賴 略 徐金柱 秦長(zhǎng)生 凌斯全田龍艷 楊 華 張春花 邱華龍

(1.河源市森林病蟲害防治服務(wù)中心，廣東 河源 517000; 2.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

杉木Cunninghamia lanceolata主要分布在中國(guó)和越南，因其生長(zhǎng)快、易成活、材性好，是我國(guó)南方諸省主要的速生用材樹種[1]。杉木病蟲害的爆發(fā)是影響杉木生長(zhǎng)和品質(zhì)的重要因素之一[2]，因此，病蟲害防治是杉木林經(jīng)營(yíng)管理的重要內(nèi)容之一。雀麗毒蛾Calliteara melliCollenette 隸屬于鱗翅目，毒蛾科，在中國(guó)分布于廣東、廣西、福建、江西、浙江、貴州、四川等主要杉木產(chǎn)區(qū)，主要以幼蟲取食杉樹針葉，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可將針葉全部食光，被害處僅留葉基部分，地面一片蟲糞，嚴(yán)重影響杉木生長(zhǎng)，是我國(guó)南方杉木林內(nèi)重要的食葉害蟲之一（圖1）。近年來(lái)南方杉木林種植面積較大，該害蟲在杉木主產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi)[3]。目前主要是利用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)該害蟲進(jìn)行防治[4]，雖然保障了林產(chǎn)品安全，但是大量使用高毒化學(xué)農(nóng)藥不僅污染和破壞生態(tài)環(huán)境大量及大面積用藥而且殺傷天敵、使害蟲容易產(chǎn)生抗藥性。因此，研究更為安全、高效、無(wú)殘留的雀麗毒蛾防治技術(shù)勢(shì)在必行。

圖1 雀麗毒蛾蟲態(tài)及對(duì)杉木的危害狀Fig.1 Images of developmental states of C. melli Collenette and its damage symptoms to C. lanceolata

在昆蟲與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化過程中，植食性昆蟲主要利用密布在其觸角上的氣味感受器接收和識(shí)別寄主植物氣味進(jìn)行寄主定位、取食或產(chǎn)卵[5-6]。利用植食性昆蟲與寄主植物的化學(xué)通訊進(jìn)行害蟲發(fā)生測(cè)報(bào)及防治已在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，并依據(jù)這種化學(xué)通訊成功開發(fā)了針對(duì)不同昆蟲的高效植物源引誘劑[7]。然而，目前尚未見與雀麗毒蛾通過寄主植物的揮發(fā)性氣味進(jìn)行識(shí)別和定位有關(guān)的報(bào)道。本研究分析鑒定了杉木葉片的揮發(fā)性氣味組成，并測(cè)試了這些揮發(fā)物對(duì)雀麗毒蛾雌雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)，以期為雀麗毒蛾的有效監(jiān)測(cè)及防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雀麗毒蛾采集與飼養(yǎng)

2020 年4—9 月在廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)小坑林場(chǎng)和樂昌市龍山林場(chǎng)采集雀麗毒蛾幼蟲，將其放入養(yǎng)蟲籠中帶回實(shí)驗(yàn)室。再將樣本置于環(huán)境條件為溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度80%左右和光周期L : D=12 h : 12 h 養(yǎng)蟲室內(nèi)，用新鮮的杉木葉片飼喂幼蟲，直至其羽化出成蟲。

1.2 杉木葉片揮發(fā)物的提取與鑒定

將表面洗凈晾干的杉木葉片20 g 放在色譜純的正己烷中浸泡15 min 以收集杉木葉片的揮發(fā)性物質(zhì)，用無(wú)水硫酸鈉去除多余水分后，用帶過濾膜的移液器將樣品轉(zhuǎn)移到2 mL 樣品瓶?jī)?nèi)，并用氮吹儀濃縮到適合的濃度，保存在-20 ℃冰箱內(nèi)待用。用安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS：7890B-5977B）對(duì)杉木葉片揮發(fā)物進(jìn)行分析鑒定。氣相色譜GC 的型號(hào)為安捷倫7890B，色譜柱為HP-5ms 毛細(xì)管色譜柱 (長(zhǎng)度為30 m,內(nèi)徑為0.25 mm，內(nèi)壁的膜厚度為0.25 μm)，柱流量為1 mL/min，以99.999%高純氮?dú)庾鳛檩d氣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，柱箱程序升溫程序?yàn)椋?0 ℃保留 1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃并保留1 min。進(jìn)樣分流比為15 : 1。MS 條件為：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，離子掃描范圍50-350 m/z。C7-C40 正構(gòu)烷烴混合物的樣品用來(lái)計(jì)算目標(biāo)化合物的保留指數(shù)，保留指數(shù)計(jì)算公式參照文獻(xiàn)中的計(jì)算公式計(jì)算[8]。根據(jù)NIST17 譜庫(kù)中的特征離子片段及化合物的保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。選取NIST 普庫(kù)比對(duì)給出的化合物中匹配值最大的化合物（匹配值需大于90%）作為鑒定得到的化合物，當(dāng)給出的最大匹配度仍小于90%時(shí)，將該化合物定性為未知化合物。保留峰面積大于最大峰面積的1%的峰進(jìn)行化合物相對(duì)百分含量計(jì)算，同時(shí)購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)已初步鑒定的部分化合物進(jìn)行確認(rèn)。

1.3 杉木葉片揮發(fā)物對(duì)雀麗毒蛾的觸角電位測(cè)試

用氣象色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)測(cè)試雀麗毒蛾觸角對(duì)杉木葉片揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)。GC 的進(jìn)樣口溫度、升溫條件、色譜柱規(guī)格和柱流量等氣象色譜條件與GC-MS 分析的相同。利用荷蘭Syntech 公司的EAG 昆蟲觸角電位記錄儀測(cè)定揮發(fā)物引起昆蟲的觸角電生理反應(yīng)大小。首先沿蛾子觸角基部將觸角剪下，并在觸角尖部用小刀將表皮切開一個(gè)細(xì)口，然后將觸角連接到觸角電位儀的兩個(gè)玻璃電極上。GC 和EAD 的樣品分流比為1 : 1。采用手動(dòng)進(jìn)樣2 μL，并為不分流模式，測(cè)試蛾子的觸角電生理反應(yīng)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 根觸角以上，至少重復(fù)3 次以上都有反應(yīng)的化合物質(zhì)則被判定為有活性的化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木葉片揮發(fā)物鑒定

GC-MS 分析和NIST 譜庫(kù)比對(duì)表明，從杉木葉片中共分離出13 種化合物（圖2），通過標(biāo)準(zhǔn)品、離子碎片信息及保留指數(shù)等信息，鑒定了其中10 個(gè)化合物，其中8 個(gè)為萜類化合物，包括2個(gè)半萜化合物，5 個(gè)倍半萜化合物，一個(gè)二萜類化合物，另外一個(gè)烷烴和一個(gè)烯烴化合物；在出峰時(shí)間為17.281、17.489 和18.171 min 的3 個(gè)峰由于和NIST 普庫(kù)比對(duì)得到的相似性較低，暫時(shí)無(wú)法鑒定（表1）。所有揮發(fā)物當(dāng)中，二萜化合物松柏烯的相對(duì)含量最高，為48.68%，其次依次為為α-蒎烯8.51%、β-瑟林烯7.17%、α-瑟林烯6.09%、β-欖香烯4.28%。

圖2 杉木葉片揮發(fā)物的GC-MS 總離子流圖Fig.2 Total Ion chromatogram of hexane extracts from C. lanceolata leaves

表1 杉木葉片揮發(fā)物組分及相對(duì)含量Table1 Compounds and relative contents of volatiles from C. lanceolata leaves

2.2 杉木葉片對(duì)雀麗毒蛾有觸角電生理反應(yīng)的活性物質(zhì)

GC-EAD 檢測(cè)結(jié)果表明，杉木葉片揮發(fā)物中有6 種化合物（P1-P3、P6、P7、P12）能引起雌雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)（圖3）。通過保留指數(shù)和GC-MS NIST 譜庫(kù)鑒定的物質(zhì)進(jìn)行比較，確定這6 種物質(zhì)均為萜類化合物，分別為：α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯。其中α-蒎烯、β-欖香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯均能引起雌蟲和雄蟲的觸角反應(yīng)，但是β-蒎烯只能引起雌蟲的觸角反應(yīng)。這6 種活性物質(zhì)和譜庫(kù)鑒定的化合物離子碎片對(duì)比信息如圖4 所示。

圖3 杉木葉片揮發(fā)物對(duì)雀麗毒蛾雌蟲、雄成蟲的觸角電位反應(yīng)圖Fig. 3 Electroantennogram of antennae of C. melli Collenette to volatiles of C. lanceolata leaves

圖4 對(duì)雀麗毒蛾具有電生理活性的6 種揮發(fā)物成分的離子碎片圖Fig. 4 Mass spectrograms of six volatiles that induce antennal electrophysiological effect of C. melli Collenette

3 結(jié)論

目前對(duì)于雀麗毒蛾的防治措施主要包括人工防治、燈光誘殺和化學(xué)藥劑防治。人工防治是根據(jù)雀麗毒蛾11 月上中旬老熟幼蟲爬到樹下的隱蔽場(chǎng)所越冬的習(xí)性進(jìn)行人工摘繭。物理防治是利用該成蟲有趨光性特點(diǎn)在成蟲羽化盛期進(jìn)行燈光誘殺?；瘜W(xué)防治是在幼蟲低齡期利用苦參堿或溴氰菊酯等化學(xué)藥劑進(jìn)行噴霧防治[4,9]。由于越冬幼蟲比較隱蔽，不易發(fā)現(xiàn)，人工防治比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。在杉木林區(qū)燈誘時(shí)發(fā)現(xiàn)，杉梢小卷蛾的趨光性較強(qiáng)，而雀麗毒蛾趨光性較弱，每次能誘集到很多杉梢小卷蛾，而只能誘集到零星幾頭雀麗毒蛾，因此推測(cè)利用誘殺燈光對(duì)雀麗毒蛾引誘效果不理想。利用化學(xué)防治雖然短期內(nèi)會(huì)有一定效果，但是杉木林面積較大，且地形較復(fù)雜，大面積噴灑化學(xué)藥劑成本較高，而且會(huì)對(duì)生態(tài)污染造成破壞。綜上所述，有必要開發(fā)針對(duì)性較強(qiáng)的、可用于雀麗毒蛾監(jiān)測(cè)和防治的引誘劑研發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)杉木葉片揮發(fā)性化合物主要為萜類化合物，而且以倍半萜化合物的數(shù)量最多，其中，二萜化合物松柏烯的相對(duì)含量高達(dá)48.68%，其次為α-蒎烯和β-瑟林烯等其它萜烯類化合物。本研究首次報(bào)道松柏烯在杉木葉片中存在，而且相對(duì)含量最高，但是未明確其對(duì)雀麗毒蛾有活性。松柏烯是松節(jié)油、五針?biāo)伤芍?、云南紅豆杉內(nèi)生真菌的主要次生代謝產(chǎn)物[10-12]。松柏烯不僅是香料的提取原料，而且對(duì)白色念珠菌、金黃色葡球菌、枯草桿菌等致病真菌及癌癥具有一定的抑制作用[12-13]。

在所有揮發(fā)物中，有6 種萜烯類揮發(fā)物能夠引起雀麗毒蛾成蟲的觸角電生理反應(yīng)，其中β-蒎烯只引起雌蟲的觸角電生理反應(yīng)，而對(duì)雄蟲沒有觸角反應(yīng)。萜烯類化合物是植物芳香性氣味的主要成分，對(duì)植食性害蟲及害蟲天敵的行為具有重要的調(diào)控作用[14-15]。本研究篩選的對(duì)雀麗毒蛾成蟲具有觸角電生理活性的化合物，可以作為雀麗毒蛾引誘劑的重要候選物質(zhì)。其中β-蒎烯只引起雌蟲的觸角反應(yīng)，可以作為對(duì)雀麗毒蛾雌雄成蟲具有特異性的引誘劑開發(fā)候選物質(zhì)，以用于不同性別蟲態(tài)的精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)。