馮志濤，邱占爽，王之虹

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

失眠是指患者入睡困難或多夢易醒導(dǎo)致睡眠質(zhì)量差、睡眠時(shí)間少進(jìn)而表現(xiàn)出日間疲勞、思睡、厭食的一種主觀癥狀[1]。針刺治療失眠具有起效快、無不良反應(yīng)等特點(diǎn)，然而臨床中不同的醫(yī)家治療原發(fā)性失眠（胃氣失和型）的腧穴配伍差異性很大，胡幼平教授重視辨證選穴，以中脘、足三里配伍為主；王富春教授重視辨病選穴，以百會(huì)、三陰交、神門配伍為主；導(dǎo)師王之虹教授重視辨證結(jié)合辨病選穴，以百會(huì)、三陰交、神門、足三里、中脘配伍為主；臨床中3種腧穴配伍治療失眠均可起到良好的療效。為明確3種腧穴配伍之間效應(yīng)機(jī)制的差異及針刺治療失眠的最佳選穴方法，本實(shí)驗(yàn)以PCPA致大鼠失眠模型為研究對象，選取大鼠血清中胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（GAS）、5-羥色胺（5-HT）、褪黑素（MT）為客觀研究指標(biāo)，以期提供客觀的證據(jù)支持臨床中針刺治療失眠的選穴依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 50只Wister大鼠，健康，雄性，SPF級，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g，長春中醫(yī)藥大學(xué)提供[動(dòng)物許可證：SCXK（吉）-2020-002]。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度調(diào)控在20～26 ℃、濕度60%～80%、室內(nèi)光照按照白晝交替、按時(shí)攝食、自由攝水，適應(yīng)7 d后分為空白組（n=10），造模組（n=40），造模結(jié)束后將造模組隨機(jī)分模型組（n=10）、辨證選穴組（n=10）、辨病選穴組（n=10）、辨證結(jié)合辨病選穴組（n=10）。

1.2 主要試劑與儀器 試劑：PCPA（美國 Sigma，CAS號：103616-89-3），戊巴比妥鈉 上?；瘜W(xué)試劑公司提供（F20180816），大鼠MTL 試劑盒（長春市弘揚(yáng)科技有限公司提供，批號：20201356），大鼠GAS試劑盒（長春市弘揚(yáng)科技有限公司提供，批號：20201378），大鼠5-HT試劑盒（吉林省博創(chuàng)科技有限公司，批號：20205623），大鼠MT試劑盒（吉林省博創(chuàng)科技有限公司，批號：20203412）。

儀器：一次性無菌針灸針（0.25 mm×25 mm，長春愛康醫(yī)療器械有限公司），自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（賽默飛世爾儀器有限公司），低溫高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 失眠模型 采用國內(nèi)外公認(rèn)的腹腔注射PCPA造模法建立失眠大鼠模型[2]，具體操作如下：將0.9%生理鹽水中加入碳酸氫鈉片調(diào)成弱堿性（pH值7.0～8.0）水溶液，將PCPA研磨成細(xì)粉按照1 mL/100 mg配制成混懸液備用，臨用前用自動(dòng)平衡離心機(jī)震蕩搖勻；每日上午8:00－8:30根據(jù)大鼠體質(zhì)量（400 mg/kg）對造模組大鼠進(jìn)行腹腔注射，空白組給予腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續(xù)注射2 d。

1.4 治療方法 治療組包括辨證選穴組：中脘、足三里；辨病選穴組：神門、三陰交、百會(huì)；辨病結(jié)合辨證選穴組：足三里、中脘、神門、百會(huì)、三陰交，取穴具體位置及針刺操作規(guī)范參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]。造模完成后第2天早上8:00－9:00對治療組失眠大鼠抓摸后針刺，留針1 min，只捻轉(zhuǎn)不提插，平補(bǔ)平瀉手法，連續(xù)治療7 d；模型組和空白組不做任何治療，給予相同的抓摸時(shí)間，共7 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法 翻正實(shí)驗(yàn)：造模完成后12 h及末次治療后根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔注射戊巴比妥鈉（按照50 μg/mL配比，溶于0.9%生理鹽水中，給藥劑量35 mg/kg），檢測睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間，將大鼠仰臥位放置于平板上，若大鼠在60 s內(nèi)不翻動(dòng)，可視為翻正反射消失，給藥到翻正反射消失的時(shí)間為睡眠潛伏期；繼續(xù)記錄時(shí)間直至大鼠自動(dòng)翻動(dòng)身體且在60 s內(nèi)不再將身體翻轉(zhuǎn)過去的時(shí)間為睡眠時(shí)間。

ELISA法檢測大鼠血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量，末次治療結(jié)束后，腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg），大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血4 mL，分別置于EP管中，做好組別標(biāo)記后，放入冰塊中冷藏，隨即將EP管放入離心機(jī)中，3 000 r/min，離心10 min，取出EP管，用移液槍吸出離心后的上層血清100 μL，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別按試劑盒說明書檢測血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量。向預(yù)先包被了MTL、GAS、5-HT和MT單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入MTL、GAS、5-HT和MT溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗MTL、GAS、5-HT和MT抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和反復(fù)洗滌，去除未結(jié)合的酶，加入顯色液，避光溫育，最后加入終止液，用多功能微孔板測讀儀測定MTL、GAS、5-HT和MT的吸光度（A）值。將A值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)方程，利用樣本A值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)方程求得MTL、GAS、5-HT和MT的濃度[4]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同腧穴配伍組對失眠模型大鼠睡眠時(shí)間、睡眠潛伏期結(jié)果的影響 第1次腹腔注射PCPA造模36 h后，對大鼠進(jìn)行翻正實(shí)驗(yàn)，與空白組相比，造模組睡眠潛伏期明顯延長（P＜0.01），睡眠時(shí)間顯著縮短（P＜0.01），見圖1。造模組大鼠煩躁、多動(dòng)、晝夜節(jié)律紊亂，說明造模成功，將造模組（n=40）大鼠隨機(jī)分為模型組（n=10）、辨證選穴組（n=10）、辨病選穴組（n=10）、辨證結(jié)合辨病選穴組（n=10）。針刺治療7 d后，辨證、辨病、辨證結(jié)合辨病選穴組與模型組相比，睡眠潛伏期明顯縮短（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），睡眠時(shí)間明顯延長（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）；其中與辨證、辨病選穴組相比，辨證結(jié)合辨病選穴組的睡眠潛伏期縮短（P＜0.05），睡眠時(shí)間延長（P＜0.05），見圖2。

圖1 空白組與造模組大鼠睡眠潛伏期(SL)和睡眠時(shí)間（ST）比較

圖2 各組大鼠睡眠潛伏期（SL）和睡眠時(shí)間（ST）比較

2.2 不同腧穴配伍組對失眠模型大鼠血清GAS、MTL、5-HT和MT含量的影響 與空白組相比，模型組血清中GAS、MTL、5-HT和MT的含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，辨證、辨病、辨證結(jié)合辨病選穴組血清中GAS、MTL含量明顯增加（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05），其中與辨病、辨證結(jié)合辨病選穴組相比，辨證選穴組血清中MTL、GAS含量增加明顯（P＜0.05），見圖3；與模型組相比，辨證、辨病、辨證結(jié)合辨病選穴組血清中5-HT、MT明顯增加（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），與辨證、辨病選穴組相比，辨病結(jié)合辨證選穴組血清中5-HT、MT含量增加明顯（P＜0.05），見圖4。

圖3 各組大鼠胃泌素（GAS）和胃動(dòng)素（MTL）比較

圖4 各組大鼠5-羥色胺（5-HT）和褪黑素（MT）比較

3 討論

腧穴配伍是在選穴原則的基礎(chǔ)上根據(jù)病癥選取有效的穴位，是針灸處方中重要組成部分，為針灸治療疾病提供方案的選穴方法[5]。臨床中不同醫(yī)家治療失眠的腧穴配伍差異性很大，胡幼平教授治療失眠時(shí)重視調(diào)理脾胃，調(diào)暢氣機(jī)，以“胃不和則臥不安”為選穴依據(jù)，重視辨證選穴，臨床中治療原發(fā)性失眠（胃氣失和型）處方中多以中脘、足三里配伍為主，并提出“和胃安神”針法治療失眠[6]，中脘、足三里為合募配穴，中脘能使胃容性擴(kuò)張，足三里促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)[7]，二穴配伍和胃、降氣、安神，胃和則臥安；王富春治療失眠重視辨病選穴，臨床中治療原發(fā)性失眠（胃氣失和型）處方以百會(huì)、三陰交、神門配伍為主，并提出“鎮(zhèn)靜安神”針法治療失眠[8]，百會(huì)位于巔頂，深系腦髓、調(diào)節(jié)一身陰陽，神門、三陰交寧心和胃，三穴配伍可和胃降氣、寧心安神，使陽氣趨緩，入陰則寐[9]；王之虹重視辨證結(jié)合辨病選穴，臨床中治療原發(fā)性失眠（胃氣失和型）處方以百會(huì)、三陰交、神門、足三里、中脘配伍為主；王之虹提出主癥選主穴，辨證選配穴，增效協(xié)同，運(yùn)用同功穴的腧穴配伍理論，針對原發(fā)性失眠的主癥選用百會(huì)、神門、三陰交為主穴，具有鎮(zhèn)靜安神之功，針對胃氣失和證型，配伍中脘、足三里，具有和胃安神之效，以期協(xié)同增效，目前在臨床中，導(dǎo)師運(yùn)用辨病與辨證選穴治療原發(fā)性失眠（胃氣失和型）療效確切；3種腧穴配伍選穴理論依據(jù)充分，臨床中療效均得到認(rèn)可，但3種腧穴配伍效應(yīng)機(jī)制的差異還不清楚。

失眠與胃腸功能障礙關(guān)系密切，流行病學(xué)證實(shí)在失眠患者的伴隨癥狀中脾胃功能紊亂發(fā)生率高達(dá)69.19%[10]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為消化系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用是通過腦腸軸雙向調(diào)節(jié)腦腸肽含量而實(shí)現(xiàn)[11]。參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的腦腸肽有20余種，主要包括胃泌素（GAS）、胃動(dòng)素（MTL）、5-羥色胺（5-HT）、褪黑素（MT）。GAS具有增強(qiáng)胃動(dòng)力、延緩胃排空等作用，MTL可通過增強(qiáng)胃動(dòng)力調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的紊亂[12]，有實(shí)驗(yàn)報(bào)道正常大鼠睡眠剝奪后血清中GAS、MTL的含量變化明顯[13]，由此證明GAS、MTL具有調(diào)節(jié)睡眠節(jié)律紊亂的作用；5-HT在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布密集，主要參與調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)及相關(guān)激素分泌的同時(shí)又有調(diào)節(jié)睡眠－覺醒周期的作用[14-15]，研究證明5-HT對調(diào)節(jié)睡眠－覺醒周期發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)節(jié)與睡眠相關(guān)物質(zhì)GAGB、Glu、TNF-α的含量調(diào)控睡眠－覺醒周期[16]；MT主要分布于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有調(diào)節(jié)睡眠－覺醒周期、誘導(dǎo)睡眠的作用[17]，MT具有保護(hù)胃黏膜完整性、促進(jìn)潰瘍愈合、升高胃泌素含量等作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明，腹腔注射PCPA可導(dǎo)致大鼠睡眠潛伏期顯著延長、睡眠時(shí)間明顯縮短、血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量顯著降低；辨證、辨病、辨證結(jié)合辨病選穴均可縮短失眠大鼠睡眠潛伏期、延長睡眠時(shí)間、增加血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量，其中辨證選穴組血清中MTL、GAS含量增加明顯，證明辨證選穴主要通過提高M(jìn)TL、GAS的含量而改善睡眠；辨病結(jié)合辨證選穴組血清中5-HT、MT含量增加明顯，證明辨證結(jié)合辨病選穴通過提高5-HT、MT的含量而改善睡眠。

綜上，3種腧穴配伍選穴法的效應(yīng)機(jī)制是通過提高血清中MTL、GAS、5-HT、MT的含量、延長睡眠時(shí)間、縮短睡眠潛伏期而改善失眠大鼠的睡眠質(zhì)量，對失眠具有調(diào)治作用；綜合3種腧穴配伍對失眠大鼠睡眠潛伏期、睡眠時(shí)間及MTL、GAS、5-HT、MT含量的影響支持辨病結(jié)合辨證選穴為針刺治療失眠的最佳腧穴配伍方法。