李可心，張 玉，2，3，4，周冉冉，陳茂彬，2

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院, 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2 湖北工業(yè)大學(xué)麻城產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 麻城 438300；3 湖北省菊花產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，湖北 麻城 438300；4 麻城市公共檢驗檢測中心，湖北 麻城 438300)

菊花作為一種食用和藥用同源植物，在中國已有2000多年的歷史。其富含黃酮類、多酚類等生物活性物質(zhì)，不僅可以改善視力，還具有保護心血管、保護神經(jīng)、保護肝臟、保護眼睛、抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物學(xué)活性[1-3]。湖北麻城地區(qū)盛產(chǎn)菊花，麻城黃金菊因其顏色金黃燦爛、味道清新淡雅、富含生物活性物質(zhì)以及較高的抗氧化活性而備受人們青睞[4-5]。目前對于黃金菊的研究大多為香氣成分、抗寒性等生理指標以及分子克隆方面[6]，而對于黃金菊中功效性成分的研究，特別是藥食同源菊花新種質(zhì)“黃金菊”的總黃酮提取及其主要成分分析研究不足?？傸S酮的提取方法主要有微波提取法、酶解法、亞臨界水法及熱水回流法等，如崔建強等[7]利用微波法提取野菊花總黃酮，提取率較低，僅為0.47%；李金鳳等[8]使用亞臨界水提取懷菊總黃酮，但在提取過程中條件溫度較高，可能會對黃酮物質(zhì)造成影響；師艷秋等[9]利用酶法提取荷葉總黃酮，提取時間短，提取純度高，但提取成本也相對較高。前期也有報道利用熱水回流法提取黃金菊中總黃酮[10]，但該法存在水提時間過長、提取率較低等問題[11]。而超聲波提取法耗時短、能耗少，提取率高[12]，因此，本實驗采用超聲波提取法展開進一步探索。

圖 1 蘆丁標準曲線

據(jù)報道，菊花中的黃酮化合物有89種，主要為芹菜素、金合歡素、木犀草素和香葉木素以其與葡萄糖、葡萄糖醛酸、蕓香糖、木犀草苷、紫云英苷、蘆丁、槲皮素、丙二?；肴樘呛捅；咸烟切纬傻奶擒誟13]。這些化合物都具有一定的生理活性。木犀草素及其苷類木犀草苷對腫瘤壞死因子有顯著的抑制作用(p<0.01)[14]，紫云英苷可以抑制缺氧誘導(dǎo)的卵巢癌細胞增殖和侵襲[15]，以及增加大鼠胰島細胞的胰島素分泌[16]。蘆丁和槲皮素在菊花中的含量也相對較高[17-18]。為充分了解黃金菊中黃酮類化合物的種類和含量，本文使用響應(yīng)面優(yōu)化法提取黃金菊總黃酮，并使用高效液相色譜(HPLC)對黃金菊的5種主要黃酮類化合物進行定性定量分析，以期為麻城地區(qū)黃金菊的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 實驗材料及方法

1.1 試驗材料

黃金菊購于湖北省麻城市，粉碎粒度分別處理成40目、60目、140目以及超微粉碎(800目)，于密封袋中4℃保存，備用。

1.2 試驗試劑

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蘆丁、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、紫云英苷，色譜純，購于武漢泰晟生物科技有限公司；甲醇、磷酸，色譜純，購于美國Fisher有限公司。

1.3 實驗器材

TP310Z電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；BJ-400T拜杰多功能粉碎機(德清拜杰電器有限公司)；BW-6BL超微粉碎機(山東百順機械有限公司)；GB6003.1-1997標準檢驗篩60目、40目(浙江上虞市五四紗篩廠)；X1R國家統(tǒng)一標準篩140目(紹興海特儀器有限公司)；DTC-8超聲波清洗機(鼎泰(湖北)生化科技設(shè)備制造有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；ZXFD-B5250鼓風干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；R-404A臺式高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技公司)；U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.4方法

1.4.1標準曲線稱量蘆丁20 mg，用甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，定容，即為1 mg/mL的蘆丁標準溶液。

吸取上述標準蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0(mL)于10 mL容量瓶，依次加入5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0(mL)甲醇溶液，取200 μL于試管中，再分別加入0.4 mL的5% NaNO2溶液，搖勻并靜置6 min，0.4 mL的8% Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min，4 mL的5% NaOH溶液，搖勻后靜置20 min，定容。在512 nm處測定吸光度，用第一管溶液作空白參照，繪制標準回歸曲線。

1.4.2菊花總黃酮的提取及含量測定稱取1 g指定粉碎粒度的菊花粉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 60%的酒精提取(料液比1∶50，g/mL)，將超聲清洗儀設(shè)置為指定溫度、時間，提取后在室溫下靜置24 h，離心，3500 r/min，10 min，吸取上清液200 μL于10 mL的試管中。按照上述方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算總黃酮含量，菊花總黃酮提取率

式中：X為根據(jù)標準曲線計算所得總黃酮含量，mg/mL；N為料液比，g/mL。

1.4.3單因素試驗設(shè)計分別以粉碎粒度(800目、140目、60目、40目)、提取溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)(g/mL)為影響因素進行單因素試驗，研究各個因素對總黃酮提取率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素結(jié)果分別設(shè)定3個因素3個水平，并采用響應(yīng)面(Box-Behnken)分析響應(yīng)面結(jié)果。

1.6 黃酮類化合物分析

1.6.1色譜條件色譜柱為Hypersil GOLD C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，分別嘗試甲醇和0.1%磷酸、甲醇和0.1%甲酸、乙腈和0.1%磷酸以及乙腈和0.1%甲酸為流動相，最終確定甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B；波長275 nm，梯度洗脫流速1 mL/min，洗脫程序見表1。流量1 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL。

表1 洗脫程序

1.6.2標準樣品溶液制備單標的制備。分別稱取20 mg標準品，加入200 μL甲醇溶解，再將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的標準儲備液。再取100 μL溶于1 mL甲醇中，即得200 μg/mL的標準溶液，使用一次性注射器將標準溶液轉(zhuǎn)移至液相進樣瓶，用0.22 μm有機濾頭過濾。

混標的制備。分別取木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁標準儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到混合標準品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3樣品制備及測定按照優(yōu)化后的方法提取總黃酮，并使用上述方法進行HPLC分析測定。

1.6.4方法學(xué)考察6個濃度級別的混合標準液按1.6.1方法檢測。以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到6個化合物的線性回歸方程。根據(jù)線性回歸方程的R2判斷樣品的線性關(guān)系。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性加標回收率，按照周衡樸[19]的方法并稍作修改。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

本實驗采用Box-Behnken 8.5軟件進行數(shù)據(jù)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

縱坐標為吸光度(Y)，橫坐標為蘆丁質(zhì)量濃度(X/mg·mL-1)，得到的線性回歸方程為：Y=4.3148X+0.0048，R2=0.9996，線性相關(guān)性良好。

2.1.1粉碎粒度對總黃酮提取率的影響該單因素實驗設(shè)為4個處理，分別為800目、140目、60目、40目。超聲提取溫度40 ℃、時間30 min、料液比1∶50(g/mL)。

根據(jù)圖2可以看出，黃金菊總黃酮含量隨粉碎粒度的增大而下降，即產(chǎn)品粉碎越細總黃酮提取率越高。800目組的總黃酮含量最高，40目組的總黃酮含量最低。這可能是由于菊花粉的粒度越小，其與提取液的接觸面積就越大，總黃酮的提取結(jié)果就越好。

圖 2 粉碎粒度對總黃酮提取率的影響

圖 3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.1.2超聲提取溫度對總黃酮提取率的影響該單因素實驗在菊花的粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取的時長為30 min、料液比為1∶50(g/mL)的條件下，對比不同超聲提取溫度對菊花總黃酮提取的影響。

根據(jù)圖3的整體趨勢可以知道，黃金菊總黃酮含量隨著超聲提取溫度的升高而升高。在提取溫度達到60℃及以上時，總黃酮含量達到最高并且趨于穩(wěn)定。由于溫度越高能耗越大，綜合考慮，選擇60℃較適宜。

圖 4 超聲處理時間對總黃酮提取率的影響

2.1.3超聲提取時間對總黃酮提取率的影響該單因素實驗在菊花粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取溫度為40℃、料液比為1∶50(g/mL)的條件下，對比不同的超聲提取時長對菊花總黃酮的提取帶來的影響。

根據(jù)圖4的整體趨勢可知，黃金菊總黃酮含量隨著超聲提取時間的延長而升高。當超聲提取時間達到30 min及以上時，菊花總黃酮含量基本達到最大且趨于穩(wěn)定?？紤]到能耗較大的問題，以超聲處理30 min為宜。

圖 5 料液比對總黃酮提取率的影響

2.1.4料液比對總黃酮提取率的影響該單因素實驗在菊花粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取溫度為40℃、超聲提取時間為30 min的條件下，對比不同料液比(g/mL)對菊花總黃酮的提取帶來的影響。

根據(jù)圖5的整體趨勢走向可知，隨著提取液比例的提高，總黃酮提取率也不斷升高。當料液比達到1∶50(g/mL)時，總黃酮含量基本達到最大且趨于穩(wěn)定?？赡苡捎谠诹弦罕葹?∶30、1∶40時總黃酮已經(jīng)飽和，導(dǎo)致總黃酮無法繼續(xù)溶出，因此溶劑的增加不會進一步提高提取率[21]。所以綜合成本和提取率因素的影響，料液比為1∶50(g/mL)時最好。

2.1.5響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析根據(jù)表2，第17組處理的總黃酮提取率最高，為9.02%；依次下來是處理16和處理12，分別為8.87%、8.81%；總黃酮數(shù)值最低的是處理4，為6.80%。響應(yīng)面模型F值為31.77，p值<0.0001，說明模型極顯著，失擬項p=0.166，表明該模型與實際的擬合度高，可以很好地反映出實驗真實值；模型的一次項C具有極顯著性，交互項AB、AC、BC無顯著性，二次項A2、B2、C2具有顯著性，表明提取溫度、提取時間和料液比均對黃金菊總黃酮提取率有顯著影響，但各因素之間沒有影響。三者對總黃酮提取率的影響由高到低依次為料液比>提取時間>提取溫度。

表2 總黃酮提取工藝的響應(yīng)面實驗方案與結(jié)果

對影響因素進行回歸擬合得到回歸方程：

Y=9.04-0.37A-0.12B+2.15C-0.80AB+2.62AC+

5.62BC-0.255A2-0.62B2+2.62C2，R2=0.9973

表明此方程擬合度較高，與實際情況高度相符。

據(jù)圖6能看出三個因素之間交互作用的強度和對響應(yīng)值的影響。

(a)提取溫度與提取時間二因素響應(yīng)

由圖6a可知，提取時間和提取溫度的二因素交互作用響應(yīng)曲線最陡峭，說明兩者的二次項對菊花總黃酮提取率影響最明顯；同理可得，圖6b中，提取溫度和料液比對總黃酮得率影響較小，曲線較平緩。從圖6c可知，料液比曲面較陡峭，因此料液比二次項對總黃酮提取率影響較顯著。響應(yīng)圖整體呈現(xiàn)倒扣的“碗狀”，由此可得各因素之間交互作用不明顯。

根據(jù)回歸擬合方程可確定黃金菊總黃酮提取工藝條件：提取溫度為58.71℃、提取時長為27.25 min、料液比為1∶49.91(g/mL)?？紤]到實際情況，優(yōu)化工藝條件為：提取溫度為60℃、提取時間為30 min、料液比為1∶50(g/mL)。按照此工藝條件進行3次平行驗證實驗，最后得到黃金菊總黃酮提取率為9.01%，與理論值偏差0.33%，說明該方法可靠。

2.2 黃酮成分HPLC測定

2.2.1HPLC結(jié)果各色譜峰分離效果最佳。如圖7所示，色譜圖的基線平穩(wěn)，5種化合物的分離度良好，峰形比較規(guī)范。

圖 7 混合標準品液相色譜

2.2.2方法學(xué)考察結(jié)果

1)線性關(guān)系 如表3所示，各個化合物在線性范圍內(nèi)的回歸方程線性關(guān)系良好。

表3 5種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果

2)精密度 低質(zhì)量濃度組、中質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組中木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積相對標準偏差在0.83%～4.05%之間，表明分析方法的精密度良好。

3)穩(wěn)定性 木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積相對標準偏差分別為0.44%、1.25%、2.73%、3.01%、0.54%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4)重復(fù)性 木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積RSD分別為0.51%、0.77%、1.42%、1.43%、0.96%，表明該方法重復(fù)性較好。

5)加標回收率 按照1.6.4中加標回收率的考察方法，計算木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁的加標回收率與RSD，結(jié)果如表4所示，說明此方法可靠。

表4 回收率實驗結(jié)果

5)HPLC結(jié)果 黃金菊各化合物含量如表5所示。蘆丁和槲皮素的含量分別為2.2604 mg/g、1.8301 mg/g；木犀草苷的含量比木犀草素略高；紫云英苷含量為0.2809 mg/g，為5種化合物中含量最低的。

表5 黃金菊中主要黃酮化合物含量

3 結(jié)論

3.1 黃金菊總黃酮提取工藝研究

黃酮的提取會受到提取液類型、提取溫度、提取方法等多方面因素的影響。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃金菊總黃酮提取工藝，得到了最佳工藝參數(shù)：超聲提取溫度60℃，超聲提取時間30 min，料液比1∶50(g/mL)；提取率最高為9.01%，是回流法[9]的1.71倍，醇提法的3.2倍[21]。提取率較高的原因可能是超聲波的震蕩破壞了植物細胞和細胞膜結(jié)構(gòu)，促使細胞內(nèi)物質(zhì)加速透過細胞膜，從而提高了樣品中總黃酮的提取率。

3.2 黃酮類化合物的組分分析

本研究采用高效液相色譜法(HPLC)測定黃金菊中木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁5種黃酮類化合物，建立了精密度高、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的HPLC測定方法，可作為菊花中黃酮類成分的檢測方法；研究發(fā)現(xiàn)麻城黃金菊中蘆丁和槲皮素的含量較高，分別為0.13%、0.18%；紫云英苷為0.029%，木犀草素、木犀草苷的含量分別為0.042%、0.0614%，并且這些組分均具有良好的抗氧化性能，說明黃金菊具有非常高的研究和商用價值。