羅祥敏，楊興變，雷 芳，都國(guó)棟，何 珺**

（1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

引 言

銀杏葉具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效[1]，主要含有黃酮類(lèi)、萜內(nèi)酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)等活性成分[2]。銀杏葉提取物是銀杏葉經(jīng)過(guò)提取、柱層析純化得到的產(chǎn)物，具有擴(kuò)血管、清除體內(nèi)自由基、抗心肌缺血、抗氧化及改善高血壓腦出血術(shù)后患者神經(jīng)功能等作用[3～6]。2020 年版藥典要求銀杏葉中總黃酮含量≥0.40%、總萜內(nèi)酯含量≥0.25%，指紋圖譜相似度＞0.9[7]。近年來(lái)，隨著有機(jī)酸類(lèi)活性成分研究的深入[8]，銀杏葉及制劑中的有機(jī)酸的藥理作用越來(lái)越受到關(guān)注[9～13]。莽草酸具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腦缺血等藥理作用，是抗禽流感藥物“達(dá)菲”的重要合成前體[14]；綠原酸具有心血管保護(hù)、抗誘變、抗癌、抗白血病、抗菌、抗病毒、降脂、降糖等作用[15]。在銀杏葉提取物生產(chǎn)過(guò)程中，柱層析廢液中含有大量莽草酸，對(duì)其進(jìn)行回收提純，制備高純度莽草酸是很有意義的。已有文獻(xiàn)報(bào)告，銀杏葉中總黃酮及總萜內(nèi)酯含量受到產(chǎn)地、樹(shù)齡及干燥方式等因素影響[16～21]。但對(duì)銀杏葉中的有機(jī)酸莽草酸和綠原酸的相關(guān)報(bào)告鮮少。因此，為了銀杏葉的綜合利用開(kāi)發(fā)，對(duì)不同樹(shù)齡及不同采收月份的銀杏葉中的總黃酮、總萜內(nèi)酯、莽草酸及綠原酸進(jìn)行HPLC含量分析，探索出其分布規(guī)律。這對(duì)科學(xué)合理地充分使用銀杏葉資源，實(shí)現(xiàn)其資源高效綜合利用，具有較大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)意義。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent1100），美國(guó)；超高效液相色譜儀（島津LC-2040C 3D），日本；超聲波清洗器（KQ3200DE），昆山市超聲儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140 MBE），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子分析天平（BT25S），塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH.W21-600C），北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；其他為一般常規(guī)儀器。

甲醇、乙腈（色譜純），德國(guó)MERCK 公司；水為娃哈哈純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)照品及供試品

對(duì)照品：槲皮素（110862-201510）、山柰素（110861-201310）、異鼠李素（110860-201410）、銀杏內(nèi)酯A（10011506）、銀杏內(nèi)酯B（110863-200508）、銀杏內(nèi)酯C（09102111）及白果內(nèi)酯（09082711），以上試劑均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品（18071724，純度98%）及綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（09081633，純度98%）購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

供試品：不同樹(shù)齡銀杏葉（1 年、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年、7 年、8 年、10 年、100 年、200 年）于2020年8 月份采自貴州省銀杏種植基地；不同采摘期銀杏葉（4 月至11 月，為2020 年采自貴州貴陽(yáng)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 4 種活性成分HPLC 測(cè)定色譜條件

總黃酮色譜條件：LC-2040C 3D 超高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水（50∶50），流速為1mL·min-1，波長(zhǎng)為360nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫50℃。

總萜內(nèi)酯色譜條件：Agilent1100 高效液相色譜儀，RID 檢測(cè)器，ODS-U 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇- 水（30∶70），流速為1mL·min-1，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

莽草酸色譜條件：LC-2040C 3D 超高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，Inertsil 氨基柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水（15∶85），流速為1mL·min-1，波長(zhǎng)為213nm進(jìn)樣量10μL，柱溫25℃。

綠原酸色譜條件：LC-2040C 3D 超高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），流速為0.8mL·min-1，波長(zhǎng)為324nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃。

圖1 供試品中黃酮色譜分析圖Fig.1 The chromatographic analysis of flavonoids in test products

圖2 供試品中莽草酸色譜分析圖Fig.2 The chromatographic analysis of shikimic acid in test products

圖3 供試品中總萜內(nèi)酯色譜分析圖Fig.3 The chromatographic analysis of total terpene lactones in test samples

2.2 對(duì)照品溶液的制備

總黃酮對(duì)照品制備：精密稱(chēng)取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量置于50mL 容量瓶中，加甲醇將其配制成每1mL 含槲皮素30μg、山柰素30μg、異鼠李素20μg 的混合溶液，過(guò)0.45μm 濾膜即得。

總萜內(nèi)酯對(duì)照品制備：精密稱(chēng)取銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯對(duì)照品適量放置于50mL 容量瓶中，加50%甲醇配制成每1mL 含銀杏內(nèi)酯A0.18mg、銀杏內(nèi)酯B0.08mg、銀杏內(nèi)酯C0.10mg、白果內(nèi)酯0.20mg 的混合溶液，過(guò)0.45μm 濾膜即得。

綠原酸對(duì)照品制備：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量置于50mL 容量瓶中，加10%甲醇配制成0.215mg·mL-1綠原酸對(duì)照品溶液。

莽草酸對(duì)照品制備：精密稱(chēng)取莽草酸對(duì)照品適量放置于50mL容量瓶中，加10%甲醇配制成0.120mg·mL-1莽草酸對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

總黃酮供試品制備：精密稱(chēng)取0.1g 不同樹(shù)齡及不同采摘期的銀杏葉樣品置于10mL 具塞管中，加入固體水解液（甲醇∶純水∶濃鹽酸=7∶2∶1）后，超聲5min，將其放置于68℃水浴鍋中3h 后取出放冷至室溫，用0.45μm 濾膜過(guò)濾即得。

總萜內(nèi)酯供試品制備：精密稱(chēng)取0.2g 不同樹(shù)齡及不同采摘期的銀杏葉樣品置于10mL 具塞管中，分別加入3mL 甲醇溶液超聲5min，放置于68℃水浴鍋中，30min 取出放冷至室溫，再加入2mL 水繼續(xù)超聲2min 混勻，過(guò)酸性Al2O3即得。

莽草酸供試品制備：精密稱(chēng)取0.1g 不同樹(shù)齡及不同采摘期的銀杏葉樣品置于10mL 具塞管中，加10mL 水在40℃中超聲30min，取出放冷，過(guò)微濾即得。

綠原酸供試品制備：精密稱(chēng)取0.15g 不同樹(shù)齡及不同采摘期的銀杏葉樣品置于10mL 具塞管中，加10mL 水后在40℃中超聲30min，取出放冷，用0.45μm 濾膜過(guò)濾即得。

2.4 含量測(cè)定及計(jì)算方法

分別將對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣到相應(yīng)高效液相色譜儀，按照2.1 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10μL，記錄各自的峰面積，綠原酸和莽草酸含量按公式（1）計(jì)算，總黃酮和總萜內(nèi)酯含量按公式（1）、（2）和（3）計(jì)算：

式中：C標(biāo)表示對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；A樣表示樣品峰面積；V 表示提取液體積（mL）；X 表示對(duì)照品的純度；A標(biāo)表示對(duì)照品峰面積；m 表示樣品質(zhì)量（mg）。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度考察

精密吸取2.3 節(jié)下貴州貴陽(yáng)九月份總黃酮、總萜內(nèi)酯、莽草酸及綠原酸各一個(gè)供試品溶液，按2.1節(jié)下色譜條件分別測(cè)定各供試品5 次，記錄峰面積并計(jì)算RSD 值，總黃酮RSD=0.58%，總萜內(nèi)酯RSD=0.86%，綠原酸RSD=0.66%，莽草酸RSD=0.69%，表明該測(cè)定方法精密度良好。

3.1.2 重復(fù)性考察

精密稱(chēng)取同一樣品5 份，按2.3 節(jié)下供試品制備方法制備供試品溶液，按2.1 節(jié)下色譜條件分別測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD 值，總黃酮RSD=0.98%，總萜內(nèi)酯RSD=1.07%，綠原酸RSD=1.08%，莽草酸RSD=1.20%，表明各測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性考察

分別吸取2.3 節(jié)下的一個(gè)總黃酮、總萜內(nèi)酯、莽草酸及綠原酸供試品溶液，分別放置6、12、18、24、30、36、42、48h 后分別按2.1 項(xiàng)方法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，總黃酮RSD=0.56%，總萜內(nèi)酯RSD=0.58%，綠原酸RSD=0.98%，莽草酸RSD=0.85%。顯示樣品在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.4 加標(biāo)回收率考察

精密稱(chēng)取1g 已知含量的葉子供試品各3 份，分別加入2.2 項(xiàng)對(duì)照品溶液5mL，按2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 銀杏葉中4 種活性成分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 1 The standard recovery rate test results of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves（n=3）

3.2 不同樹(shù)齡銀杏葉中4 種活性成分含量比較

采收貴州省銀杏種植基地8 月份不同樹(shù)齡的銀杏葉，均在相同烘干條件下干燥、粉碎。按照2.3 項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，分別按照2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同樹(shù)齡銀杏葉中4 種活性成分含量（n=3）Table 2 The contents of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves of different tree ages（n=3）

由表2 可知：不同樹(shù)齡的銀杏葉中活性成分含量不同，樹(shù)齡對(duì)銀杏葉中綠原酸、總黃酮、總萜內(nèi)酯含量有較大影響，莽草酸含量受樹(shù)齡影響較小。1～4年樹(shù)齡的銀杏葉中總黃酮、綠原酸均較高，5～10 年總黃酮、總萜內(nèi)酯均達(dá)到藥典要求，而上100 年的銀杏葉中總黃酮含量還保持高于0.40%，但總萜內(nèi)酯含量低于0.25%，質(zhì)量達(dá)不到藥典要求。因此，建議使用樹(shù)齡不高于10 年的銀杏葉為4 種活性成分綜合利用的提取原料。

3.3 不同年生長(zhǎng)月份銀杏葉中4 種活性成分含量比較

采收4 月至11 月貴州貴陽(yáng)銀杏葉，均在相同條件下烘干、粉碎，按照2.3 節(jié)下供試品溶液制備方法制備供試品，分別按照2.1 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同采收月份銀杏葉中4 種活性成分含量（n=3）Table 3 The contents of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves picked in different months（n=3）

由表可知：4 至9 月份銀杏葉中總黃酮和綠原酸含量基本隨采摘月份增加而下降，而總萜內(nèi)酯含量則隨葉子年生長(zhǎng)月份變大而升高，含量8 月至9 月達(dá)到最高，莽草酸含量隨月份變化影響較小，平均含量4.28%?？傸S酮和綠原酸含量10 月和11 月升高，這可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。綜合4 種活性成分含量、銀杏樹(shù)單株采葉質(zhì)量及2020 年版藥典對(duì)銀杏葉總萜內(nèi)酯含量不低于0.25%規(guī)定，建議貴州省銀杏葉采收季節(jié)為8 至9 月最合適。

4 討 論

本文采用HPLC 法對(duì)不同樹(shù)齡及不同年生長(zhǎng)月份的銀杏葉中總黃酮、總萜內(nèi)酯、莽草酸及綠原酸等4 種活性成分進(jìn)行了含量測(cè)定，綜合數(shù)據(jù)分析，選用樹(shù)齡不高于10 年，采摘月份為8 至9 月的銀杏葉作為生產(chǎn)原料較佳。該文研究了銀杏葉中4 種活性成分的分布規(guī)律，為合理選用銀杏葉作為提取原料提供科學(xué)理論依據(jù)，為國(guó)內(nèi)相關(guān)銀杏基地采收銀杏葉提供數(shù)據(jù)參考。同時(shí)，通過(guò)原料質(zhì)量?jī)?nèi)控標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定生產(chǎn)合格銀杏相關(guān)制劑，對(duì)進(jìn)一步提高產(chǎn)品安全性和穩(wěn)定性具有很大的意義。