施譯琳，楊?yuàn)W林，王銳杰，牙甫禮，陳彥球，楊 燕1，

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（深圳），廣東深圳 518106；3.廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080；4.廣東省營養(yǎng)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510080；5.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671003；6.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州 510623）

血小板是成熟巨核細(xì)胞上脫落下來的細(xì)胞質(zhì)小塊，具有止血、凝血的基本生理功能［1］。線粒體是能量代謝的主要場所，對維持細(xì)胞生理功能和生存所需的代謝底物生成至關(guān)重要［2］。越來越多的證據(jù)表明，血小板線粒體通過能量產(chǎn)生以外的途徑（氧化還原信號和細(xì)胞凋亡途徑）激活血小板，發(fā)揮促血栓形成作用［3］。在糖尿病患者的血小板中，功能紊亂的線粒體比例增加，導(dǎo)致血小板凋亡率升高、存活率降低，伴隨血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)增加［4］。已有實(shí)驗(yàn)證明過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）極易透過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，H2O2性質(zhì)相對穩(wěn)定、易于獲得，已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具［5］。氧化應(yīng)激狀態(tài)下的血小板，線粒體發(fā)生輕度損傷，膜電位下降，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成速率下降，導(dǎo)致線粒體活性氧簇（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）累積?；钚匝醮兀╮eactive oxygen species，ROS）可促進(jìn)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的失衡，導(dǎo)致線粒體膜電位進(jìn)一步下降，直至線粒體嚴(yán)重?fù)p壞，釋放細(xì)胞色素c 誘發(fā)細(xì)胞凋亡［6］。輔酶Q（coenzyme Q，CoQ）是一種類似于維生素的脂溶性苯醌，是線粒體電子傳遞鏈上重要的中間體，人體中主要以CoQ10形式存在［7］。流行病學(xué)、臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，CoQ10具有廣泛的抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體等功能［8］。CoQ10對血小板的研究報(bào)道不多，集中在對血小板體積和活化、聚集功能的效應(yīng)研究［9］。我們前期的研究結(jié)果表明，CoQ10具有通過整合素αIIbβ3 調(diào)節(jié)血小板活化、聚集功能的作用［10］，但是CoQ10是否具有血小板線粒體功能紊亂的保護(hù)作用尚無報(bào)道。因此，本研究擬在H2O2誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激模型中探討CoQ10對線粒體功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)，并探究其抗氧化機(jī)制，為CoQ10保護(hù)血小板線粒體功能提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對 象

招募健康志愿者，性別不限，年齡25～65 歲之間，4 周內(nèi)未飲用濃茶、咖啡、紅酒等可能影響血小板功能的飲料，無吸煙史，未補(bǔ)充維生素及CoQ10等營養(yǎng)補(bǔ)充劑，未服用阿司匹林等抗血小板藥物。所有研究均依照赫爾辛基宣言進(jìn)行，所有志愿者均簽署知情同意書，并由中山大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 材料與試劑

CoQ10（＞98%）、二甲基亞砜（DMSO）、H2O2、無水氯化鈣（CaCl2）購自Sigma 公司。JC-1、Annexin-V 購自BD 公司；ATP 檢測試劑盒購自上海碧云天公 司；Total ROS Assay Kit、Mitochondria Isolation Kit、MitoSOX?Red 探針購自Thermo Fisher 公司。一抗p53、p-p53、Bcl-2、Bcl-xL 購自CST公司，一抗β-actin 購自Sigma 公司；二抗goat anti-rabbit、goat anti-mouse購自Abcam公司。

1.3 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀，購自美國伯騰公司；流式細(xì)胞儀CytoFlex S，購自美國Beckman 公司；Mini-Protean電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備，購自美國伯樂公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，購自中國Tanon公司。

1.4 方 法

1.4.1 人純化血小板的制備 健康志愿者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取外周靜脈血約10 mL，按9：1的體積比加入枸櫞酸鈉抗凝劑，輕輕混勻，靜置15 min后，將全血以300×g離心10 min，獲得富血小板血漿（platelet-rich Plasma，PRP）；將PRP 通過凝膠柱，收集到純化血小板，用PIPES 緩沖液（1 L 溶液含8.38 g PIPES、8.01 g NaCl、0.298 g KCl 和1 g 葡萄糖，pH 7.0）稀釋至2×108～3×108個(gè)/mL。

1.4.2 血小板線粒體膜電位測定 用100 μmol/L CoQ10與純化血小板（1×106個(gè)/mL）避光孵育50 min。加入為5 μg/mL 的JC-1 工作液，室溫避光孵育15 min，然后在1 mmol/L 的CaCl2溶液存在下，加入1 mmol/L 的H2O2激活血小板30 min。孵育結(jié)束后加入PBS，立即上機(jī)檢測。用流式細(xì)胞儀檢測JC-1 單體及復(fù)合物熒光信號的變化，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，下同。

1.4.3 血小板PS 外翻陽性率測定 用100 μmol/L CoQ10與純化血小板（1×106個(gè)/mL）避光孵育50 min。加入1 mmol/L H2O2激活血小板15 min。避光加入Annexin V 抗體，室溫下孵育15 min 后，加入Binding buffer 終止反應(yīng)，30 min 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)弱，確定PS外翻陽性率。

1.4.4 血小板線粒體分離 干預(yù)后的血小板離心棄上清。加入線粒體分離試劑A，中速旋渦5秒，冰上反應(yīng)2 min。加入試劑B，高速渦旋5 s，在冰上孵育5 min，每分鐘渦旋1 次。加入試劑C，顛倒混勻（不要渦旋）。在4°C 下以700×g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP 管中，4°C 下以12 000×g離心15 min。將上清（胞漿部分）轉(zhuǎn)移到新的EP 管中。沉淀則為線粒體組分。向沉淀中加入試劑C，12 000×g離心5 min，棄上清即得純化的線粒體。

1.4.5 血小板ATP 含量測定 干預(yù)后的血小板通過離心（12 000 ×g，15 min，4℃）得到細(xì)胞沉淀，或按照1.4.4 分離出線粒體組分，加入細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打使其充分混勻，在冰上裂解30 min，每隔10 min 渦旋約10 s。裂解完成后，進(jìn)行離心（12 000 ×g，15 min，4℃），上清液即為血小板蛋白，收集上清并進(jìn)行ATP濃度的檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度。

1.4.6 血小板ROS 水平檢測 按照試劑盒說明書檢測。100 μmol/L CoQ10與純化血小板懸液（1×106個(gè)/mL）避光孵育50 min 后，加入ROS 熒光探針孵育30 min，與1 mmol/L 的H2O2孵育30min。離 心（200×g，10 min，室溫）棄上清，洗去多余探針，用酶標(biāo)儀檢測ROS水平。

1.4.7 血小板mtROS 水平檢測 用100 μmol/L CoQ10與純化血小板（1×106個(gè)/mL）避光孵育50 min。加入終濃度為2 μmol/L 的mitoSOX Red 探針，室溫下避光孵育30 min，然后在1 mmol/L 的Ca-Cl2溶液存在的條件下，加入1 mmol/L 的H2O2激活血小板30 min。洗去多余探針，立即用流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度。

1.4.8 Western Blot 檢測血小板蛋白水平 血小板加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 ×g離心15 min，所得上清即為細(xì)胞總蛋白。測量并調(diào)整蛋白濃度后，100 ℃煮5 min，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0～30 μg 樣本上樣，將樣本電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%BSA 室溫封閉1 h，TBST 洗膜3 次。分別加入特異性一抗，放入4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3 次。使用ECL 化學(xué)發(fā)光，用凝膠成像儀成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并且使用Dunnett-t檢驗(yàn)將每個(gè)CoQ10組與對照組進(jìn)行比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CoQ10降低H2O2誘導(dǎo)的總ROS、線粒體ROS

在1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)下，血小板胞內(nèi)總ROS顯著升高，且線粒體氧化應(yīng)激水平也升高。與對照組相比，CoQ10顯著降低ROS 水 平（F=71.66，P＜0.000 1，指定組間比較P＜0.05；圖1）。

圖1 CoQ10降低H2O2誘導(dǎo)的總ROS、mtROS Fig.1 The inhibitory effect of CoQ10 on H2O2-induced platelet intracellular ROS and mtROS

2.2 CoQ10改善H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降

由圖2 可知，在1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)下，血小板線粒體膜電位顯著下降。與對照組相比，CoQ10顯著抑制膜電位下降（F=81.00，P＜0.000 1，指定組間比較P＜0.05；圖2）。

圖2 CoQ10改善H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降Fig.2 The protective effect of CoQ10 on H2O2-induced platelet mitochondrial membrane potential dissipation

2.3 CoQ10對H2O2誘導(dǎo)的PS外翻陽性率無影響

在1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)下，血小板PS 外翻顯著增加。與對照組相比，CoQ10顯著對PS 外翻的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（方差分析F=653.9，P＜0.000 1，指定組間比較P＞0.05；圖3）。

圖3 CoQ10對H2O2誘導(dǎo)的PS外翻無影響Fig.3 CoQ10 did not affect the H2O2-induced platelet PS exposure.

2.4 CoQ10 對H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞總ATP、線粒體ATP含量無影響

在1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)下，血小板ATP 含量顯著下降。與對照組相比，CoQ10對ATP 含量下降無抑制作用（方差分析F=30.24，P＜0.000 1，指定組間比較P＞0.05，圖4A；方差分析F=15.50，P=0.001 8，指定組間比較P＞0.05，圖4B）。

圖4 CoQ10對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞總ATP、線粒體ATP含量無影響Fig.4 CoQ10 did not affect the H2O2-induced platelet cellular or mitochondrial ATP content.

2.5 CoQ10 降低H2O2誘導(dǎo)的p53 磷酸化水平、增加Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平

p53 是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路蛋白，Bcl-2、Bcl-xL 是抗凋亡蛋白。由圖5 可知，在1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)下，血小板p53 磷酸化水平顯著升高而Bcl-2、Bcl-xL 下降。與對照組相比，CoQ10顯著抑制p53 磷酸化水平（F=40.41，P=0.001 9，指定組間比較P＜0.05；圖5A），升高Bcl-2、Bcl-xL 蛋白表達(dá)水平（圖5BF=18.79，P=0.007 9，圖5CF=19.89，P=0.007 2，指定組間比較P＜0.05）。

圖5 CoQ10降低H2O2誘導(dǎo)的p53磷酸化水平并升高Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)水平Fig.5 CoQ10 reduced H2O2-induced platelet phosphorylation level of p53 and increased Bcl-2 and Bcl-xL expression level.

3 討論

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷。H2O2是ROS 的一種，通過作用于膜上受體或直接進(jìn)入胞內(nèi)，發(fā)揮促氧化作用［11］。氧化應(yīng)激與代謝綜合征密切相關(guān)。代謝紊亂人群存在H2O2等氧化代謝產(chǎn)物堆積的現(xiàn)象，循環(huán)中氧化應(yīng)激水平更高，線粒體功能發(fā)生紊亂［12］。血小板線粒體是ATP 產(chǎn)生的關(guān)鍵場所，然而，近年來大量研究表明線粒體還參與了能量產(chǎn)生以外的許多過程，如ROS的產(chǎn)生、鈣離子穩(wěn)態(tài)、凋亡調(diào)節(jié)［13］。健康的血小板含有5～8 個(gè)線粒體，大多數(shù)線粒體必須保持正常，血小板才能維持正常功能。線粒體受損會導(dǎo)致血小板凋亡，誘導(dǎo)動(dòng)脈血栓形成［14］。因此，保持血小板線粒體的健康至關(guān)重要［3］。線粒體功能紊亂可能導(dǎo)致代謝紊亂人群的血栓風(fēng)險(xiǎn)增加［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2的誘導(dǎo)下，血小板氧化應(yīng)激水平顯著升高，線粒體功能紊亂。CoQ10可以顯著抑制線粒體膜電位下降，清除ROS和mtROS，抑制血小板凋亡的早期信號。然而CoQ10無法抑制血小板PS外翻，這可能是因?yàn)镻S外翻的血小板內(nèi)的線粒體損傷是不可逆的，包括ROS大量生成、線粒體膜的劇烈去極化和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的形成［16］。這提示針對線粒體損傷應(yīng)當(dāng)及早預(yù)防、注重早期修復(fù)，減少進(jìn)入凋亡后期的細(xì)胞。

p53 蛋白是細(xì)胞對于多種損傷產(chǎn)生應(yīng)答的中心傳感器，它能在氧化應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)心梗模型、體外高葡萄糖處理模型中，心肌細(xì)胞內(nèi)絲氨酸（Ser）15 處位點(diǎn)的p53 磷酸化增加［17-18］，介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激條件下血小板ROS 累積介導(dǎo)的p53 磷酸化導(dǎo)致線粒體損傷、線粒體膜電位下降，進(jìn)而參與促進(jìn)血小板凋亡［19］。通過抗氧化劑NAC 治療可明顯減輕p53 磷酸化導(dǎo)致的線粒體功能障礙［20］。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H2O2誘導(dǎo)下，血小板p53 磷酸化水平顯著升高，CoQ10可以顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，表明CoQ10可能是通過清除ROS 降低p53 磷酸化水平，發(fā)揮抑制線粒體損傷的作用。Bcl-2、Bcl-xL 是Bcl-2 家族抗凋亡蛋白，位于線粒體表面，具有維持線粒體膜穩(wěn)定的功能［21］。在H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞活力降低，Bcl-2、Bcl-xL 表達(dá)量下降［22］，藥物干預(yù)后可顯著增加其表達(dá)量，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［23］。我們的結(jié)果與文獻(xiàn)一致，氧化應(yīng)激條件下其表達(dá)水平下降，而CoQ10可以恢復(fù)其表達(dá)水平，避免細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。p53 還可與Bcl-2、Bcl-xL形成兩種異二聚體，拮抗其抗凋亡功能［24-25］。因此p53與Bcl-2、Bcl-xL是否通過共定位調(diào)控凋亡值得后續(xù)研究深入探討。

CoQ10是存在于各種食物中的脂溶性抗氧化成分，也是重要的內(nèi)源性細(xì)胞組分，參與線粒體能量代謝［26］。作為常見的膳食補(bǔ)充劑，CoQ10具有廣泛的抗氧化效應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)CoQ10可以顯著抑制p53 的磷酸化，這可能是其發(fā)揮抗ROS 的機(jī)制之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CoQ10能夠提高靜息血小板胞內(nèi)cAMP 水平［10］，cAMP 的提高與氧化水平負(fù)相關(guān)［27］，因此這也是CoQ10抗氧化的可能機(jī)制。CoQ10對于凋亡早期的線粒體功能紊亂具有顯著抑制作用。然而，CoQ10是否通過調(diào)節(jié)cAMP參與抑制血小板線粒體功能紊亂還有待證實(shí)。CoQ10補(bǔ)充具有很高的安全性，長時(shí)間大劑量的攝入無毒副作用［28］。CoQ10的體外孵育劑量設(shè)置參考前期研究結(jié)果，但由于血小板體外培養(yǎng)時(shí)間限制，因此我們未能觀察CoQ10對線粒體功能的長期保護(hù)效應(yīng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CoQ10能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板線粒體功能紊亂，其作用機(jī)制與抑制ROS/p-p53 和Bcl-2/ Bcl-xL 信號通路有關(guān)。本研究為CoQ10預(yù)防線粒體損傷相關(guān)的血栓風(fēng)險(xiǎn)提供了理論依據(jù)。