齊 赟 張藝馨 程育宏

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)是很多眼科疾病共同的病理?yè)p傷過(guò)程，如青光眼、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、缺血性視神經(jīng)病變等。RIRI會(huì)造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)損傷，因此，研究RIRI病理?yè)p傷的過(guò)程，探索保護(hù)RGC的藥物，對(duì)于以上疾病的治療具有重要的意義。

藏紅花是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其藥理成分具有神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、心肌保護(hù)、增強(qiáng)記憶的功效[1]。藏紅花素(分子式：C44H64O24)是藏紅花最主要的藥理活性成分[2]，我們前期的研究表明，藏紅花素對(duì)RIRI大鼠的RGC具有保護(hù)作用[3-4]。小鼠較大鼠繁殖快、研究用途多，但藏紅花素對(duì)RIRI小鼠的RGC是否具有保護(hù)作用，目前并不清楚。

NLRP3炎癥小體由3個(gè)部分構(gòu)成，分別是含NOD、LRR和pyrin結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3(NLRP3)、含有CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、Caspase-1,NLRP3炎癥小體的活化可以激活Caspase-1,裂解白細(xì)胞介素1β (IL-1β)，促進(jìn)IL-1β的成熟和釋放[5]。我們前期的研究結(jié)果表明，大鼠RIRI會(huì)活化NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，從而促進(jìn)RGC的凋亡[6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的焦慮及抑郁小鼠大腦的NLRP3炎癥小體。因此，本研究擬探討藏紅花素對(duì)RIRI小鼠RGC是否具有保護(hù)作用，及NLRP3炎癥小體通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性 C57BL/6小鼠(10～12周齡)144只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有操作均在小鼠全身麻醉情況下進(jìn)行，使用100 g·L-1的水合氯醛以5 mL·kg-1的劑量腹腔注射麻醉，均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液(沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司)散瞳，恒溫板設(shè)置為 37 ℃。小鼠隨機(jī)分為 3 組：假手術(shù)組、模型組、藏紅花素治療組。

1.2 主要試劑藏紅花素(#PHL80391-10MG,Sigma-Aldrich，美國(guó)),抗RBPMS抗體(#15187-1-AP，武漢三鷹),抗NLRP3抗體(#91525,11000,Abcam，美國(guó)),抗ASC抗體(#127537,11000,Abcam，美國(guó)),抗Caspase-1抗體 (#108362,11000,Abcam，美國(guó)),抗IL-1β抗體 (#9787,11000,Abcam，美國(guó)),抗β-actin抗體 (#4970,11000,CST，美國(guó))，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(13000，萬(wàn)類(lèi)生物科技)。

1.3 藏紅花素給藥將藏紅花素溶于生理鹽水中配置成5 g·L-1溶液，藏紅花素治療組小鼠于造模前 30 min腹腔內(nèi)注射藏紅花素溶液50 mg·kg-1，假手術(shù)組及模型組小鼠給予腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 動(dòng)物模型建立模型組和藏紅花素治療組小鼠全身麻醉后置于恒溫板上，用膠布固定小鼠的頭部及四肢，右眼滴表面麻醉劑(鹽酸丙美卡因滴眼液)及散瞳劑(復(fù)方托吡卡胺)。將裝有100 mL無(wú)菌生理鹽水的輸液瓶與一次性無(wú)菌胰島素注射器通過(guò)輸液器相連，排盡輸液器內(nèi)的空氣。待瞳孔散大后，手持針頭平行于小鼠身體縱軸沿顳側(cè)角膜緣進(jìn)針。用膠布固定好針頭后，打開(kāi)輸液器水閘，緩慢升高輸液瓶，使其最終距離小鼠的高度為 150 cm，這個(gè)高度所形成的眼壓為 110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。輸液瓶升高后，可以觀察到小鼠虹膜和眼底變蒼白，表明視網(wǎng)膜缺血形成。缺血1 h后，降低輸液瓶高度，拔出針頭，此時(shí)虹膜與眼底血流恢復(fù)，即視網(wǎng)膜再灌注形成。實(shí)驗(yàn)中將濕潤(rùn)的棉花片置于角膜上，防止角膜干燥。拔出針頭后，小鼠角膜涂抹紅霉素軟膏。假手術(shù)組小鼠操作步驟同前，但是不打開(kāi)輸液器水閘，因此該組小鼠的眼壓是正常的。

1.5 視網(wǎng)膜鋪片染色每組隨機(jī)選取6只小鼠于RIRI后14 d水合氯醛麻醉，頸椎脫臼法處死。摘取小鼠眼球后，于40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h后，棄角膜、晶狀體、玻璃體，剝離出完整的視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜繼續(xù)在40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h，之后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗10 min×3次。將視網(wǎng)膜放置于含有5 g·L-1Triton、10 g·L-1二甲基亞砜、10 g·L-1牛血清白蛋白的PBS溶液中4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌后，一抗孵育過(guò)夜(RBPMS,1200)，PBS洗滌后，孵育二抗(CY3,1100)2 h，PBS洗滌后，將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片(按象限剪為四瓣平鋪，分別為鼻上、鼻下、顳上、顳下)，體積分?jǐn)?shù)50%甘油封片，熒光顯微鏡照相。在熒光顯微鏡下(放大 20 倍)，觀察每一個(gè)象限中距離視神經(jīng) 1.5 mm 處的 RGC數(shù)目，記錄四個(gè)象限平均RGC數(shù)。每張圖片中的 RGC分別由兩個(gè)觀察員進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值記錄。

1.6 HE染色RIRI后24 h，各組隨機(jī)選取6只小鼠水合氯醛麻醉，摘取小鼠眼球后，頸椎脫臼法處死。棄角膜、晶狀體、玻璃體后，將視杯置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后切片，切片厚度為4 μm，之后進(jìn)行烤片。石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，沖洗后蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)，伊紅染色5 min，無(wú)水酒精脫水后，于二甲苯中透明數(shù)分鐘，體積分?jǐn)?shù)50%甘油封片，之后于生物顯微鏡(Eclipse Ci-L，日本)下觀察視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度的改變。視網(wǎng)膜內(nèi)層包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層(INL)。

1.7 多重基因定量分析系統(tǒng)檢測(cè)基因表達(dá)于RIRI后0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和15 h，水合氯醛麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)取3只小鼠視網(wǎng)膜組織檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達(dá)。使用多重基因定量分析系統(tǒng)(Affymetrix,Fremont,CA,美國(guó))檢測(cè)靶標(biāo)基因的表達(dá)，裂解后的視網(wǎng)膜組織中的各基因可以被熒光微球捕獲，通過(guò)Luminex100xMAP技術(shù)將熒光信號(hào)放大，之后通過(guò)BioPlex 5.0軟件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,美國(guó))分析。管家基因PPIB做標(biāo)準(zhǔn)化處理。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)于RIRI后6 h和12 h，各組隨機(jī)選取6只小鼠水合氯醛麻醉，頸椎脫臼法處死。摘取小鼠眼球后，棄角膜、晶狀體、玻璃體，剝離出視網(wǎng)膜。提取視網(wǎng)膜蛋白后BCA法蛋白定量。于120 g·L-1SDS-PAGE預(yù)制膠中，每孔加入50 μg蛋白樣品。100 V電泳1 h后轉(zhuǎn)膜。5 g·L-1脫脂奶粉(TBST緩沖液溶解)封閉后，加入一抗(抗NLRP3抗體、抗ASC抗體、抗Caspase-1抗體、抗IL-1β抗體或抗β-actin抗體，稀釋度均為11000)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗3次后加二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育1.5 h，TBST洗3次后Western blot檢測(cè)各蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將膠片掃描，用ImageJ 軟件對(duì)曝光的條帶進(jìn)行灰度分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.9 ELISA檢測(cè)于RIRI后6 h和12 h，每組各隨機(jī)選取6只小鼠水合氯醛麻醉，頸椎脫臼法處死。摘取小鼠眼球后，棄角膜、晶狀體、玻璃體，剝離出視網(wǎng)膜，使用ELISA 法(CUSABIO,武漢)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中的IL-1β的含量。獲取視網(wǎng)膜組織后，溶于200 μL的PBS溶液中，勻漿，2500 r·min-1離心5 min，取上清100 μL，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β的含量，在450 nm處測(cè)光密度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品換算樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對(duì)小鼠RIRI后RGC的保護(hù)作用RIRI后14 d，以假手術(shù)組小鼠RGC密度為參照，模型組小鼠RGC密度為假手術(shù)組的11.2%±5.6%，藏紅花素治療組小鼠RGC的密度為假手術(shù)組的29.7%±8.4%，藏紅花素治療組小鼠較模型組小鼠RGC密度增加約18.5%。模型組小鼠較假手術(shù)組小鼠RGC密度顯著降低(P<0.001)，藏紅花素治療組小鼠較模型組小鼠RGC密度顯著增加(P<0.05)(圖1)。表明藏紅花素對(duì)小鼠RIRI后的RGC具有顯著的保護(hù)作用。

圖1 視網(wǎng)膜鋪片染色顯示各組小鼠視網(wǎng)膜RGC A：假手術(shù)組；B：模型組；C：藏紅花素治療組。

2.2 藏紅花素對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度的影響HE染色結(jié)果顯示，RIRI后24 h，模型組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度為假手術(shù)組的(2.1±0.2)倍(P<0.01)。而藏紅花素治療組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度為假手術(shù)組的(1.1±0.2)倍，較模型組顯著降低(P<0.01)(圖2)。表明使用藏紅花素治療的RIRI小鼠，其視網(wǎng)膜內(nèi)層的水腫明顯減輕。

圖2 HE染色檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：藏紅花素治療組。雙向箭頭示視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度。ONL：外核層。

2.3 藏紅花素對(duì)各因子mRNA表達(dá)的影響模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3以及ASC mRNA表達(dá)在RIRI后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h與RIRI 0 h相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1 mRNA表達(dá)在RIRI后6 h、9 h、12 h與RIRI 0 h相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β mRNA表達(dá)在RIRI后6 h、9 h、12 h、15 h與RIRI 0 h相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3)。藏紅花素治療組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1 mRNA表達(dá)在RIRI后6 h、9 h與RIRI 0 h相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。藏紅花素治療組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β mRNA表達(dá)在RIRI后6 h、9 h、12 h與RIRI 0 h相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖4)。與模型組相比，藏紅花素治療組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1及IL-1β mRNA表達(dá)在RIRI后6 h、9 h、12 h均顯著降低(均為P<0.05)。

圖3 多重基因定量分析系統(tǒng)檢測(cè)模型組小鼠RIRI后不同時(shí)間視網(wǎng)膜組織中各因子mRNA表達(dá) A:NLRP3 mRNA的表達(dá)變化；B:ASC mRNA的表達(dá)變化；C:Caspase-1 mRNA的表達(dá)變化；D:IL-1β mRNA的表達(dá)變化。

圖4 多重基因定量分析系統(tǒng)檢測(cè)藏紅花素治療組小鼠RIRI后不同時(shí)間視網(wǎng)膜組織中各因子mRNA表達(dá)。 A:Caspase-1 mRNA的表達(dá)變化；B:IL-1β mRNA的表達(dá)變化。

2.4 藏紅花素對(duì)各因子蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RIRI后6 h及12 h，模型組、藏紅花素治療組小鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3及ASC蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組無(wú)顯著變化(均為P>0.05)。RIRI后6 h及12 h模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1以及IL-1β蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均顯著升高，而藏紅花素治療組小鼠RIRI 6 h及12 h視網(wǎng)膜組織中Caspase-1以及IL-1β蛋白表達(dá)較模型組均顯著下降(均為P<0.05)(圖5)。表明藏紅花素可以降低RIRI后小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1以及IL-1β蛋白表達(dá)。

2.5 ELISA檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中IL-1β蛋白表達(dá)RIRI后6 h及12 h，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(均為P<0.001)。與模型組相比，藏紅花素治療組小鼠RIRI后6 h以及12 h視網(wǎng)膜組織中IL-1β蛋白表達(dá)均顯著下降(均為P<0.05)(圖6)。進(jìn)一步證實(shí)藏紅花素可以降低RIRI小鼠視網(wǎng)膜中IL-1β蛋白表達(dá)。

圖5 Western blot檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中各因子蛋白表達(dá) A：Western blot電泳圖；B：NLRP3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：ASC蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：Caspase-1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；E：IL-1β蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與假手術(shù)組相比，###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05；與模型組相比，***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

圖6 ELISA檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖 與假手術(shù)組相比，###P<0.001；與模型組相比， ***P<0.001，*P<0.05。

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)可以概括為以下兩點(diǎn)：(1)腹腔注射藏紅花素可以顯著增加RIRI小鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)目、降低RIRI視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度；(2)藏紅花素可以顯著抑制RIRI后小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)水平。

藏紅花是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過(guò)提取其活性成分，發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、心機(jī)保護(hù)、增強(qiáng)記憶的功效。藏紅花素是藏紅花主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其在帕金森果蠅模型、哌醋甲酯引起的神經(jīng)行為和神經(jīng)化學(xué)后遺癥[8]、阿爾茨海默病小鼠[9]中均具有神經(jīng)保護(hù)作用。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素可以增加大鼠視網(wǎng)膜的血流[10]，保護(hù)大鼠光感受器細(xì)胞[11]。我們之前的研究也表明[3]，50 mg·kg-1的藏紅花素對(duì)RIRI的大鼠RGC具有保護(hù)作用。藏紅花素的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用主要集中在大鼠領(lǐng)域。小鼠較大鼠繁殖快、研究用途多，但藏紅花素對(duì)RIRI小鼠的RGC是否具有保護(hù)作用目前并不清楚。本研究結(jié)果表明，50 mg·kg-1的藏紅花素對(duì)RIRI小鼠RGC同樣具有保護(hù)作用，藏紅花素治療組較模型組小鼠RGC密度增加約18.5%，與之前藏紅花素在RIRI大鼠RGC中的作用相似(19%)[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3、ASC mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，而Caspase-1和IL-1β mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著的變化，且在RIRI后6 h達(dá)峰值。這個(gè)結(jié)果非常有趣，因?yàn)镃aspase-1和IL-1β的活化主要依賴(lài)于NLRP3炎癥小體[5]。而本研究結(jié)果表明，RIRI后模型組視網(wǎng)膜組織中Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高，但是NLRP3和ASC的表達(dá)卻沒(méi)有顯著變化。近年來(lái)有研究表明，Caspase-11非經(jīng)典炎癥小體也可以活化Caspase-1以及IL-1β[12]。而本研究中，Caspase-1以及IL-1β的活化是否依賴(lài)于Caspase-11，還需要進(jìn)一步的證實(shí)。我們前期的研究表明，大鼠RIRI會(huì)活化NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)[6]。因此我們推測(cè)，參與小鼠RIRI Caspase-1和IL-1β活化的機(jī)制與大鼠可能并不相同。

本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可以顯著抑制RIRI后小鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)。在Zhang等[7]研究中，藏紅花素可以降低LPS誘導(dǎo)后小鼠海馬內(nèi)升高的Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白，這與本研究結(jié)果一致。IL-1β是參與RIRI非常重要的炎癥因子， Caspase-1是激活I(lǐng)L-1β的上游因子[13]。RIRI后3～12 h，視網(wǎng)膜組織中IL-1β表達(dá)顯著升高，而提前玻璃體內(nèi)注射IL-1β拮抗劑可以降低RIRI損傷所致的RGC的凋亡[9]。因此，在RIRI中，Caspase-1通過(guò)活化IL-1β造成RGC的凋亡。而本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可以顯著抑制RIRI后小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)，且藏紅花素對(duì)小鼠RIRI的RGC具有保護(hù)作用。因此我們推測(cè)，藏紅花素通過(guò)抑制Caspase-1和IL-1β保護(hù)小鼠RIRI后的RGC。

本研究的不足之處：(1)本研究沒(méi)有使用Caspase-1以及IL-1β的激動(dòng)劑進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制；(2)本研究缺少免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Caspase-1以及IL-1β發(fā)揮作用的細(xì)胞部位。但是，本研究從視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)水平闡明了藏紅花素對(duì)小鼠RIRI后RGC的保護(hù)作用，并且初步研究了其發(fā)揮作用相關(guān)的機(jī)制：藏紅花素通過(guò)抑制視網(wǎng)膜組織中Caspase-1和IL-1β的表達(dá)保護(hù)RIRI小鼠RGC。本研究為進(jìn)一步探索藏紅花素的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。