武碧玲，王志蓮

宮頸癌是全世界女性發(fā)病率及死亡人數(shù)第4位的癌癥[1]，高危人乳頭瘤病毒(high risk-human papilloma virus，HR-HPV)持續(xù)感染可導(dǎo)致女性患宮頸癌[2]。全世界每年新發(fā)宮頸癌病例中近1/3發(fā)生在中國(guó)，在中國(guó)宮頸癌仍是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。因此，深入研究HR-HPV引起宮頸癌變的機(jī)制對(duì)于減少宮頸癌變的發(fā)生發(fā)展有非常重要的臨床意義。

自噬是高度誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)。首先，隔離膜隔離部分細(xì)胞質(zhì)形成雙膜結(jié)構(gòu)，即自噬小體，自噬小體沿著微管穿過(guò)動(dòng)力蛋白-動(dòng)力蛋白復(fù)合物到達(dá)核周區(qū)域，并在此與溶酶體融合，形成自噬溶酶體[4]，最終降解為封閉的內(nèi)容物。抑制自噬溶酶體形成是病毒篡奪自噬的最常見(jiàn)機(jī)制之一，其確保了病毒顆粒的組裝[5]。HR-HPV會(huì)通過(guò)不同的細(xì)胞通路影響宮頸細(xì)胞自噬，但它們似乎有一個(gè)共同的結(jié)果，即抑制自噬溶酶體形成(自噬的最后一步)，這是自噬抑制的主要目標(biāo)。哺乳動(dòng)物自噬過(guò)程中自噬溶酶體是由兩個(gè)自噬特異性SNARE復(fù)合體直接調(diào)控的，即STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體和YKT6-SNAP29-STX7復(fù)合體?，F(xiàn)就直接調(diào)控自噬溶酶體形成的兩個(gè)復(fù)合體及其與宮頸癌變的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體

1.1 STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體形成機(jī)制

STX17為可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)蛋白，包含Qa-SNARE基序，其大量存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有一種特殊的C-末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這對(duì)其在自噬小體上的定位非常重要[6]。STX17通過(guò)C-末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)與免疫相關(guān)GTPase M(immunity-related GTPase M，IRGM)結(jié)合，IRGM進(jìn)而與自噬相關(guān)基因8(autophagy-related 8，ATG8)結(jié)合，ATG8提供了將該復(fù)合體運(yùn)送到自噬小體的地址[7]。VAMP8主要定位于晚期溶酶體，由R-SNARE基序和跨膜結(jié)構(gòu)域組成。SNAP29主要包含Qb-及Qc-SNARE基序，缺乏任何跨膜區(qū)或膜靶向基序，需與其他內(nèi)吞因子相互作用，如STX17[6]。

SNARE復(fù)合體是自噬溶酶體形成的核心機(jī)制，Qa、Qb、Qc和R-SNARE蛋白形成平行四股螺旋束，穩(wěn)定復(fù)合物以促進(jìn)自噬溶酶體形成。到達(dá)完整的自噬小體后，STX17 Qa-SNARE基序可與SNAP29 Qb-SNARE、Qc-SNARE基序和VAMP8 R-SNARE基序共同組裝形成SNARE復(fù)合物，從而介導(dǎo)自噬溶酶體形成。STX17的缺失阻斷了STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的形成，損害了自噬溶酶體形成，導(dǎo)致自噬小體積累[8]。

1.2 STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體形成條件

STX17可以通過(guò)其SNARE結(jié)構(gòu)域的乙?；瘉?lái)修飾，該結(jié)構(gòu)域受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein，CREBBP)和組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2，HDAC2)的特異性調(diào)控。在自噬過(guò)程中，由于CREBBP失活導(dǎo)致STX17去乙酰化，使STX17能夠與SNAP29和同型融合蛋白分選復(fù)合物(homotypic fusion and protein sorting，HOPS)相互作用[9]。

SNAP29的自噬活性受O-連接β-N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc) 修飾的調(diào)節(jié)，這種修飾引起的空間位阻阻礙了STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的形成。饑餓時(shí)，SNAP29上的O-GlcNAc水平降低，未修飾的SNAP29與STX17及VAMP8形成更穩(wěn)定的復(fù)合物[10]。

VAMP8磷酸化可通過(guò)阻斷SM樣蛋白SCFD1到自噬溶酶體的募集抑制STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的形成。VAMP8在去磷酸化時(shí)促進(jìn)SCFD1募集到自噬溶酶體，從而促進(jìn)STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的形成[11]。

1.3 STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體形成協(xié)助因素

盡管SNARE蛋白是自噬溶酶體形成的核心機(jī)制，但是SNARE蛋白本身不能提供有效的融合，需一些栓系因子的幫助。

HOPS是一種進(jìn)化上保守的膜拴系復(fù)合物，由4種核心亞單位蛋白(VPS11、VPS16、VPS18和VPS33A)以及2種補(bǔ)充蛋白(VPS39和VPS41)組成。STX17與HOPS復(fù)合物的多組分亞單位蛋白相互作用，將自噬小體和溶酶體膜緊密連接在一起，促進(jìn)SNARE復(fù)合體的組裝，以介導(dǎo)自噬溶酶體形成，敲除HOPS復(fù)合物組分會(huì)阻止自噬通量并導(dǎo)致自噬小體積累[12]。新型冠狀病毒的ORF3a與HOPS復(fù)合物組分VPS39相互作用并將其螯合，從而阻止HOPS復(fù)合物與STX17相互作用，進(jìn)而阻斷了STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的組裝[13]。

RAB7是小分子鳥(niǎo)苷三磷酸酶(small guanosine triphosphatases，GTPase)中最具特征的成員之一，定位于晚期溶酶體，是真核生物膜運(yùn)輸?shù)闹饕{(diào)節(jié)者，在自噬途徑中具有多種功能，通過(guò)在GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)和GTP結(jié)合的活性狀態(tài)之間循環(huán)，發(fā)揮開(kāi)關(guān)分子作用。莫能菌素敏感蛋白1(monensin sensitivity protein 1，Mon1)-咖啡因、鈣和鋅1復(fù)合物可以激活RAB7并將其招募到自噬小體中[14]。PLEKHM1是一種RAB7效應(yīng)器，能夠在溶酶體膜上招募HOPS復(fù)合物使其與RAB7共同促進(jìn)STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體的組裝[15]。鎘通過(guò)下調(diào)RAB7抑制自噬溶酶體形成，而恢復(fù)RAB7的蛋白表達(dá)后自噬溶酶體形成隨之恢復(fù)[16]。

自噬相關(guān)基因14(autophagy-related 14，ATG14)是Ⅲ類(lèi)磷脂酰肌醇-3激酶(III phosphatidylinositol 3-kinase complex，PI3K)復(fù)合物重要的自噬特異性調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)無(wú)蛋白脂質(zhì)體的膜連接。ATG14通過(guò)卷曲結(jié)構(gòu)域與STX17的SNARE核心區(qū)結(jié)合，穩(wěn)定自噬小體上的STX17-SNAP29二元t-SNARE復(fù)合物，并為其與VAMP8相互作用做準(zhǔn)備，以促進(jìn)自噬溶酶體形成[17]。另外，含有ATG14的空泡蛋白分類(lèi)34(vacuolar protein sorting 34，Vps34)PI3激酶可刺激PI3P(phosphatidylinositol-3-phosphate)陽(yáng)性自噬小體生成，PI3P能吸引Mon1-Ccz1復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)RAB7向自噬小體募集[14]。抑制細(xì)胞中ATG14的表達(dá)，會(huì)損害自噬溶酶體形成，而過(guò)表達(dá)ATG14可促進(jìn)自噬溶酶體形成[18]。

2 YKT6-SNAP29-STX7復(fù)合體

YKT6是一種R-SNARE蛋白，其N(xiāo)端含有一個(gè)長(zhǎng)蛋白結(jié)構(gòu)域，是其募集到自噬小體所必需的，但不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，其C端由一個(gè)SNARE結(jié)構(gòu)域和一個(gè)脂化位點(diǎn)組成，膜靶向依賴(lài)于C端脂化位點(diǎn)[19]。

Takáts S等[20]在果蠅及體外的研究中發(fā)現(xiàn)YKT6作為R-SNARE蛋白可以與含有Qbc-SNARE基序的SNAP29及含有Qa-SNARE蛋基序的STX17結(jié)合形成三元復(fù)合體。但囊泡相關(guān)膜蛋白7(vesicle associated membrane protein 7，VAMP7)(作用同哺乳動(dòng)物體內(nèi)VAMP8)可取代它與SNAP29和STX17形成更緊密的四股螺旋束。且發(fā)現(xiàn)YKT6的過(guò)表達(dá)不能挽救VAMP7沉默所導(dǎo)致的自噬缺陷，但VAMP7的過(guò)表達(dá)可以修復(fù)YKT6沉默所造成的缺陷。因此猜測(cè)，YKT6作用于STX17上游，在形成STX17-SNAP29-VAMP7復(fù)合體方面具有非規(guī)范的調(diào)節(jié)作用。

Matsui T等[19]在HeLa細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)STX17基因敲除后自噬溶酶體形成有一定程度的保留，YKT6基因的敲除抑制了部分自噬溶酶體形成，但STX17基因和YKT6基因同時(shí)敲除會(huì)完全抑制自噬溶酶體形成。且YKT6基因敲除后自噬溶酶體形成的缺失不能通過(guò)STX17的過(guò)表達(dá)來(lái)恢復(fù)，STX17和YKT6的缺失對(duì)自噬溶酶體形成有相加的抑制作用，這表明YKT6和STX17是獨(dú)立發(fā)揮作用的。

在HeLa細(xì)胞中的研究表明，YKT6作為一種R-SNARE蛋白可以與含有Qbc-SNARE基序的SNAP29結(jié)合，并與多個(gè)Qa-SNARE蛋白結(jié)合形成足夠穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，溶酶體定位的STX7是HeLa細(xì)胞中的Qa-SNARE蛋白[19,21]。在STX17基因敲除的HeLa細(xì)胞中抑制STX7的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步抑制自噬溶酶體形成。在STX17基因敲除細(xì)胞中，STX7與SNAP29和YKT6相互作用，在YKT6基因敲除細(xì)胞中，STX17與SNAP29和VAMP8相互作用。它們對(duì)自噬小體的募集并不是相互依賴(lài)的，它們可以獨(dú)立地招募到自噬體內(nèi)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，這兩個(gè)復(fù)合體完全獨(dú)立起作用[19]。

在研究自噬小體和溶酶體樣空泡融合的體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了YKT6體外融合的機(jī)制。與STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合體形成類(lèi)似，Atg14-Vps34復(fù)合體產(chǎn)生PI3P樣自噬小體，招募GTP形式的RAB7樣Ypt7，Ypt7招募HOPS復(fù)合物進(jìn)而招募SNARE蛋白進(jìn)行融合，而Ypt7也需要Mon1-Ccz1復(fù)合物的激活[22]。YKT6會(huì)被自噬相關(guān)基因1(autophagy-related 1，ATG1)激酶直接磷酸化，使其SNARE區(qū)域處于非活性狀態(tài)，無(wú)法進(jìn)行SNARE復(fù)合體的組裝，而去磷酸化的YKT6才具有結(jié)合活性[23-24]。

3 自噬溶酶體與宮頸癌變關(guān)系

HR-HPV抑制自噬溶酶體形成與宮頸癌變密切相關(guān)。Mattoscio D等[25]的研究指出HR-HPV具有將病毒基因組整合到宿主DNA中的能力，從而使病毒癌蛋白E6/E7過(guò)度表達(dá)。E6通過(guò)對(duì)p53的作用選擇性地抑制自噬溶酶體的形成，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中促進(jìn)了自噬途徑的損傷。他們的研究還表明HPV16 E6/E7在原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)使細(xì)胞中自噬溶酶體的形成減少，而自噬小體聚集[25]。Zhang J等[26]的研究表明自噬在HR-HPV感染時(shí)被抑制，以避免消化HR-HPV，并在隨后的過(guò)程中促進(jìn)受感染細(xì)胞的增殖和癌變，HR-HPV通過(guò)多種途徑抑制自噬溶酶體形成，從而抑制自噬。因此，恢復(fù)自噬過(guò)程在治療宮頸癌變中是非常重要的。提示HR-HPV E6/E7可通過(guò)抑制自噬溶酶體的形成來(lái)抑制自噬，而自噬受到抑制使宮頸細(xì)胞清除HR-HPV的能力減弱，造成HR-HPV持續(xù)感染，從而促進(jìn)宮頸癌變。

增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞自噬溶酶體的形成會(huì)影響其活性。Li Z等[27]的研究表明雷地黃素A通過(guò)抑制HPV18 E6/E7可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制HeLa細(xì)胞增殖，提示抑制HR-HPV E6/E7可以導(dǎo)致自噬溶酶體的形成增多誘導(dǎo)自噬，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。Xie X等[28]的研究證實(shí)通過(guò)增強(qiáng)自噬溶酶體形成可顯著下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中HPV E6和E7蛋白的表達(dá)水平，并有效抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zhang F等[29]的研究顯示加入苦參堿后，HeLa和SiHA細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的自噬溶酶體，且細(xì)胞增殖受到影響，進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)增強(qiáng)自噬溶酶體形成可影響宮頸癌細(xì)胞增殖。

通過(guò)控制自噬溶酶體形成調(diào)控物質(zhì)可控制宮頸癌變。研究表明RAB7的表達(dá)增加會(huì)抑制細(xì)胞感染HR-HPV的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而控制宮頸癌變的可能性[30]，提示通過(guò)改變自噬溶酶體形成的調(diào)控機(jī)制來(lái)調(diào)控自噬溶酶體形成，從而進(jìn)一步控制HR-HPV的感染及宮頸癌變。

4 結(jié)語(yǔ)

目前自噬溶酶體形成在宮頸癌變中的作用已成為研究熱點(diǎn)，研究影響該步驟的兩個(gè)自噬特異性SNARE復(fù)合體的具體機(jī)制有望為宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供更多依據(jù)。研究這兩個(gè)SNARE復(fù)合體與HR-HPV及宮頸癌變之間的關(guān)系有望為宮頸癌前病變及宮頸癌提供相關(guān)治療措施。但是目前鮮有此類(lèi)研究，這也為今后提供了新的研究方向。