張華峰

（1.廈門市綠化中心，福建 廈門 361004；2.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002）

桉樹枝癭姬小蜂Leptocybe invasa屬膜翅目Hymenoptera 姬小蜂科Eulophidea 昆蟲，是一種危害桉屬植物的外來入侵害蟲[1]。該蜂最早在中東和地中海地區(qū)發(fā)現(xiàn)并造成危害，隨后入侵到印度、中國和巴西等桉樹種植大國，目前該蜂已在大洋洲、亞洲和歐洲等5 大洲45 個(gè)國家和地區(qū)分布定殖。桉樹Eucalyptusspp.是世界三大速生樹種之一，具有適應(yīng)性強(qiáng)、輪伐期短、繁殖容易等特點(diǎn)，已在5 大洲120 個(gè)國家和地區(qū)種植，種植總面積超過2 500 萬hm2。我國自19 世紀(jì)末開始引種桉樹[2]，在華南及西南地區(qū)大面積推廣種植，面積達(dá)512 萬hm2，排名全球第三[3]。2007 年在我國廣西東興首次發(fā)現(xiàn)桉樹枝癭姬小蜂，由于其具有傳播途徑多，擴(kuò)散能力強(qiáng)，防治難度大等特點(diǎn)[4]，目前已傳播擴(kuò)散至廣西、海南和福建等8 省區(qū)[5-7]，對(duì)我國桉樹人工林造成嚴(yán)重危害，給桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成巨大損失[4-5]。張華峰等[7-8]、魏初獎(jiǎng)等人[9]采用篩選桉樹抗蟲品種（無性系），淘汰易感品種（無性系）等方法，有效控制了福建大部分桉樹栽種區(qū)桉樹枝癭姬小蜂的發(fā)生危害。但目前在園林綠化行道樹，或小部分桉樹種植的北緣地區(qū)仍種植抗寒性較強(qiáng)但易感蟲桉樹品種（無性系），仍需探索更高效的防控措施。研究植物自身的防御能力和機(jī)制，探索增強(qiáng)植物防御能力的技術(shù)手段，是當(dāng)今植物抗蟲性研究的前沿和熱點(diǎn)[10]。有研究表明，植物在植食性昆蟲取食后能夠在被害部位或植株系統(tǒng)內(nèi)，通過植物誘導(dǎo)防御途徑，降低營養(yǎng)物質(zhì)的分配，增加次生代謝產(chǎn)物的含量，迅速增強(qiáng)防御酶活性等一系列化學(xué)防御反應(yīng)，降低其對(duì)昆蟲的適應(yīng)性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，以抵御昆蟲進(jìn)一步取食[11-15]。植物誘導(dǎo)抗性一旦被激發(fā)，可在一定范圍和時(shí)間內(nèi)有效地抵御植食性昆蟲的侵害，并具有較為廣譜的抗蟲作用[16-17]。目前有關(guān)誘導(dǎo)桉樹產(chǎn)生抗蟲性的研究報(bào)道較少。本研究通過桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵危害、針刺損傷和外源茉莉酸甲酯（MeJA）噴施等不同的誘導(dǎo)處理后，測(cè)定桉葉中與化學(xué)防御相關(guān)生理生化物質(zhì)的變化，并用模糊相似優(yōu)先比法分析比較不同的誘導(dǎo)處理對(duì)桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育和種群動(dòng)態(tài)的影響，綜合評(píng)價(jià)桉樹誘導(dǎo)抗性的抗蟲效果，為防控桉樹枝癭姬小蜂提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試苗木為巨桉Europhylla grandis無性系組培苗，苗高50 cm。在福建省漳州市微綠園林綠化工程公司苗圃的巨桉林內(nèi)，于2021 年8 月中旬桉樹枝癭姬小蜂羽化期采集初羽化的雌成蜂供試。供試MeJA（純度≥95%）采購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，試驗(yàn)時(shí)將MeJA 溶于乙醇中，加蒸餾水分別配制成不同濃度的溶液備用。

1.2 誘導(dǎo)處理

1.2.1 產(chǎn)卵誘導(dǎo)（Y1） 選15 株供試苗木，在每株苗木的東、西、南、北4 個(gè)方向各選取3 條嫩枝，用自制尼龍網(wǎng)袋套上，每枝分別接入20 頭當(dāng)天羽化出癭的處女雌蜂，在雌蜂產(chǎn)卵危害1 d 后作為蟲害誘導(dǎo)處理組供試。

1.2.2 針刺損傷誘導(dǎo)（Y2） 選15 株供試苗木，按照1.2.1 方法選取枝條，用鋼針在枝的每片嫩葉葉柄、主脈基部及嫩枝上針刺20 個(gè)傷口，人工模擬昆蟲產(chǎn)卵損傷，處理1 d 后作為針刺損傷誘導(dǎo)處理組供試。

1.2.3 MeJA 誘導(dǎo) 選60 株供試苗木，在苗木上用小型噴霧器分別均勻地噴灑0.05 mmol·L-1（Y3）、0.1 mmol·L-1（Y4）、0.5 mmol·L-1（Y5）和1.0 mmol·L-1（Y6）4 種濃度的MeJA 溶液，每種濃度各15 株苗木，將處理過的苗木分別放置于養(yǎng)蟲籠（透明塑料薄膜密封）內(nèi)，處理1 d 后作為MeJA 誘導(dǎo)處理組供試。

1.3 接蟲方法

誘導(dǎo)處理后，在供試苗木的東、南、西、北4個(gè)方向各選取3 條健康枝條，套上網(wǎng)袋，每枝分別接入20 頭當(dāng)天羽化出癭的處女雌蜂。

1.4 樣品采集和測(cè)定

誘導(dǎo)處理1 d 后從試驗(yàn)處理苗木的東、南、西、北4 個(gè)方向各隨機(jī)剪取10 片未損傷的嫩葉，組成混合樣品裝入保鮮袋內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

測(cè)定葉片營養(yǎng)物質(zhì)和次生物質(zhì)含量試驗(yàn)時(shí)，先用蒸餾水沖洗葉片并晾干，再用牛皮紙包好放烘干箱，在60°C 恒溫條件下持續(xù)烘干48 h 后，用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩，裝入自封袋，放入干燥器中保存?zhèn)錅y(cè)。分別用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法、鎢酸鈉-磷鉬酸比色法、Folin-酚法、蒽酮比色法和凱氏定氮法，測(cè)定各處理樣品中黃酮、單寧、總酚、可溶性糖（多糖）和蛋白質(zhì)含量[9-10]，每份樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

測(cè)定葉片植物相關(guān)酶活性試驗(yàn)時(shí)，按上述的取樣方式剪取桉樹嫩葉，測(cè)定桉葉中保護(hù)性酶苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO 等4 種保護(hù)酶活性[11-12]，以及胰蛋白酶抑制劑TI 和胰凝乳蛋白酶抑制劑CI 等2 種植物蛋白酶抑制劑活性[13-14]，每份樣品重復(fù)測(cè)定3 次。以上測(cè)定都以健康苗木作為對(duì)照組（CK）。誘導(dǎo)處理和對(duì)照各設(shè)3 次重復(fù)。

1.5 生物學(xué)觀察

1.5.1 產(chǎn)卵刻痕 接蟲處理后10 d，打開網(wǎng)袋，對(duì)每樣枝各選擇5 片葉進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)葉柄上產(chǎn)卵刻痕數(shù)。

1.5.2 生物測(cè)定 在桉樹枝癭姬小蜂羽化高峰期，從不同處理的植株上，隨機(jī)剪取帶有蟲癭的樣枝，分別置于不同的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，放入人工氣候箱（設(shè)定溫度30℃，濕度80% RH，光暗條件L ∶D=18 h ∶6 h）內(nèi)收蜂，每天定時(shí)收集統(tǒng)計(jì)由蟲癭中羽化出孔的桉樹枝癭姬小蜂成蟲。采集100 只雌成蟲，迅速放入三星（RSG5SFPN）冰箱，在-20 ℃條件下速凍10 min。隨后隨機(jī)取30 只雌成蟲，放入生理鹽水（0.9%NaCl 無菌水溶液）內(nèi)，在體視鏡下解剖觀察，并記錄每只小蜂的懷卵量。用昆蟲采集管收集當(dāng)天羽化出蜂的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲，每管30 只，放在室溫下（24～28℃），每天觀察2 次，記錄桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲的存活數(shù)，直至全部死亡，統(tǒng)計(jì)雌成蟲壽命。

1.5.3 出蜂數(shù)量 桉樹枝癭姬小蜂羽化出孔后，選取30 個(gè)蟲癭，統(tǒng)計(jì)每個(gè)蟲癭上圓形的羽化孔做為出蜂數(shù)量。

1.6 種群趨勢(shì)指數(shù)計(jì)算及數(shù)據(jù)分析

為了更好地比較評(píng)價(jià)不同誘導(dǎo)處理對(duì)桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育及種群增長效應(yīng)，分別統(tǒng)計(jì)桉樹枝癭姬小蜂存活率、雌性比和懷卵數(shù)，并用種群趨勢(shì)指數(shù)（index of population trend，I）[18]計(jì)算，I=SE s PfP♀。式中，S為存活率,每個(gè)蟲癭出蜂數(shù)/蟲癭上的產(chǎn)卵刻痕數(shù)；ES為指定標(biāo)準(zhǔn)卵量，以從對(duì)照植株羽化出的雌成蟲所懷卵數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)；Pf為達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)卵量的比例；P♀為桉樹枝癭姬小蜂雌蟲比例。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在SPSS17.0 和DPS v7.05 版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行模糊相似優(yōu)先比分析[19]。本實(shí)驗(yàn)用經(jīng)不同誘導(dǎo)處理后的桉葉中營養(yǎng)和次生代謝物質(zhì)含量、保護(hù)酶活性和蛋白酶抑制劑活性等，與桉樹化學(xué)防御相關(guān)生理生化物質(zhì)和桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育指標(biāo)等指標(biāo)做為待測(cè)數(shù)據(jù)。對(duì)待測(cè)數(shù)據(jù)ix通過標(biāo)準(zhǔn)化yi= ()/s,其中，x為平均值，進(jìn)行無量綱處理后，進(jìn)行模糊相似優(yōu)先比分析，綜合評(píng)價(jià)桉樹誘導(dǎo)抗性的抗蟲效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉營養(yǎng)物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)不同誘導(dǎo)處理后桉樹葉主要營養(yǎng)物質(zhì)和次生物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果表明：經(jīng)誘導(dǎo)處理1 d 后，不同處理間的桉葉中可溶性糖含量、多糖含量差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比含量均有顯著下降；不同處理間的桉葉中蛋白質(zhì)含量差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y1處理含量變化不大外，其余處理均有顯著下降；不同處理間的桉葉中黃酮含量差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y2處理含量略有下降外，其余處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中單寧含量差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y6處理含量略有上升外，其余處理變化不大；不同處理間的桉葉中總酚含量差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，Y1、Y3和Y6處理含量有顯著上升，其余處理變化不大?？傮w而言，誘導(dǎo)處理后桉葉相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)含量處理組與對(duì)照相比含量有顯著的下降，而次生物質(zhì)中黃酮類等物質(zhì)較對(duì)照相比含量有一定的上升。

表1 桉葉營養(yǎng)物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)含量測(cè)定及方差分析結(jié)果 mg·g-1 Table 1 Results of variance analysis and contents of nutrients and secondary metabolites in Eucalyptus leaves

2.2 桉葉保護(hù)酶活性和蛋白酶抑制劑測(cè)定結(jié)果

經(jīng)不同誘導(dǎo)處理后桉樹葉保護(hù)酶活性和蛋白酶抑制劑活性測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明：經(jīng)誘導(dǎo)處理1 d 后，不同處理間的桉葉中PAL 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y2處理活性值略有下降外，其余處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中SOD 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，各處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中POD 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y2處理略有下降外，其余各處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中PPO 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，各處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中TI 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，各處理均有顯著上升；不同處理間的桉葉中CI 活性值差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，各處理均有顯著下降?？傮w而言，桉葉中PAL、SOD、POD 和PPO4 種保護(hù)酶活性較對(duì)照相比活性有顯著的上升，而蛋白酶抑制劑中處理組TI 活性較對(duì)照比有顯著的上升，CI 活性與對(duì)照比有顯著的下降。

表2 桉葉保護(hù)酶活性和蛋白酶抑制劑活性測(cè)定及方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis and protective enzyme activity and protease inhibitor activity of Eucalyptus leaves

2.3 桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育和種群指標(biāo)

經(jīng)不同誘導(dǎo)處理后，接入桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲，經(jīng)一個(gè)世代（2～3 個(gè)月），觀察桉樹枝癭姬小蜂子代生長發(fā)育指標(biāo)，并計(jì)算種群趨勢(shì)指數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：以不同誘導(dǎo)處理后桉樹為寄主，不同處理間的蟲癭中桉樹枝癭姬小蜂子代出蜂數(shù)差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y1處理出蜂數(shù)有上升外，其余處理均有顯著下降；不同處理間的蟲癭上桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵刻痕數(shù)差異極顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y1和Y2處理產(chǎn)卵刻痕數(shù)有上升外，其余處理均有顯著下降；不同處理間桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲懷卵量差異顯著（P＜0.01)，較對(duì)照組相比，除Y2處理懷卵量變化不大外，其余處理均有顯著下降。根據(jù)出蜂數(shù)、產(chǎn)卵刻痕數(shù)、懷卵量、雌性比等數(shù)據(jù)，計(jì)算桉樹枝癭姬小蜂存活率、達(dá)標(biāo)卵量比率，并代入公式（1）中計(jì)算種群趨勢(shì)指數(shù)（X13）。結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)處理后，桉樹枝癭姬小蜂種群趨勢(shì)指數(shù)（X13）與對(duì)照組相比較有下降。

表3 桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育和種群指標(biāo)Table 3 Indexes of growth, development and population trend of L. invasa

2.4 不同誘導(dǎo)處理模糊相似優(yōu)先比分析

本實(shí)驗(yàn)將樣品測(cè)試的桉葉中營養(yǎng)和次生代謝物質(zhì)含量，和保護(hù)酶、蛋白酶抑制劑活性值等，以及桉樹枝癭姬小蜂種群趨勢(shì)指數(shù)指標(biāo)做為待測(cè)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行無量綱處理。以桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵損傷處理（Y1）做為固定樣本，其它處理做為假定樣本，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模糊相似優(yōu)先比分析，結(jié)果見表4 和表5。結(jié)果表明，桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵損傷處理（Y1）與噴施1.0 mmol·L-1Me-JA（Y6=45）誘導(dǎo)后，桉樹葉相關(guān)化學(xué)防御物質(zhì)和桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育和種群動(dòng)態(tài)變化較為相似，其次是噴施0.5 mmol·L-1MeJA 誘導(dǎo)處理（Y5=47），再次是噴施0.1 mmol·L-1誘導(dǎo)處理（Y4=53）。

表4 桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵損傷處理(Y1)與其他誘導(dǎo)處理樣本間絕對(duì)值Table 4 Absolute values between oviposition induction treatment (Y1) and other induction treatments

表5 桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵損傷處理(Y1)對(duì)各誘導(dǎo)處理相似度Table5 Similarity between oviposition induction treatment (Y1) and induction treatment

3 討論與結(jié)論

植物在生境中長期受到各種生物和非生物脅迫，從而逐漸形成了多種的防御反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境[19]。植食性昆蟲或環(huán)境脅迫下的植物應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制是研究植物與植食性昆蟲互作關(guān)系的重要課題，也是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[10]。誘導(dǎo)抗性是植物對(duì)昆蟲或環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，植物通過茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）和乙烯（ethylene，ET）等信號(hào)途徑間交叉作用，啟動(dòng)了植物防御反應(yīng)系統(tǒng)，激活了相關(guān)防御基因的表達(dá)等途徑來改變植物自身的化學(xué)成分，以提供植物的最佳防御體系，降低病蟲危害[20-21]。研究表明桉樹受桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵危害、機(jī)械損傷和噴施外源MeJA 等不同誘導(dǎo)處理后，其葉片生理生化指標(biāo)產(chǎn)生的顯著變化，結(jié)果表明，誘導(dǎo)處理后桉葉相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)含量處理組與對(duì)照相比含量有顯著下降，而次生物質(zhì)中黃酮類等物質(zhì)較對(duì)照相比含量有一定的上升；桉葉中PAL、SOD、POD 和PPO4 種保護(hù)酶活性較對(duì)照相比活性有顯著上升，而蛋白酶抑制劑中處理組TI 活性較對(duì)照比有顯著上升，CI 活性與對(duì)照比有顯著下降。同時(shí)誘導(dǎo)處理對(duì)桉樹枝癭姬小蜂的生長發(fā)育、繁殖和種群趨勢(shì)等生物學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響，研究結(jié)果表明經(jīng)誘導(dǎo)處理后，桉樹枝癭姬小蜂種群趨勢(shì)指數(shù)（I）與對(duì)照組相比較有下 降。

用模糊相似優(yōu)先比法分析比較了桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵損傷誘導(dǎo)與其它誘導(dǎo)處理，對(duì)桉樹葉生理生化變化和寄生的桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育、種群動(dòng)態(tài)影響的相似程度，結(jié)果表明，噴施1.0 mmol·L-1MeJA 誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生與桉樹枝癭姬小蜂產(chǎn)卵危害較為相似的結(jié)果，證明了噴施外源MeJA在誘導(dǎo)抗性中有積極的作用，可作為害蟲綜合治理的一種手段。本研究表明，桉樹植株的局部損傷誘導(dǎo)可造成全株性的系統(tǒng)防御反應(yīng)。植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜、有機(jī)的整體，包括諸多方面與環(huán)節(jié)，影響桉樹枝癭姬小蜂生長發(fā)育和種群動(dòng)態(tài)改變的途徑及機(jī)理的研究，尚待進(jìn)一步研究探討。