何一龍，劉曉艷*，白衛(wèi)東，錢敏，黃漢聰

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510225)2(現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣東 廣州，510225) 3(廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣東 廣州，510300)

生物胺(biogenic amines，BAs)是一類低分子質量含氮有機堿，由動植物及微生物產(chǎn)生，并且在自然界中普遍存在[1]。目前被發(fā)現(xiàn)的BAs共有3大類，主要有脂肪族的腐胺(putrescine，Put)、尸胺(cadaverine，Cad)、精胺(spermine，Spe)和亞精胺(spermidine，Spd)，芳香族的酪胺(tyramine，Tyr)和β-苯乙胺(β-Phenethylamine，β-Phe)，雜環(huán)族的組胺(histamine，His)和色胺[2](tryptamine，Try)，以及近些年在章魚唾液中被發(fā)現(xiàn)的章魚胺[3]。BAs本身在機體中發(fā)揮多種生理功能，是正常的活性物質，并在生命活動中起著重要作用[4]。然而，身體對BAs具有一定的耐受力，當含量過高身體就會出現(xiàn)偏頭痛、胃部痙攣、嘔吐、腹瀉、過敏等中毒癥狀[5]。食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)指出食物中His含量超過500 mg/kg就會對人體健康構成威脅，含量達到800 mg/kg的Tyr是有毒的，食物中總胺含量不應超過1 000 mg/kg[6]。BAs的形成主要與氨基酸的脫羧反應和醛的胺化反應有關[7]。食品發(fā)酵過程中微生物代謝的氨基酸脫羧酶作用于多種氨基酸，使其脫去羧基形成BAs，這是發(fā)酵食品中BAs的主要來源。因此，氨基酸、微生物以及氨基酸脫羧酶成為BAs產(chǎn)生的必備條件[8]。

調查發(fā)現(xiàn)，醬油、蝦醬和干腌魚等發(fā)酵食品中BAs水平較高[9]。醬油是以大豆、小麥、面粉或麥麩為原輔料，通過微生物發(fā)酵得到的液態(tài)調味品，氨基酸較豐富[10]。豐富的氨基酸為醬油提供獨特鮮味的同時也為BAs的形成提供可能。再加上醬油發(fā)酵體系復雜，微生物種類繁多，不同微生物間的相互作用、代謝途徑尚不完全明確，不能確切說明哪些參與了醬油發(fā)酵的微生物具有氨基酸脫羧酶分泌能力[11]。醬油中常見的BAs有8種：Try、β-Phe、Put、Cad、His、Tyr、Spd和Spe[12]，這使得醬油具有一定的健康風險，隨著人們對健康生活的要求不斷提高，醬油的食用安全性也得到了越來越多的關注。醬油在世界上占有重要地位并在我國市場上需求量大[13]，因此，為消費者提供安全可靠的可食用醬油意義重大。本文以華南地區(qū)生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)醬油為主要研究目標，研究了高鹽稀態(tài)醬油中8種常見的BAs，并分析了相同品牌的不同等級間、相同等級的不同品牌間醬油中BAs組分的差異。為華南地區(qū)醬油的食用安全提供依據(jù)，為醬油工業(yè)中BAs調控技術的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料部分購于廣州市區(qū)各大小超市，部分取樣于廣州市如豐果子調味食品有限公司。

丹磺酰氯(純度>99%)、BAs標準品、內標物(1,7-二氨基庚烷)，Simga公司；乙腈、甲醇(色譜純)，邁瑞達公司；乙酸銨(色譜純)，麥克林公司；谷氨酸鈉，美國MYM公司；碳酸氫鈉，天津百世化工有限公司；氫氧化鈉，廣東銘固化學科技有限公司；37%鹽酸、硫酸銨，天津福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

LC-20A型高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)，日本島津公司；MD200型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 BAs的測定

采用丹磺酰氯柱前衍生法，ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱分離，高效液相色譜-紫外檢測器檢測，內標法定量。

1.3.1.1 溶液的配制

根據(jù)HAO等[14]的方法稍有改進，BAs標準混合使用液及標準系列溶液的配制：準確稱取各BAs標品適量，于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，使質量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。內標標準儲備溶液及標準使用液的配制：準確稱取內標標準品適量，用0.1 mol/L鹽酸配制成內標使用液(100 mg/L)，臨用現(xiàn)配。

丹磺酰氯衍生劑溶液：取適量丹磺酰氯，以丙酮為溶劑配制質量濃度為10 mg/mL的衍生劑使用液，置4 ℃冰箱，避光貯存。

1.3.1.2 樣品及標準品的衍生

準確量取1.0 mL樣品于15 mL離心管中，先后加入100 mg/L內標溶液250 μL、飽和碳酸氫鈉溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL、衍生試劑1 mL，渦旋振蕩1 min后置于60 ℃恒溫水浴鍋中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，混勻，再置于60 ℃恒溫反應15 min，取出冷卻至室溫，加入1 mL超純水，渦旋振蕩1 min，40 ℃氮氣去丙酮(約1 mL)，加入0.5 g氯化鈉，渦旋振蕩至完全溶解，再加入5 mL乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層，轉移上層乙醚于15 mL離心管中，下層再次萃取，合并2次乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，待測。相同方法衍生標準品溶液。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，紫外檢測波長：254 nm，進樣量：20 μL，流動相A：90%乙腈/10%(含0.1%乙酸)0.01 moL/L乙酸銨溶液，流動相B：10%乙腈/90%(含0.1%乙酸)0.01 moL/L乙酸銨溶液，流速：1.0 mL/min。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表 單位:%

1.3.1.4 標準樣品圖譜

標準品衍生物圖譜如圖1所示，在上述梯度洗脫條件下，8種BAs衍生物分離效果佳，峰形較好。按出峰時間先后順序各峰分別為Try、β-Phe、Put、Cad、1,7-二氨基庚烷、His、Tyr、Spd和Spe的衍生物。

圖1 BAs衍生物標準色譜圖Fig.1 Standard chromatography of BAs derivatives

1.3.2 氨基酸態(tài)氮及總酸的測定

根據(jù)GB 5009.235—2016比色法測定樣品中氨基酸態(tài)氮質量濃度；根據(jù)GB/T 12456—2008滴定法測定樣品中總酸。

根據(jù)GB 18186—2000將被測醬油按照氨基酸態(tài)氮質含量為3個級別：Low(<0.4 g/100mL)、Moderate(0.4～0.8 g/100mL)、High(>0.8 g/100mL)，分別表示普通、一級、特級。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Spss Statistics17.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Simca 14.1和TBtools軟件繪圖，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示(n=3)。

2 結果與分析

2.1 廣州市售醬油中BAs分布情況

本次調查包含有華南地區(qū)市售的6個不同品牌3個級別2種類型的醬油，醬油間各具特色，不同種醬油的生產(chǎn)工藝、環(huán)境和原料都存在一定差異，即使同一品牌的不同等級醬油都具有較為明顯的差異。氨基酸態(tài)氮和總酸是衡量醬油品質的重要指標，結果如附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210705009)和表2所示。

結果表明，被調查樣品氨基酸態(tài)氮含量在0.25～1.13 g/100mL，平均值和中位數(shù)分別為0.583、0.51 g/100mL；取樣包含不同品牌的特級、一級、二級和三級醬油。根據(jù)氨基酸態(tài)氮含量范圍可看出本次市售醬油取樣具有代表?？偹嵩?4.774～73.311 mg/L，平均值和中位數(shù)分別為36.769、36.655 mg/L。

對30個醬油樣品中BAs的檢測發(fā)現(xiàn)，總胺大部分在10～500 mg/L，其含量超過1 000 mg/L的有3個，占10%，500～1 000 mg/L的有4個，占13.33%，低于10 mg/L的有3個，占10%。研究人員指出食物中總胺含量范圍不應超過1 000 mg/kg。這說明我國市面上醬油中BAs含量大多數(shù)是在安全范圍的，但安全問題也不容忽視。

每個醬油樣品中均有至少5種BAs檢出，并且其含量在被測樣品中具有較大差異。對數(shù)據(jù)進行簡單統(tǒng)計，如表2所示，30個樣品中檢出His、Spd的均有26個樣品，各占86.7%；Spe有25個，占83.3%；Put和Cad檢出數(shù)各為29，占96.667%；Try、β-Phe和Tyr均有檢出；其中8種BAs的總含量平均值為333.681 mg/L，范圍在17.440～1156.243 mg/L；可以看出β-Phe、Put、Cad、Tyr、Spd和Spe是市售醬油中主要的BAs。

His和Tyr被認為是對人體毒性最強的BAs，LINARES等[15]經(jīng)過體外細胞毒性試驗(HT29腸道細胞)發(fā)現(xiàn)，Tyr比His對細胞的毒害作用更強更快，Tyr引起細胞壞死，His誘導細胞凋亡。特別的，His通常與其他BAs(如Cad、β-Phe和Tyr等)同時出現(xiàn)，并使其毒性增強[16]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，食物中His含量超過500 mg/kg就會對人體健康構成威脅，食物中含量達到800 mg/kg的Tyr是有毒的。表3可以看出，30個被測樣品中His含量絕大部分低于10 mg/L，在安全范圍內；Tyr主要分布在0～500 mg/L，其中低于10 mg/L的有15個占50%，在10～40、40～500 mg/L的分別有9和6個，占30%和20%；雖然Tyr的含量在安全范圍內，但醬油中Tyr的含量總體相對較高，需要引起重視。

表2 BAs、氨基酸態(tài)氮及總酸的含量分布Table 2 Distribution of content of BAs, amino acid nitrogen and total acids

表3 His、Tyr和總胺在樣品中的含量分布(n=30)Table 3 Distribution of histamine, tyramine and total BAs contents in the soy sauces (n=30)

2.2 不同品牌醬油樣品中BAs含量分析

對30個被測樣品進行整理統(tǒng)計并繪制成熱點圖，如圖2所示。熱點圖可更加直觀的展現(xiàn)出樣品間含量的差別，顏色越深點越大表示含量越高(冷色到暖色分別為0～12)。

圖2 醬油中BAs含量熱點圖Fig.2 Heatmap of BAs content in soy sauces 注：H、Z、L、C、W和R分別表示不同品牌，T、Y、E和S分別表示特級、 一級、二級和三級，括號里數(shù)字表示同一品牌、等級的不同醬油樣品由圖2可以看出，不同品牌醬油中的8種BAs之間差異明顯。熱點圖中總胺顏色越紅的樣品中，各個BAs組分的含量都相對較高，且其中BAs的組成和含量均不相同。

BAs的產(chǎn)生要具備3個條件：游離氨基酸、能夠產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物以及適合微生物代謝產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的條件。影響發(fā)酵醬油中BAs含量的主要因素有微生物的數(shù)量種類、醬醪的pH、發(fā)酵溫度、含鹽量和原料[17]，可能不同品牌醬油的發(fā)酵工藝、環(huán)境、微生物種類和數(shù)量都存在一定差異，導致不同品牌醬油間各BAs含量存在較大差異[18]?？偘泛吭赪ES、WTS2和WYS中最高，總胺含量均超過1 000 mg/L，3個 樣品均來自于W牌，W牌醬油發(fā)酵工藝有待改進。

2.3 醬油樣品中BAs組分差異性分析

為了分析醬油中8種BAs之間的差異，利用正交偏較小二乘法(orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA)得到被測高鹽稀態(tài)醬油中BAs的S-plot載荷圖和差異變量(variable importance，VIP)得分圖(圖3～圖6)。其中，S-plot圖在中軸線附近的為相近組分，而遠離原點的為差異組分。

a-W牌中普通和一級醬油BAs的S-plot圖；b-W牌中普通和一級醬油BAs的VIP分布圖；c-W牌中普通和特級醬油中BAs的S-plot圖； d-W牌中普通和特級醬油BAs的VIP分布圖圖3 基于OPLS-DA分析W牌中普通和一級、普通和特級醬油BAs的S-plot圖和VIP分布圖Fig.3 Analyzes the S-plot and VIP distribution of BAs in low and moderate, low and high soy sauces of W brand based on OPLS-DA

以W牌為例，如圖3-a～圖3-c、圖4-a所示，W牌的普通和一級醬油中差異性BAs為：Put、β-Phe、Tyr和Spe；普通和特級醬油中差異性BAs為：Spd、Put、β-Phe和Spe；特級和一級醬油中差異性BAs為：Spd、Tyr、Put和Try。圖3-b～圖3-d、圖4-b顯示這些組分的VIP>1(P<0.05)，可以得知同一品牌的不同等級醬油中BAs組分有顯著性差異，說明不同等級對醬油中BAs有顯著影響。

a-W牌中特級和一級醬油BAs的S-plot圖； b-W牌中特級和一級醬油BAs的VIP分布圖圖4 基于OPLS-DA分析W牌中特級和一級醬油BAs的 S-plot圖和VIP分布圖Fig.4 Analyzes the S-plot and VIP distribution of BAs high and moderate soy sauces in W brand based on OPLS-DA

圖5和圖6中，展示了相同等級下的不同品牌醬油中BAs的差異組分。如圖5-a、圖5-c，H和Z牌的普通醬油中差異BAs為β-Phe、Cad，L和Z牌的普通醬油中差異性BAs為Cad、Put、Spd和Spe；圖6-a、圖6-c所示，L和Z牌的一級醬油中差異性BAs為Cad、Spd、Put和Spe，H和R牌的特級醬油中差異性BAs為Try、Spe、Tyr、Cad和β-Phe。圖5-b～圖5-d和圖6-b、圖6-d顯示這些差異組分的VIP>1(P<0.05)，可以得知相同等級下的不同品牌醬油間的BAs組分有顯著性差異，說明不同品牌對醬油中的BAs有顯著影響。

綜上所述，同品牌不同等級的醬油中BAs的顯著差異組分為Put、β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr，而同等級不同品牌的醬油中BAs的顯著差異組分為β-Phe、Cad、Spe、Spd、Try和Tyr?？煽闯靓?Phe、Try、Spe、Spd和Tyr是不同等級和品牌醬油的共同差異組分。因此，β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr對不同等級和品牌醬油中BAs的組成具有重要影響。

a-普通醬油H和Z牌中BAs的S-plot圖；b-普通醬油H和Z牌中BAs的VIP分布圖；c-普通醬油L和Z牌中BAs的S-plot圖； d-普通醬油L和Z牌中BAs的VIP分布圖圖5 基于OPLS-DA分析普通醬油H和Z牌、L和Z牌中BAs的S-plot圖和VIP分布圖Fig.5 Analyzes the S-plot and VIP distribution of BAs in low soy sauces H and Z, L and Z based on OPLS-DA

a-一級醬油中L和Z牌中BAs的S-plot圖；b-一級醬油中L和Z牌中BAs的VIP分布圖；c-特級醬油中H和R牌中BAs的S-plot圖； d-特級醬油中H和R牌中BAs的VIP分布圖圖6 基于OPLS-DA分析一級醬油中L和Z牌、特級醬油中H和R牌中BAs的S-plot圖和VIP分布圖Fig.6 Analyzes the S-plot and VIP distribution of BAs in Moderate Soy sauces L and Z, High Soy sauces H and R based on OPLS-DA

同一品牌下，醬油的等級往往是由淋油次數(shù)不同造成的，首次淋取為頭抽，營養(yǎng)價值較高，其余依次分級。雖然同一品牌的醬油有等級之分，但是原料、工藝和發(fā)酵環(huán)境卻差別不大或相同，僅是淋取次數(shù)的差異就導致了同品牌醬油中的BAs含量和種類出現(xiàn)較大的差異，一定程度上，再次說明了影響B(tài)As在醬油中富集的因素較多，形成機理復雜，值得深入研究。

3 結論

本次研究包含產(chǎn)自于華南地區(qū)的6個不同品牌的高鹽稀態(tài)醬油，結果表明：

(1)30份醬油樣品中β-Phe、Put、Cad、Tyr、Spd和Spe是市售醬油中主要的BAs。總胺大部分在10～500 mg/L，其含量超過1 000 mg/L的有3個，占10%，500～1 000 mg/L的有4個，占13.33%，低于10 mg/L的有3個，占10%。含量超過1 000 mg/L的占10%，說明我國市面上醬油中BAs含量大多數(shù)是在安全范圍的，但安全問題也不容忽視。

(2)同一品牌的不同等級醬油中BAs組分有顯著性差異，相同等級的不同品牌醬油中BAs組分也有顯著差異，說明品牌和等級對BAs在市售醬油中的富集具有顯著影響。β-Phe、Try、Spe、Spd和Tyr是不同等級和品牌醬油的共同差異組分，對不同等級和品牌醬油中BAs的組成具有重要影響。