的增加其包埋率先增大后減?。划擥SH的添加量在75 ～80 mg時，包埋率達到最大。脂質(zhì)體的外殼是卵磷脂，卵磷脂量一定，其形成脂質(zhì)體的體積一定，隨著GSH的添加，脂質(zhì)體的容積會超負荷。

如圖8所示，從響應(yīng)面圖中可以看出坡度比較陡峭，說明卵磷脂添加量與吐溫-80添加量的交互作用對包埋率的影響較為明顯。由圖8中的等高線可知，橢圓在卵磷脂添加量區(qū)域排列更密集，說明卵磷脂的添加量對包埋率的影響大于吐溫-80添加量對包埋率的影響。當卵磷脂的添加量不變時，包埋率隨著吐溫-80添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，吐溫-80的添加量在96 ～104 mg時，包埋率取得最大值；過量的吐溫-80改變了納米粒子表面的潤濕性，使水分易于滲入，加快崩解速度；另外其增溶性強，反絮凝作用提高了藥物溶出，從而降低了包埋率。吐溫-80的添加量不變時，隨著卵磷脂添加量的不斷增加，其包埋率先增大后減小，當卵磷脂的添加量在225～250 mg時，包埋率最高。

如圖9所示，從響應(yīng)面圖中可以看出坡度比較陡，這說明GSH添加量和吐溫-80添加量的交互作用對包埋率的影響比較明顯。由圖9中的等高線可知，橢圓在GSH添加量區(qū)域排列更密集,說明GSH添加量對包埋率的影響大于吐溫-80添加量對包埋率的影響。當固定GSH的添加量不變時，包埋率隨著吐溫-80添加量的增加先增大后減小；當吐溫-80的添加量在96 ～104 mg時，其包埋率達到最大。當吐溫-80的添加量不變時，隨著GSH添加量的不斷增大，其包埋率先增大后減小；當GSH的添加量在75～80 mg時，包埋率最高。

2.4.4 GLip最優(yōu)制備條件的驗證

采用Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計軟件對GLip的制備工藝進行分析得到的最優(yōu)參數(shù)為：卵磷脂的添加量為232.84 mg，GSH的添加量為75.91 mg，吐溫-80的添加量為94.30 mg，此時預(yù)測的優(yōu)化包埋率為66.27%。為驗證模型的有效性，結(jié)合實際實驗情況，將最佳制備工藝優(yōu)化為：卵磷脂添加量為232 mg，GSH添加量為75 mg，吐溫-80的添加量為94 mg，進行3次重復(fù)試驗，得到GLip的包埋率為(65.85±0.54)%，與理論預(yù)測值的誤差絕對值低于5%。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確，最佳制備工藝條件可靠，具有使用價值。

3 結(jié)束語

本文以包埋率為指標，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法分析了薄膜-超聲法制備GLip時各影響因素之間的相互作用，得到了制備GLip的最優(yōu)參數(shù)，提高了GLip的包埋率。最佳制備條件如下：卵磷脂添加量為232 mg，GSH添加量為75 mg，吐溫-80的添加量為94 mg，得到的最大包埋率為(65.85±0.54)%。本文的研究結(jié)果為GSH納米傳遞體系的開發(fā)提供了參考依據(jù)，能進一步促進GSH在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。