許雙雙，安玉蘭，溫夢梅，胡克玲，楊 詠，甘德芳

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 太湖縣江塘鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，安徽 太湖 246417)

MADS-box家族基因是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育，如種子萌發(fā)[1]、芽休眠[2-3]、根營養(yǎng)吸收[4]、葉片分化[5]、花器官發(fā)育[6-7]、果實(shí)成熟與開裂[8-9]和逆境脅迫響應(yīng)[10-12]等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前有關(guān)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在花器官及果實(shí)的發(fā)育調(diào)控方面。如擬南芥AtAGL6具有雙重作用，通過負(fù)向調(diào)控開花位點(diǎn)FLC及正向調(diào)控花啟動(dòng)子FT來控制開花時(shí)間[13]；荷花NnMADS6主要在花芽組織中表達(dá)，參與花萼、花瓣及心皮的發(fā)育[14]；Boss等[15]從葡萄中得到4個(gè)MADS-box基因，發(fā)現(xiàn)VvMADS3在葡萄花和種子發(fā)育中起作用，VvMADS4參與花器官及果實(shí)的發(fā)育過程，VvMADS5則可能影響胚珠發(fā)育；研究還發(fā)現(xiàn)，突變SlMADS-RIN會(huì)使番茄果實(shí)無法成熟且外源乙烯也不能誘導(dǎo)果實(shí)成熟；同樣，沉默基因FaMADS9-RIN后草莓果實(shí)也不能成熟，說明 MADS-box家族基因是調(diào)控果實(shí)成熟的上游基因，其功能在物種間相對(duì)保守[16-17]。

AP1-FUL類基因?qū)儆贛ADS-box亞家族基因，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。擬南芥FRUITFULL(FUL)基因?qū)儆贏PETALA1(AP1)/SQUA基因亞家族，在調(diào)控開花時(shí)間、維持花序分生組織特異性、控制心皮及角果發(fā)育、調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞組織和維管束的分化等過程中都有重要作用；玉米ZMM4、ZMM15屬于FUL1亞家族，具有誘導(dǎo)玉米開花、促進(jìn)花序發(fā)育的作用[18]；金魚草中FUL同源基因DEFH28能夠調(diào)控心皮壁細(xì)胞分裂及果實(shí)成熟[19]；異源表達(dá)桃樹FUL同源基因PpMADS6能促進(jìn)提早開花，減少分枝，控制角果裂合處細(xì)胞木質(zhì)化，影響果莢的開裂[20]。黃瓜(CucumissativusL.)是葫蘆科1年生攀援性草本植物，是我國夏季主要的蔬菜作物之一。Hu等[21]從黃瓜中鑒定出43個(gè)MADS-box家族基因，將其劃分為AG、SEP、AP1-FUL、FLC等9個(gè)亞家族。目前對(duì)黃瓜FUL基因的研究多集中在其果實(shí)發(fā)育調(diào)控作用方面。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsFUL1基因在控制細(xì)胞分裂及擴(kuò)張的同時(shí)，可以抑制生長素運(yùn)輸基因的表達(dá)，進(jìn)而減少生長素積累，從而有效調(diào)節(jié)黃瓜果實(shí)的長度；蔣勵(lì)[23]證實(shí)了CsFUL1與其他轉(zhuǎn)錄因子可共同調(diào)控黃瓜果實(shí)長度的發(fā)育。本課題組前期在黃瓜中獲得3個(gè)AP1-FUL類MADS-box家族基因(CsMADS08、CsMADS10和CsMADS21)，與葡萄VvFUL基因和擬南芥AtAGL8基因高度同源。Calonje等[24]發(fā)現(xiàn)，VvFUL能促進(jìn)葡萄卷須的分化和發(fā)育；而擬南芥AtAGL8基因主要調(diào)控心皮的發(fā)育及分裂組織的分化[25]。表達(dá)模式分析顯示，CsMADS08在黃瓜不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中均有表達(dá)，且在莖和葉中表達(dá)量較高[26-27]，但CsMADS08是否具有VvFUL和AtAGL8類似的功能還有待驗(yàn)證。鑒于此，本研究以擬南芥agl8突變體為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在突變體中導(dǎo)入CsMADS08基因，檢測轉(zhuǎn)基因后代擬南芥的表型變化，并分析CsMADS08及下游調(diào)控基因的組織表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步探討黃瓜CsMADS08基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADS08由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜菜育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥agl8突變體種子購自ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)。Trizol試劑購自Takara公司，植物基因組DNA提取試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。利福平(Rif)、卡那霉素(Kan)購自BBI生命科學(xué)有限公司，潮霉素(Hyg)購自北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司，乙酰丁香酮(AS)購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 擬南芥agl8純合突變體的驗(yàn)證 擬南芥agl8突變體是由DsE轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子捕獲元件插入到AGL8轉(zhuǎn)錄核苷酸序列5′UTR的46和47位堿基所致[25]，使用三引物法[28]驗(yàn)證突變體的純合性，引物序列見表1。提取擬南芥agl8突變體植株葉片基因組DNA，利用三引物(AGL8-1、AGL8-2和Ds3-2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (10 μmol/L) 1 μL，AGL8-1 (10 μmol/L) 1 μL，AGL8-2 (10 μmol/L) 1 μL，Ds3-2 (10 μmol/L) 1 μL，模板DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min；50 ℃ 退火45 s；72 ℃ 延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；10 ℃停止，4 ℃保存。由于野生型擬南芥染色體無DsE轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子捕獲元件插入，所以PCR擴(kuò)增只有1條長度約500 bp的片段(AGL8-1到AGL8-2之間片段長496 bp)；而雜合突變體擬南芥的1條染色體上有DsE轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子捕獲元件插入，PCR擴(kuò)增應(yīng)該得到2條片段(AGL8-1到AGL8-2以及Ds3-2到AGL8-1或AGL8-2)；純合突變體擬南芥由于2條染色體上均插入了DsE轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子捕獲元件，較長的DsE轉(zhuǎn)座增強(qiáng)子捕獲元件會(huì)阻礙目的基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以PCR擴(kuò)增只能得到1條片段(Ds3-2到AGL8-1或AGL8-2)。

表1 擴(kuò)增目的基因的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for amplification of target genes

1.2.2 擬南芥種子的消毒及處理 取適量擬南芥agl8突變體種子放入1.5 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)12%的次氯酸鈉溶液，上下顛倒清洗種子8 min，用槍頭吸除溶液。然后向離心管中加入1 mL無菌水，上下顛倒清洗1 min并吸除溶液，重復(fù)清洗3次。用剪去尖嘴的小槍頭吸取洗凈的種子，鋪于1/2 MS培養(yǎng)基上，封口膜密封后置于4 ℃冰箱春化處理。3 d后取出置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度4 000 lx，溫度22 ℃。待植株長出6～8片葉時(shí)，選取生長一致的幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，基質(zhì)中黑土與蛭石質(zhì)量比為2∶5，蓋上保鮮膜，緩苗3 d后揭膜，常規(guī)管理。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 在純合擬南芥agl8突變體植株開花時(shí)進(jìn)行侵染。取1 mL含重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADS08(含35S啟動(dòng)子)的農(nóng)桿菌菌液，加入50 mL YEP液體培養(yǎng)基，28 ℃下220 r/min培養(yǎng)至OD600為2.0，于4 ℃、 6 000 r/min離心10 min。取菌體加入Buffer緩沖液(100 mL純水中加入0.22 g MS、5 g蔗糖及0.05 g MES，調(diào)pH至5.8，加入30 μL體積分?jǐn)?shù)0.05%的表面活性劑Silwet-77，磁力攪拌30 min)吸打混勻，重懸至OD600為0.8，將擬南芥花序浸入懸浮液中2 min，并用膠頭滴管吸取懸浮液滴到未侵染花上，遮光保濕1 d后正常培養(yǎng)。每隔7 d侵染1次，共侵染3次。種子成熟時(shí)采收，37 ℃烘干，4 ℃保存，此為T0代轉(zhuǎn)CsMADS08基因擬南芥種子。

1.2.4 轉(zhuǎn)CsMADS08基因植株的篩選及表型觀察 取agl8突變體和T0代轉(zhuǎn)CsMADS08基因擬南芥種子，消毒后鋪于含30 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱春化3 d，22 ℃培養(yǎng)。待植株長出6～8片葉時(shí)，將長勢良好的幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，蓋上保鮮膜緩苗3 d。正常培養(yǎng)7 d后提取植株葉片基因組DNA，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因Hyg及目的基因CsMADS08。擴(kuò)增潮霉素基因Hyg反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs (10 μmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min；57.5 ℃ 退火45 s；72 ℃ 延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；10 ℃停止，4 ℃保存。CsMADS08基因與潮霉素基因Hyg的PCR反應(yīng)體系相同，僅將引物改為擴(kuò)增CsMADS08的上、下游引物。PCR反應(yīng)條件也與潮霉素基因Hyg的相同，僅將退火溫度降為55 ℃。以重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADS08為陽性對(duì)照，agl8突變體植株為陰性對(duì)照，經(jīng)檢測呈陽性的植株即為T1代轉(zhuǎn)CsMADS08植株，經(jīng)留種和潮霉素抗性篩選并檢測后分別得到T2、T3代。觀察并統(tǒng)計(jì)野生型植株(9 株)、agl8突變體植株(12株)和T3代轉(zhuǎn)CsMADS08植株(18株)的形態(tài)參數(shù)，包括根長、株高、側(cè)枝數(shù)、葉片特征(形狀、大小和數(shù)目)、抽薹和開花時(shí)間、果莢特性等。采用IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.5 莖生葉石蠟切片的制備及顯微觀察 取T3代轉(zhuǎn)CsMADS08植株、agl8突變體植株及野生型擬南芥植株同一部位的成熟莖生葉，立即投入FAA固定液(福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL、體積分?jǐn)?shù)70%酒精90 mL)中固定。經(jīng)酒精梯度脫水處理后，再進(jìn)行透明處理，然后置于60 ℃恒溫箱中用石蠟包埋，番紅-固綠染色后切片，熒光顯微鏡下觀察切片橫切面并拍照記錄。

1.2.6CsMADS08及其下游調(diào)控基因表達(dá)模式的分析 采用Trizol試劑法提取擬南芥T3代轉(zhuǎn)CsMADS08植株、agl8突變體植株及野生型植株不同組織(根、莖、蓮座葉、莖生葉、花、果實(shí))的總RNA，微量核酸測定儀(ND2000)檢測RNA純度及濃度。參照大連寶生物公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA濃度稀釋10倍后作為模板，以UBQ10(表1)為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析CsMADS08的組織表達(dá)情況。同時(shí)，根據(jù)AGL8的4個(gè)下游調(diào)控基因SHATTERPROOF1(SHP1)、SHATTERPROOF2(SHP2)、ALCATRAZ(ALC)、INDEHISCENT(IND)序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，檢測SHP1、SHP2、ALC、IND在不同組織中的表達(dá)情況。目的基因CsMADS08、內(nèi)參基因UBQ10及下游調(diào)控基因SHP1、SHP2、ALC、IND的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板(原液稀釋10倍) 1.6 μL，RNA-Free Water補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)10 min；95 ℃反應(yīng)15 s；60 ℃反應(yīng)1 min，40次循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)、4個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2―ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥agl8突變體的驗(yàn)證

為驗(yàn)證擬南芥agl8突變體的純合性，提取突變體植株葉片基因組DNA，利用三引物法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以野生型植株為對(duì)照，結(jié)果(圖1)顯示，野生型植株擴(kuò)增出1條長度約500 bp的條帶，其他突變體植株中只擴(kuò)增出1條長度小于500 bp的條帶，說明這些植株均為純合突變體。

2.2 轉(zhuǎn)CsMADS08植株的抗性篩選

取agl8突變體和T0代轉(zhuǎn)CsMADS08擬南芥種子，消毒后平鋪于含30 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，agl8突變體植株在含潮霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長，而轉(zhuǎn)CsMADS08植株在含潮霉素的培養(yǎng)基上可以正常生長，說明CsMADS08基因已整合到突變體擬南芥中并使植株具備潮霉素抗性。提取轉(zhuǎn)CsMADS08植株及agl8突變體植株葉片基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的基因CsMADS08和潮霉素基因Hyg，結(jié)果(圖2)顯示，在轉(zhuǎn)CsMADS08的抗性植株中分別得到相應(yīng)的擴(kuò)增條帶。

2.3 CsMADS08基因的表型調(diào)控功能

將擬南芥agl8突變體植株、轉(zhuǎn)CsMADS08植株及野生型植株同時(shí)移栽至相同基質(zhì)中，定期觀察其生長狀況,結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，同一時(shí)期不同類型植株根長差異不明顯；轉(zhuǎn)基因植株、突變體植株、野生型植株從播種到抽薹分別歷時(shí)13，19，17 d；從播種到第1朵花開放分別歷時(shí)20，24，21 d。說明CsMADS08基因具有促抽薹和開花的作用。觀察成花時(shí)不同類型植株的葉片變化情況發(fā)現(xiàn)，蓮座葉的數(shù)目及形狀無明顯差異，莖生葉大小表現(xiàn)為野生型植株>agl8突變體植株>轉(zhuǎn)CsMADS08植株，其中agl8突變體植株只有基部2片莖生葉較大，且部分葉片輕微卷曲；莖生葉葉片數(shù)量表現(xiàn)為轉(zhuǎn)CsMADS08植株>agl8突變體植株>野生型植株。從葉片形狀看，野生型植株葉片細(xì)長，agl8突變體植株葉片較寬且呈橢圓形，轉(zhuǎn)CsMADS08植株葉片接近圓形。說明CsMADS08基因?qū)ηo生葉的形態(tài)特征具有調(diào)控作用，促使轉(zhuǎn)化株葉片增多、變小。觀察嫩果莢及成熟果莢的生長狀況發(fā)現(xiàn)，agl8突變體植株果莢變短，種子未成熟時(shí)果莢便開裂，成熟后果莢較瘦癟；轉(zhuǎn)入CsMADS08基因后，果莢長度及飽滿度均有一定恢復(fù)，但仍不及野生型植株，且果莢未成熟時(shí)無提前開裂現(xiàn)象。說明CsMADS08基因能部分恢復(fù)突變體的表型，對(duì)果莢長度、果莢飽滿度及果莢開裂等性狀有調(diào)控作用。

由表2可見，agl8突變體植株最高，轉(zhuǎn)CsMADS08植株次之，野生型植株最低，但三者之間差異不顯著；與野生型植株相比，agl8突變體植株及轉(zhuǎn)CsMADS08植株的側(cè)枝數(shù)和莖生葉數(shù)均顯著增加，說明CsMADS08基因能夠促進(jìn)側(cè)枝發(fā)育，增加莖生葉數(shù)。

表2 不同類型擬南芥植株株高、側(cè)枝數(shù)及莖生葉數(shù)比較Table 2 Comparison of plant height as well as numbers of branches and stem leaves of different Arabidopsis plants

2.4 不同類型擬南芥植株莖生葉結(jié)構(gòu)的顯微觀察

觀察agl8突變體植株、轉(zhuǎn)CsMADS08植株及野生型植株同一部位成熟莖生葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖4)發(fā)現(xiàn)，相較于野生型植株，agl8突變體植株葉片細(xì)胞變小，維管束細(xì)胞減少，葉片明顯變薄；轉(zhuǎn)入CsMADS08基因后，葉片細(xì)胞變大，排列整齊，維管束細(xì)胞有所增加，葉片厚度恢復(fù)。說明CsMADS08基因是通過調(diào)控葉片細(xì)胞及維管束細(xì)胞的發(fā)育來改變?nèi)~片形態(tài)。

2.5 CsMAD08及其下游調(diào)控基因的表達(dá)特性

采用Trizol法提取野生型植株、agl8突變體植株及轉(zhuǎn)CsMADS08植株根、莖、蓮座葉、莖生葉、花及果實(shí)總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因CsMADS08在植株各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果(圖5)表明，agl8突變體植株各組織中CsMADS08基因表達(dá)量均較低，且與野生型植株差異不顯著，但二者均顯著低于轉(zhuǎn)CsMADS08植株。轉(zhuǎn)CsMADS08植株中，CsMADS08基因在各組織中均有大量表達(dá)，且在莖生葉中表達(dá)量顯著高于其他組織。

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測agl8突變體植株、轉(zhuǎn)CsMADS08植株及野生型植株下游調(diào)控基因SHP1、SHP2、ALC、IND在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果(圖6)表明，與野生型植株相比，agl8突變體植株各組織中SHP1、SHP2、ALC、IND基因表達(dá)總體上均上調(diào)，且以莖生葉表達(dá)量最高。與agl8突變體植株相比，這4個(gè)基因只在轉(zhuǎn)CsMADS08植株花中表達(dá)上調(diào)，尤以IND基因上調(diào)明顯；而在其他組織中均下調(diào)，且以莖生葉和蓮座葉降幅明顯。說明CsMADS08基因?qū)ο掠位蚓哂须p向調(diào)控作用，在花中正調(diào)控SHP1、SHP2、ALC、IND基因的表達(dá)，而在其他組織中則具負(fù)調(diào)控作用，且在莖生葉中作用最明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 黃瓜CsMADS08基因?qū)χ仓晟L發(fā)育的調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥開花過程是由一連串信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及家族基因協(xié)同調(diào)控的，其中FUL參與調(diào)控芽頂端分生組織向花序分生組織的轉(zhuǎn)變，并與AGL20/SOC1在發(fā)育的花序原形成層中共同表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)花器官發(fā)育，從而調(diào)控開花時(shí)間[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，擬南芥agl8突變體植株抽薹及開花時(shí)間延遲，CsMADS08基因在突變體植株花器官中表達(dá)量無顯著變化；而轉(zhuǎn)CsMADS08植株抽薹及開花時(shí)間較突變體植株提早4～6 d，且CsMADS08基因在花器官中表達(dá)量顯著增加。說明CsMADS08基因作為FUL的同源基因，具有促進(jìn)開花的作用，其調(diào)控開花時(shí)間的信號(hào)途徑及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步研究。

MADS-box家族基因能調(diào)控植株葉片的形狀和數(shù)量。如從薄殼山核桃中克隆出的MADS-box基因CiMADS9，異源轉(zhuǎn)化擬南芥后會(huì)使其葉片數(shù)量增多[31]；過表達(dá)太行花TrAP1基因的擬南芥蓮座葉呈黃綠色，邊緣呈鋸齒狀[32]；過表達(dá)黃瓜AGL15亞家族CsMADS26及SEP3同源基因CsMADS02的擬南芥葉片形態(tài)均發(fā)生改變，出現(xiàn)葉片變小、蓮座葉及莖生葉卷曲等表型[2,33]。還有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥開花誘導(dǎo)基因FT的產(chǎn)物可以促進(jìn)FUL基因在葉片中的表達(dá)，而FUL產(chǎn)物的積累會(huì)使葉片細(xì)胞排列緊密，體積變小[25]。本試驗(yàn)中，野生型、agl8突變體及轉(zhuǎn)CsMADS08基因擬南芥植株蓮座葉的數(shù)目及形狀無明顯差異，而莖生葉數(shù)量及形狀均有明顯差異；其中野生型擬南芥葉片細(xì)長，莖生葉大而少；agl8突變體植株莖生葉呈橢圓形，只有基部2片莖生葉較大，葉片較寬且數(shù)量變多，有部分葉片輕微卷曲；轉(zhuǎn)CsMADS08植株葉片小而密集，形狀接近圓形。經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，擬南芥agl8突變體植株葉片細(xì)胞變小，排列松散，維管束細(xì)胞減少，葉片變薄；轉(zhuǎn)CsMADS08植株葉片細(xì)胞變大，排列整齊，維管束細(xì)胞增加，葉片變厚。這與Gu等[25]的研究結(jié)果相似，即轉(zhuǎn)化株中細(xì)胞變大且排列緊密，因此體積明顯變小而無卷曲現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，CsMADS08基因表達(dá)量在莖生葉中最高，推測CsMADS08基因通過影響葉片細(xì)胞及維管束細(xì)胞的發(fā)育來調(diào)控莖生葉的形態(tài)。

目前，研究者已經(jīng)在葡萄、草莓、香蕉等多種植物中發(fā)現(xiàn)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實(shí)成熟，如番茄LeMADS-RIN、與番茄RIN基因高度同源的香蕉MaMADS2、葡萄VvTM6等均參與了果實(shí)成熟的調(diào)控[34]。擬南芥FUL基因既可控制角果的伸長，也會(huì)影響裂片細(xì)胞的發(fā)育[35]。蔣勵(lì)[23]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥CsFUL1可能作為黃瓜果實(shí)長短發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，通過調(diào)控細(xì)胞分裂而影響果實(shí)發(fā)育。本試驗(yàn)中，擬南芥agl8突變體果莢較短，較瘦癟，未成熟時(shí)便開裂；轉(zhuǎn)入CsMADS08基因后，果莢長度及飽滿度有一定恢復(fù)，且未成熟時(shí)無果莢開裂現(xiàn)象。說明CsMADS08基因可能參與了果實(shí)發(fā)育的調(diào)控過程。

目前，有關(guān)黃瓜MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在調(diào)控葉片形態(tài)、花及果實(shí)發(fā)育方面，對(duì)于側(cè)枝發(fā)育的調(diào)控研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CsMADS08基因的擬南芥植株側(cè)枝減少[36]。本研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CsMADS08基因擬南芥?zhèn)戎?shù)最多，其次是agl8突變體植株，野生型植株側(cè)枝數(shù)最少。說明CsMADS08基因可能參與了調(diào)控植株側(cè)枝的發(fā)育，而側(cè)枝多的植株可分化形成更多的莖生葉葉片。側(cè)枝為黃瓜的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，因此研究CsMADS08在黃瓜側(cè)枝發(fā)育中的作用，可為今后黃瓜品種改良研究提供理論依據(jù)。

3.2 CsMADS08下游調(diào)控基因的表達(dá)特性

FUL基因是前人在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)與果莢開裂相關(guān)的基因，SHP1和SHP2是FUL的下游基因，與離層的形成和裂片邊緣木質(zhì)化有關(guān)。ALC和IND是SHP的下游基因，其中ALC控制角果裂片邊緣和胎座連接處離層細(xì)胞的形成，IND控制兩個(gè)裂片之間離層細(xì)胞的分化[37]。野生型擬南芥中FUL基因負(fù)調(diào)控SHP1和SHP2，而SHP正向調(diào)控ALC和IND的表達(dá)，使果莢木質(zhì)化受阻，直至成熟開裂[38]。而當(dāng)FUL基因功能缺失時(shí)，SHP1、SHP2、ALC、IND在裂片邊緣中大量表達(dá)，加速裂片細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致果莢提前開裂。本試驗(yàn)中，擬南芥agl8突變體未成熟時(shí)果莢即開裂，轉(zhuǎn)入CsMADS08基因后恢復(fù)正常。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與野生型植株相比，擬南芥agl8突變體中SHP1、SHP2、ALC、IND均上調(diào)表達(dá)，且在莖生葉中表達(dá)量均最高；轉(zhuǎn)入CsMADS08基因后，SHP1、SHP2、ALC、IND在根、莖、葉及果實(shí)中表達(dá)均下調(diào)，其在莖生葉中下調(diào)最為明顯。說明CsMADS08基因與FUL基因功能一致，能夠負(fù)調(diào)控SHP1、SHP2、ALC、IND在植株中的表達(dá)，抑制果莢木質(zhì)化，使其正常開裂。