張成明， 董保成， 李硯飛， 劉曉玲， 白耀博， 曹 丹， 劉 潔， 李十中

(1.徐州生物工程職業(yè)技術學院， 徐州市生物制藥與廢棄物綜合利用工程中心， 江蘇 徐州 221006； 2.清華大學，核能與新能源技術研究院，中美生物燃料聯(lián)合研究中心， 北京 100084； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護總站， 北京 100125； 4.天津大學 化工學院， 天津 300350； 5.青縣新能源技術推廣中心， 河北 滄州 062650； 6.中國環(huán)境科學研究院， 北京 100012)

隨著大型養(yǎng)殖場的興建與運營，養(yǎng)殖業(yè)在給社會提供了大量產(chǎn)品的同時，也帶來一些環(huán)境污染隱患。其中，養(yǎng)殖糞污已經(jīng)成為人們必須面對的問題。據(jù)統(tǒng)計，全國每年產(chǎn)生畜禽糞污38 億噸。畜禽糞污價值高，但未充分利用。奶牛在我國養(yǎng)殖業(yè)中占有絕對優(yōu)勢，牛糞的合理處理也引起眾多學者的興趣，并取得很多重要成果。目前牛糞的處理方法包括厭氧消化、好氧堆肥、制作墊床、制備生物炭、養(yǎng)殖蚯蚓等[1-2]。各種方式均各有利弊，在特定條件下都有所應用。采用厭氧消化技術對牛糞進行處理，在回收能量的同時，還可以實現(xiàn)對糞污的減量化、無害化，以及高值化利用。厭氧消化結束后的沼液、沼渣通過深加工可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機肥，在獲得良好經(jīng)濟效益的同時也可以獲得良好的生態(tài)效益和社會效益[3]。

牛糞屬于纖維質(zhì)類原料，在其厭氧消化過程中，水解步驟是整個過程的限速步驟。為了提高纖維質(zhì)原料的可生化性，在厭氧消化及纖維素乙醇領域，發(fā)展起了多種有效的原料預處理方式。常見的預處理方式包括物理法、化學法和生物法[4-6]。物理法較常用的為粉碎、汽爆、熱水解、輻射等，化學法常用的為酸處理、堿處理、濕法氧化、離子液體等。常用的生物預處理方法包括真菌處理、菌群、酶處理等[7-11]。在酶處理法中，常用的酶包括纖維素酶、半纖維素酶、植酸酶，以及漆酶等。李秋園[12]以木糖渣為底物，考察了纖維素酶預處理對其沼氣發(fā)酵的影響。結果表明，當纖維素酶添加量為40 FPU·g-1時，試驗組總固形物和揮發(fā)性固形物的利用率分別提高了19.47%和21.85%，產(chǎn)氣量是對照組的2.34倍。王婷婷[13]等將酶(耐高溫α-淀粉酶(13.4 U·g-1)、糖化酶(4.9 U·g-1)和纖維素酶(0.8 FPU·g-1)與酒糟進行混合，然后直接進行干式沼氣發(fā)酵。結果表明，加酶后沼氣產(chǎn)量增加24.7%，底物甲烷得率增加36.8%。

為了減少預處理的設備投資和節(jié)省預處理時間，結合牛糞的結構特點以及厭氧消化過程pH值中性略偏堿性的特性，本文擬采用添加中性纖維素酶來改善牛糞的厭氧消化性能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛糞取自徐州某奶牛養(yǎng)殖場。自然風干后，粉碎后，過20目篩保存。厭氧污泥取自彭城啤酒廠。工業(yè)級中性纖維素酶由某有限公司提供，由真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵制得，主要為內(nèi)切纖維素酶，并含有較低活力的外切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶組分。酶的最適溫度為55℃～80℃，有效溫度25℃～85℃；最適pH值6.0～7.5，有效作用pH值 4.5～9.0。酶活≥5000 FPU·mL-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 厭氧消化條件

采用甲烷潛力分析儀進行實驗(AMPTS II，碧普)，反應瓶體積500 mL，裝液量400 mL，產(chǎn)氣量采用排水集氣法，采用 2 mol·L-1NaOH溶液吸收CO2，獲得的體積為甲烷體積。厭氧系統(tǒng)總固形物(Total solids, TS)為7%，接種物和底物揮發(fā)性固形物(Volatile solids, VS)比為2∶1，發(fā)酵溫度35℃±2℃。根據(jù)前期預實驗設計中性纖維素酶使用量。以牛糞固形物含量為基礎添加，添加量分別為0，50，100，150，200 FPU·g-1TS。加入不同濃度的纖維素酶后，不進行單獨的預處理實驗，直接進行厭氧消化。

1.2.2 檢測方法

TS，VS，氨氮，化學需氧量(Chemical oxygen demand, COD)含量測定見參考文獻[14]。

2 結果與討論

實驗檢測和計算牛糞厭氧消化過程中的甲烷日產(chǎn)氣量、甲烷累積產(chǎn)氣量以及底物甲烷得率來反映牛糞的厭氧消化性能。

2.1 中性纖維素酶對牛糞厭氧消化性能的影響

添加中性纖維素酶后，所有實驗組均出現(xiàn)多個產(chǎn)氣高峰，酶添加量不同，對日產(chǎn)氣規(guī)律影響顯著(見圖1)。對于所有的實驗組，發(fā)酵開始第1天出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰，且明顯高于隨后的日產(chǎn)氣量。這是因為微生物可以快速利用牛糞中的溶出組分以及酶液中部分有機物進行產(chǎn)氣造成的。酶添加量從0 到200 FPU·g-1時，最高日產(chǎn)氣量分別為88.3，127.1，185.6，165.4和208.2 mL。第1高峰過后產(chǎn)氣短暫回落，酶添加量為0，50和100 FPU·g-1試驗組產(chǎn)氣在第4～8天時分別出現(xiàn)第2個產(chǎn)氣高峰，最高產(chǎn)氣量分別為37.4，41.3和43.7 mL。隨后日產(chǎn)氣量不斷減少，至發(fā)酵結束。當酶的添加達到150 FPU·g-1時，第1高峰結束后，從第2天至11天產(chǎn)氣量較低，保持在15～25 mL。隨后產(chǎn)氣量緩慢增加，第2產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第22天，達到45.4 mL。當酶的添加量為200 FPU·g-1時，第1產(chǎn)氣高峰值最高，為208.2 mL。但直到發(fā)酵23 d時，日產(chǎn)氣量均保持在很低的水平。從第24天開始，日產(chǎn)氣量維持在20～25 mL，直到第39天，出現(xiàn)一個產(chǎn)氣相對穩(wěn)定的時期。根據(jù)圖1所示，當中性纖維素酶添加量超過150 FPU·g-1時，在厭氧消化過程中出了一個持續(xù)時間較長的產(chǎn)氣高峰。這與纖維素質(zhì)原料經(jīng)過堿預處理的產(chǎn)氣規(guī)律很類似[5]。數(shù)據(jù)也說明，將中性纖維素酶直接加入到厭氧消化系統(tǒng)中也是可行的。

圖1 不同纖維素酶添加量時牛糞的日甲烷產(chǎn)氣量

如圖2所示，隨著中性纖維素酶使用量的增加，甲烷總產(chǎn)氣量逐漸增加，但是在高濃度添加酶時除了一定的產(chǎn)氣延遲。對照組牛糞累積甲烷產(chǎn)量為773.1 mL，酶使用量從50 FPU·g-1增加到200 FPU·g-1時，累積產(chǎn)氣量分別為770.3，857.6，118.4和1085.6 mL。當酶使用量100 FPU·g-1時，相應實驗組出了較為明顯的產(chǎn)氣延遲。

圖2 不同纖維素酶添加量時牛糞的累積甲烷產(chǎn)氣量

2.2 中性纖維素酶對提高牛糞甲烷得率的影響

根據(jù)甲烷累計產(chǎn)氣量以及實驗中添加的牛糞質(zhì)量(8 g)可以出不同實驗條件下牛糞的甲烷得率(見圖3)。在不考慮發(fā)酵周期的情況下，隨著中性纖維素酶的添加，牛糞的甲烷得率在不斷增加，分別為96.6，96.3，107.2，127.3和135.7 mL·g-1。與對照組相比分別增加0%，11%，32%和40%。數(shù)據(jù)表明，當中性纖維素酶使用量較低時，對底物甲烷得率沒有影響；而隨著中性纖維素酶使用量的增長，酶對底物甲烷得率的促進作用愈發(fā)明顯。這從另外一個角度說，中性纖維素酶的加入可以促進牛糞的降解率。

圖3 中性纖維素酶對底物甲烷得率的影響

為了評估酶使用量對甲烷產(chǎn)量的影響，計算得到甲烷增加量和酶使用量(底物TS質(zhì)量×酶添加濃度)的比值，并以酶添加濃度為橫坐標進行了作圖(見圖4)。

圖4 單位酶對牛糞甲烷產(chǎn)量的貢獻

如圖4所示，隨著酶使用量的增加，單位酶對產(chǎn)氣的貢獻也在增加，但是很快就達到了平衡。當酶添加比例為100 FPU·g-1時，酶對產(chǎn)氣額貢獻為0.11，而當酶添加濃度為150和200 FPU·g-1時，酶的功效值均為0.20。這意味著，即使進一步增加酶的使用量，酶對產(chǎn)氣的貢獻也不會再增加了。這一數(shù)據(jù)有助于在工程實踐中進行經(jīng)濟核算。

2.3 產(chǎn)氣現(xiàn)象的初步分析

本實驗中，厭氧消化體系的固形物濃度較低(7%)，且底物(牛糞)為難降解性物質(zhì)，因此，不會出現(xiàn)有機負荷過高而導致產(chǎn)氣延遲的結果。中性纖維素酶是本實驗唯一引入的外源物質(zhì)，因此，產(chǎn)氣高峰延遲的原因應該是由酶引起的。在絕大多數(shù)情況下，酶就是蛋白質(zhì)，在合適的厭氧消化條件下，蛋白質(zhì)會被分解為氨氮，而氨氮是常見的厭氧消化的抑制物。因此，對發(fā)酵結束后沼液中的氨氮進行了檢測，以評估氨氮的抑制性。此外，對沼液的COD也進行了檢測，以衡量體系中有機物的降解情況。結果如圖5所示。

圖5 不同中性纖維素酶添加時厭氧消化結束后沼液中的氨氮和COD濃度

如圖5所示，隨著酶添加量的增加厭氧消化液中的氨氮濃度也隨之增加了。未添加纖維素酶時，最終體系的氨氮濃度為729 mg·L-1，當酶添加量從5 FPU·g-1增加到20 FPU·g-1時，氨氮濃度從1027 mg·L-1增加到了1835 mg·L-1。通常認為，當氨氮濃度超過1000 mg·L-1時，會對發(fā)酵產(chǎn)生一定的抑制。有研究表明，當氨氮濃度到達1.7～14 g·L-1時，甲烷產(chǎn)量減少50%。需要說明的是，氨氮對厭氧消化的抑制濃度與底物種類、微生物種群對氨氮的適應性、厭氧消化體系的TS濃度，溫度，pH值等因素均有關[15-17]?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，氨氮確實有可能會造成本實驗中的產(chǎn)氣延遲。但這僅僅是一種可能，這一結論需要深入細致的實驗設計來進行證實。氨氮也是目前大規(guī)模沼氣工程面臨的一個現(xiàn)實的技術問題。對于如何實現(xiàn)沼液的高效、低成本脫氨，有很多學者進行了研究[18]。此外，圖1中的日產(chǎn)氣數(shù)據(jù)表明，中性纖維素酶在厭氧消化體系可以在很長時間內(nèi)維持活性，而不是被很快的分解掉。王婷婷[13]等也證實，直接將酶加入到厭氧消化體系中也可以起到促進底物沼氣發(fā)酵的作用。這說明，纖維素酶在厭氧消化體系中是可以長時間發(fā)揮作用的。

牛糞本身的溶解性很差，在厭氧消化結束后，消化液的COD會維持在一個較低的水平。結果表明，隨著酶添加量增加，發(fā)酵結束后消化液的COD也隨之增加了(見圖5)，這有些出乎意料。發(fā)酵結束后，對照組的COD為1.34 g·L-1，當酶添加50 FPU·g-1和100 FPU·g-1時，COD增加不明顯，分別為1.52 g·L-1和1.75 g·L-1。而隨著酶添加量的增加，發(fā)酵液中COD明顯增加，最高達5.69 g·L-1(200 FPU·g-1)。數(shù)據(jù)表明，當酶添加量較高時，系統(tǒng)中的有機物殘留顯著增加了。這里潛在的原因包括： 1)中性纖維素酶本身帶入了一些無法被微生物分解的物質(zhì)； 2)中性纖維素酶作用于牛糞使其分解，進而產(chǎn)生了一些難降解的物質(zhì)。具體的原因需要進一步的實驗來驗證。

3 結論

直接向厭氧消化體系中添加中性纖維素酶可以提高牛糞的甲烷得率，這為纖維素酶的市場開拓提供了一個新的視角。本實驗中酶制劑的使用量是比較高的，這應該是由于厭氧消化體系的含水量過高造成的。在實際應用中應充分考慮厭氧消化改善帶來的收益與酶制劑使用帶來的成本之間的平衡。中性纖維素酶在高劑量添加時會造成產(chǎn)氣高峰的延遲，原因需要進一步分析。在后續(xù)研究中，可以考察固定化技術在該領域的應用以降低酶的成本。