段燦星，曹言勇，董懷玉，夏玉生，李紅，胡清玉，楊知還，王曉鳴

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京 100081；2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，鄭州 450002；3遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽(yáng) 110161；4吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，吉林公主嶺 136100

0 引言

【研究意義】玉米（Zea mays L.）是中國(guó)最主要的糧飼兼用作物，也是重要的工業(yè)原料和能源植物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。2000年以來(lái)，中國(guó)玉米種植面積持續(xù)增長(zhǎng)，2012年達(dá)3 910.9萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量22 955.9萬(wàn)t，占谷物總種植面積和總產(chǎn)量的 40.26%和 40.52%，超越水稻成為中國(guó)第一大糧食作物；2015年播種面積和總產(chǎn)均創(chuàng)歷史新高，分別達(dá)到4 496.8萬(wàn)hm2和26 499.2萬(wàn)t；此后雖有所下降，但2019年播種面積和總產(chǎn)量仍達(dá)4 128.4萬(wàn)hm2和26 077.9萬(wàn)t（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2020/indexch.htm）。因此，玉米的安全生產(chǎn)直接影響中國(guó)糧食安全和延伸產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。隨著全球氣候變暖、栽培耕作方式轉(zhuǎn)變和品種更替，玉米病蟲(chóng)害發(fā)生呈持續(xù)加重趨勢(shì)，已成為制約玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素[1-3]。莖腐病是世界玉米生產(chǎn)中普遍發(fā)生且對(duì)生產(chǎn)具有重大影響的土傳病害，也是中國(guó)玉米生產(chǎn)上具有突出影響的重要病害，是玉米全程機(jī)械化實(shí)施中的重要制約因子。近年來(lái)，莖腐病在中國(guó)玉米不同生態(tài)區(qū)持續(xù)嚴(yán)重發(fā)生，如2013—2015年，東北地區(qū)連續(xù)陰雨導(dǎo)致莖腐病高發(fā)，2014年9月上旬至中旬，黃淮地區(qū)連續(xù)降雨導(dǎo)致莖腐病嚴(yán)重發(fā)生，2016年?yáng)|北、西北地區(qū)莖腐病重度發(fā)生，對(duì)玉米制種影響極大，2017年黃淮地區(qū)莖腐病偏重發(fā)生，2017—2018年?yáng)|北地區(qū)重度發(fā)生（部分?jǐn)?shù)據(jù)未發(fā)表），給中國(guó)玉米生產(chǎn)造成了重大損失，因此，控制莖腐病為害，對(duì)于保障玉米安全生產(chǎn)具有重要意義[3-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】玉米莖腐病致病菌復(fù)雜多樣，但中國(guó)莖腐病的病原主要為腐霉菌（以腫囊腐霉Pythium inflatum為主）和鐮孢菌（以禾谷鐮孢Fusarium graminearum為主）兩大類[6-7]，國(guó)外多由鐮孢菌引起莖腐病[8-9]。腐霉莖腐病具有突發(fā)性強(qiáng)的特點(diǎn)，其典型癥狀為青枯，曾在20世紀(jì)80年代對(duì)生產(chǎn)造成較大影響。一般發(fā)病年份，腐霉莖腐病田間發(fā)病率為 5%—10%，在病害重發(fā)年份，田間發(fā)病率可達(dá)20%—30%，一些感病品種的發(fā)病率達(dá) 40%—80%，可引起30%以上的產(chǎn)量損失[10-11]。與腐霉莖腐病相比，鐮孢莖腐病發(fā)生更為普遍，其田間癥狀包括青枯和黃枯2種類型。據(jù)報(bào)道，在北美，鐮孢莖腐病給玉米生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，堪薩斯州因鐮孢莖腐病每年造成玉米減產(chǎn)約 5%，在重病田，發(fā)病率可達(dá)90%—100%，減產(chǎn)高達(dá)50%；在俄亥俄州，一般引起5%—10%的產(chǎn)量損失；在內(nèi)布拉斯加州，一般年份因鐮孢莖腐病減產(chǎn)5%，較重時(shí)減產(chǎn)10%—20%。在中國(guó)，該病引起玉米減產(chǎn)達(dá)20%，重度發(fā)生時(shí)造成的損失更大[4]。隨著氣候變化、秸稈還田和免耕少耕等栽培模式的推廣，田間病原菌不斷積累，致使中國(guó)玉米莖腐病發(fā)生呈加重趨勢(shì)，尤其是近年來(lái)推廣的高密度種植方式，使田間環(huán)境更加有利于莖腐病的發(fā)生，同時(shí)，由該病害引發(fā)或加劇的植株早衰、倒伏現(xiàn)象又成為推廣高密度種植技術(shù)的主要障礙[12-13]。田間病害調(diào)查表明，抗病品種具有明顯的降低病害發(fā)生率、減輕產(chǎn)量損失的作用。因此，種植和利用抗病品種是控制莖腐病的安全、經(jīng)濟(jì)和有效措施。優(yōu)異的抗性種質(zhì)是進(jìn)行抗病品種選育的前提和基礎(chǔ)。開(kāi)展玉米種質(zhì)資源抗莖腐病人工接種鑒定與評(píng)價(jià)，是篩選抗莖腐病種質(zhì)的必要途徑。王富榮等[14]結(jié)合運(yùn)用田間自然發(fā)病和土壤根埋接種（土埋傷根接種）的方法，鑒定了1 550份玉米種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病的抗性；孫淑琴等[15]采用玉米播種時(shí)埋菌接種和成株期傷莖根埋接種相結(jié)合的方法，對(duì)20個(gè)夏玉米品種進(jìn)行了腐霉莖腐病抗性鑒定；宋燕春等[16]利用土壤根埋接種法鑒定了 287份重要玉米自交系對(duì)腐霉莖腐病的抗性。自2000年以來(lái)，筆者采用土壤根埋接種的方法對(duì)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)保存和引進(jìn)的約5 000份玉米自交系和農(nóng)家種進(jìn)行了抗腐霉莖腐病鑒定，篩選出一批對(duì)腐霉莖腐病抗性較好的材料，部分材料已用于抗性基因挖掘和種質(zhì)創(chuàng)新研究[17-21]，但這些種質(zhì)對(duì)鐮孢莖腐病抗性如何，尚未可知。通過(guò)針扎玉米基部第一莖節(jié)注射孢子懸浮液的方式，鑒定評(píng)價(jià)了一些自交系和雜交種對(duì)鐮孢莖腐病的抗性，篩選出數(shù)份抗性材料[22-24]；AFOLABI等[25]利用自然發(fā)病和帶菌牙簽接種相結(jié)合的方法，對(duì)50份來(lái)自國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究所的自交系進(jìn)行了多年多點(diǎn)抗鐮孢莖腐病鑒定，獲得4份高抗材料；趙子麒等[26]運(yùn)用土壤根埋接種法鑒定了48份自交系對(duì)鐮孢莖腐病的抗性，但其對(duì)腐霉莖腐病的抗性尚不清楚。【本研究切入點(diǎn)】種質(zhì)資源是抗病育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，是保障國(guó)家糧食安全和種業(yè)健康發(fā)展的戰(zhàn)略資源，而資源的表型精準(zhǔn)鑒定是有效利用玉米種質(zhì)的重要途徑和策略。國(guó)內(nèi)外均十分重視玉米種質(zhì)資源的抗病鑒定與評(píng)價(jià)工作，針對(duì)不同玉米病害開(kāi)展了一系列抗性鑒定研究，篩選出一些抗病種質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展抗病種質(zhì)創(chuàng)制和抗病品種選育與利用，對(duì)于相關(guān)病害的控制起到了積極的作用。然而，以往大部分研究選取的材料具有一定的局限性，且抗性評(píng)價(jià)工作大多在固定的鑒定圃完成，很少涉及到多年多環(huán)境的鑒定與評(píng)價(jià)，而莖腐病的發(fā)生和為害程度受環(huán)境影響很大，玉米對(duì)莖腐病的抗性反應(yīng)通常因環(huán)境不同而產(chǎn)生較大的差異，上述研究中篩選出的種質(zhì)能否在不同環(huán)境條件和不同生態(tài)區(qū)都表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，尚未可知[5,14-17,22-24]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)2 004份遺傳背景豐富的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行大規(guī)模多年多點(diǎn)的田間自然發(fā)病鑒定，篩選出在大田自然條件下對(duì)莖腐病抗性較好或綜合性狀突出的代表性種質(zhì)，用于人工接種抗性精準(zhǔn)鑒定；建立和完善玉米種質(zhì)抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準(zhǔn)鑒定的方法，對(duì)690份代表性種質(zhì)進(jìn)行3年共6點(diǎn)的人工接種抗性鑒定，明確這些種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的真實(shí)抗性水平，篩選出不同年份和不同環(huán)境下對(duì)莖腐病均表現(xiàn)出穩(wěn)定抗性的材料，為大規(guī)模開(kāi)展玉米種質(zhì)抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定提供有效的方法和技術(shù)規(guī)程，為玉米抗莖腐病育種和品種的抗性改良提供可利用的抗性資源，為促進(jìn)玉米抗莖腐病育種，加速抗性種質(zhì)的高效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“玉米種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定與創(chuàng)新利用”項(xiàng)目組提供的具有豐富遺傳多樣性的玉米種質(zhì)2 004份以及其中的690份代表性自交系。

1.2 田間自然發(fā)病試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

田間自然發(fā)病鑒定地點(diǎn)均設(shè)置在玉米主產(chǎn)區(qū)，包括河南原陽(yáng)（113°97′E，35°05′N）、山東章丘（117°30′E，36°43′N）、北京順義（116°34'E，40°13'N）、北京房山（116°04′E，39°38′N）、遼寧沈陽(yáng)（123°58′E，42°04′N）、吉林公主嶺（124°48'E，43°30'N）、黑龍江哈爾濱（126°63′E，45°75′N）等地。選擇具有代表性，中上等肥力水平試驗(yàn)地。試驗(yàn)田平整、平坦，施肥水平及其他管理與當(dāng)?shù)厣a(chǎn)水平相當(dāng)。試驗(yàn)采取隨機(jī)排列，3 m行長(zhǎng)，單行種植，2—3次重復(fù)，密度為60 000—67 500 株/hm2。

1.3 田間莖腐病自然發(fā)病調(diào)查與評(píng)價(jià)

在玉米生長(zhǎng)后至蠟熟后期，參照玉米抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)范（NY/T 1248.6-2016和NY/T 1248.7-2016）[27-28]，采用目測(cè)典型癥狀如植株明顯枯黃/枯死/果穗倒掛等，結(jié)合手捏法進(jìn)行田間莖腐病調(diào)查，莖基部變軟、空松，能用手捏動(dòng)植株判定為發(fā)病株。根據(jù)調(diào)查發(fā)病株數(shù)、總株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率，進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。

1.4 莖腐病人工接種精準(zhǔn)鑒定

1.4.1 鑒定用病原菌 具有致病力強(qiáng)的腫囊腐霉（P.inflatum）和禾谷鐮孢（F.graminearum），分別由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所采集、分離、純化、培養(yǎng)并保存。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定在具有噴灌設(shè)施或者灌溉條件良好的抗病鑒定圃進(jìn)行。同一批次的種質(zhì)材料在3個(gè)不同生態(tài)環(huán)境中進(jìn)行2年抗性鑒定，或在2個(gè)不同生態(tài)環(huán)境中進(jìn)行3年的抗性鑒定。腐霉莖腐病鑒定圃設(shè)置在北京昌平（116°14′E，40°10′N）、河南原陽(yáng)（113°97′E，35°05′N）、河南長(zhǎng)葛（113°52′E，34°10′N），鐮孢莖腐病鑒定點(diǎn)設(shè)置于遼寧沈陽(yáng)（123°58′E，42°04′N）、吉林公主嶺（124°48'E，43°30'N）、吉林梨樹(shù)（124°33′E，43°32′N）。

試驗(yàn)材料采取隨機(jī)排列，每份材料雙行種植，行長(zhǎng)5.0 m，行距0.6 m，每行留苗25株，植株密度為67 500株/hm2。田間采用雙小區(qū)（背靠背）種植（根據(jù)當(dāng)?shù)氐牟シN習(xí)慣，背靠背中間可種植高粱或留 40 cm的小過(guò)道），觀察道寬1 m。每隔100行設(shè)置1組已知抗病/感病對(duì)照材料，常用的為自交系齊319（抗）或1145（抗）、掖107（感）（如果某鑒定點(diǎn)出現(xiàn)上述抗、感自交系生長(zhǎng)不適的話，在現(xiàn)有對(duì)照種的基礎(chǔ)上，再增加一組適于當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)且抗感特性穩(wěn)定的材料作為對(duì)照種）。

1.4.3 接種 將致病力強(qiáng)的腫囊腐霉或禾谷鐮孢接種于直徑為9 mm、含有20 mL經(jīng)高壓滅菌的PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和水1 000 mL）平板培養(yǎng)基上，于25℃黑暗培養(yǎng)5—7 d，待菌絲布滿PDA表面時(shí)，按每10皿菌體兌水700 mL的比例，勻漿成糊狀，用于注射接種。

在玉米植株散粉后3—5 d，在植株靠近地表的第2莖節(jié)中部，利用電鉆（配以直徑6 mm鉆頭）以45°角向斜下方打孔，深度達(dá)莖髓中部。鉆孔后，以灌有糊狀接種體的無(wú)針頭注射器將 1.0 mL病菌接種體注入玉米植株莖髓中，并以凡士林密封孔口。接種后田間充分澆灌1次，然后進(jìn)行正常肥水管理。發(fā)病過(guò)程中，選擇連續(xù)的晴天進(jìn)行澆灌1—2次水，模擬暴雨暴晴的病害誘發(fā)條件。

1.4.4 抗病性調(diào)查與評(píng)價(jià) 在接種后的鑒定材料生長(zhǎng)進(jìn)入蠟熟期（接種后40 d），即可進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查時(shí)，先砍除莖稈上部節(jié)段，留地上莖4—5節(jié)，縱剖莖稈，從縱剖面查看莖稈中莖髓部變色或壞死的病斑區(qū)域大小。逐株調(diào)查莖髓部發(fā)病面積，記載發(fā)病級(jí)別（表1）。

表1 玉米對(duì)莖腐病抗性的發(fā)病級(jí)別劃分Table 1 Classification of disease score of maize resistance to stalk rot

根據(jù)單株病情級(jí)別，計(jì)算每份鑒定材料的平均病情級(jí)別，進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)（表2）。

表2 玉米對(duì)莖腐病抗性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The criteria of evaluation of maize resistance to stalk rot

莖腐病平均病情級(jí)別計(jì)算公式如下：

SRS為莖腐病病情級(jí)別（stalk rot score，SRS），SRSA為莖腐病平均病情級(jí)別（stalk rot score on average，SRSA）；i=1為第1個(gè)單株，n為最后第n個(gè)單株。計(jì)算保留1位小數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對(duì)抗性鑒定的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理，利用R語(yǔ)言對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 玉米種質(zhì)對(duì)莖腐病的自然發(fā)病鑒定與評(píng)價(jià)

2016—2018年，各自然發(fā)病鑒定圃的莖腐病發(fā)生狀況表明，在田間自然發(fā)病條件下，莖腐病發(fā)病程度受環(huán)境影響大，不同年份間和不同環(huán)境條件下，發(fā)病程度差異明顯。2016年，各自然發(fā)病鑒定圃的莖腐病均發(fā)生較輕；2017年，遼寧沈陽(yáng)、北京順義和山西定襄的莖腐病偏重發(fā)生，感病和高感材料的占比達(dá)45%；2018年，山西定襄地區(qū)的莖腐發(fā)生較重，其他鑒定點(diǎn)均發(fā)生偏輕。通過(guò)對(duì)2016—2018年各自然發(fā)病鑒定點(diǎn)的抗性鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)共有508份種質(zhì)在田間自然發(fā)病條件下，在各鑒定點(diǎn)均對(duì)莖腐病表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的抗性，其中表現(xiàn)高抗（highly resistant，HR）、抗病（resistant，R）和中抗（moderately resistant，MR）的材料分別為79、106和 323份，上述自交系將成為玉米抗莖腐病人工接種精準(zhǔn)鑒定種質(zhì)選擇的重要參考（表3）。

表3 2016—2018年田間自然發(fā)病鑒定中對(duì)莖腐病表現(xiàn)不同抗性的部分種質(zhì)Table 3 Some maize germplasm with different levels of resistance to stalk rot from naturally infected identification during 2016-2018

2.2 玉米種質(zhì)抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定方法比較分析

2016—2017年，在北京昌平和河南原陽(yáng)，利用土壤根埋接種和莖基部注射接種法對(duì)隨機(jī)挑選的 90份玉米品種和種質(zhì)資源進(jìn)行了腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性鑒定（圖1），結(jié)果表明，用上述2種方法鑒定評(píng)價(jià)的結(jié)果絕大部分一致，在腐霉莖腐病鑒定中，抗病對(duì)照齊319的發(fā)病率和抗性級(jí)別分別為16.7%和4.5，均表現(xiàn)為中抗，感病對(duì)照掖107的發(fā)病率和抗性級(jí)別分別為33.3%和8.5，表現(xiàn)為感?。╯usceptible，S）和高感（highly susceptible，HS），其中，86.7%的被鑒定材料在2種鑒定方法中，對(duì)腐霉莖腐病的抗性反應(yīng)表現(xiàn)一致（相同的抗性水平），僅極少數(shù)材料在 2種鑒定方法中表現(xiàn)出較大差異。利用上述2種方法進(jìn)行的腐霉莖腐病鑒定評(píng)價(jià)結(jié)果的相關(guān)性分析顯示，兩者的相關(guān)系數(shù)r=0.87，表明2種接種方法的評(píng)價(jià)結(jié)果具有高度的相關(guān)性（圖 2-A）。在鐮孢莖腐病抗性鑒定中，抗病對(duì)照齊319在上述2種鑒定方法中分別表現(xiàn)為抗病和中抗，感病對(duì)照掖 107均表現(xiàn)為高感，81.1%的被鑒定材料對(duì)鐮孢莖腐病的抗性反應(yīng)表現(xiàn)一致，2種鑒定方法的評(píng)價(jià)結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)r=0.84，表明兩者之間的相關(guān)性高（圖 2-B）。整體來(lái)看，與土壤根埋接種相比，注射接種時(shí)直接把接病原物定量注入莖髓部，確保每株玉米能成功接種，因此，被鑒定材料整體上發(fā)病程度更充分，可有效用于玉米抗莖腐病種質(zhì)資源的篩選，為規(guī)?；_(kāi)展玉米種質(zhì)抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定奠定了基礎(chǔ)。

圖1 2種不同方法接種玉米莖腐病Fig.1 Inoculation of maize stalk rot

圖2 利用土壤根埋接種和莖基部注射接種法鑒定玉米對(duì)莖腐病抗性的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between soil inoculation and drilling inoculation for screening of maize resistance to stalk rot

2.3 玉米種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病的抗性精準(zhǔn)鑒定與相關(guān)性分析

2018—2020年，在北京昌平、河南長(zhǎng)葛和河南原陽(yáng)，利用莖基部注射法對(duì)690份代表性玉米種質(zhì)進(jìn)行了人工接種鑒定，病害調(diào)查顯示，3個(gè)鑒定點(diǎn)的材料均充分發(fā)病，其中，昌平點(diǎn)的發(fā)病程度更嚴(yán)重?？共?duì)照齊 319和感病對(duì)照掖 107的發(fā)病級(jí)別分別為3.3—5.4和7.3—9.0，表現(xiàn)為抗病-中抗和感病-高感。綜合分析每年的抗病鑒定數(shù)據(jù)表明，2018年，在2個(gè)鑒定點(diǎn)（北京昌平、河南長(zhǎng)葛）對(duì)腐霉莖腐病綜合表現(xiàn)高抗（HR）、抗病（R）、中抗（MR）、感?。⊿）和高感（HS）的種質(zhì)占比分別為0、0、3.2%、14.3%和82.6%；2019年，在2個(gè)點(diǎn)（北京昌平和河南原陽(yáng)）綜合表現(xiàn)為HR、R、MR、S和HS的種質(zhì)占比分別為0、0、4.2%、15.4%和80.3%；2020年，在北京昌平和河南原陽(yáng)均表現(xiàn)HR、R、MR、S和HS的種質(zhì)占比分別為0、1.2%、4.8%、21.8%和72.2%，3年的抗性鑒定結(jié)果具有較好的一致性。通過(guò)對(duì)3年共6點(diǎn)的腐霉莖腐病鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同年度和不同鑒定點(diǎn)之間的相關(guān)系數(shù)（r）為0.46—0.72，其中同一年度（2018、2019和2020年）2個(gè)鑒定點(diǎn)之間的r值分別為0.66、0.60和0.65，同一鑒定點(diǎn)不同年度間（北京昌平2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年）相關(guān)系數(shù)分別為0.72、0.55和0.46，河南長(zhǎng)葛（或原陽(yáng)）不同年度間相關(guān)系數(shù)分別為0.68、0.67和0.72，表明各點(diǎn)之間的鑒定結(jié)果存在較好的相關(guān)性。3個(gè)年度間種質(zhì)的綜合抗性相關(guān)性分析顯示，2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年的r值分別為0.67、0.84和0.87，表明年度間綜合抗性的結(jié)果一致性高（圖3—圖5）。

圖3 玉米種質(zhì)接種腐霉莖腐病的田間癥狀Fig.3 The symptom of maize Pythium stalk rot in the field

圖4 不同玉米種質(zhì)接種腐霉莖腐病的莖髓部癥狀Fig.4 The symptom of maize stalk pith tissues caused by Pythium stalk rot

圖5 2018—2020年玉米種質(zhì)在不同環(huán)境下對(duì)腐霉莖腐病抗性鑒定的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between maize resistance to PSR at different environments during 2018-2020

綜合分析3年共6點(diǎn)的鑒定數(shù)據(jù)，篩選出24份對(duì)腐霉莖腐病抗性較好的種質(zhì)，其中，冀資 H676、遼2235、冀資14L88、冀資14L101、丹337、M02N-23、Y1747、HRB16232、T628358、161085在各年各點(diǎn)的抗性均表現(xiàn)穩(wěn)定，是不可多得的抗腐霉莖腐病資源（表4）。

表4 2018—2020年抗腐霉莖腐病精準(zhǔn)鑒定中表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的24份種質(zhì)Table 4 Twenty-four maize germplasm with stable resistance to Pythium stalk rot from precise characterization during 2018-2020

2.4 玉米種質(zhì)對(duì)鐮孢莖腐病的抗性精準(zhǔn)鑒定與相關(guān)性分析

2018—2020年，在遼寧沈陽(yáng)、吉林公主嶺、吉林梨樹(shù)3個(gè)鑒定點(diǎn)共6個(gè)環(huán)境下，利用莖基部注射法對(duì)690份代表性玉米種質(zhì)進(jìn)行了鐮孢莖腐病接種鑒定，在蠟熟期進(jìn)行的病害調(diào)查顯示，抗病對(duì)照齊319和感病對(duì)照掖107的發(fā)病級(jí)別分別為2.5—5.5和7.5—9.0，表現(xiàn)為抗病-中抗和感病-高感，表明抗病鑒定結(jié)果有效。遼寧沈陽(yáng)鑒定點(diǎn)的接種材料3年發(fā)病程度均非常充分，被鑒定種質(zhì)在3年間的抗性表現(xiàn)較為一致，絕大部分材料均表現(xiàn)為感病或高感；而2018年吉林梨樹(shù)接種的莖腐病發(fā)生明顯偏輕，2019—2020年吉林公主嶺的發(fā)病也欠充分，數(shù)據(jù)分析表明，2018—2020年，吉林3個(gè)環(huán)境下的鐮孢莖腐病發(fā)病程度在年度間存在較大差異，且同一年份中，吉林梨樹(shù)或公主嶺與遼寧沈陽(yáng)鑒定點(diǎn)的發(fā)病程度差異大，可能與接種操作、環(huán)境條件差異以及接種后的田間管理方式相關(guān)，但玉米種質(zhì)在每年2個(gè)點(diǎn)的綜合抗性表現(xiàn)較為一致。通過(guò)對(duì)3年各點(diǎn)的鐮孢莖腐病鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，6個(gè)環(huán)境之間的相關(guān)系數(shù)為0.00—0.76，同一年度（2018、2019和2020年）2個(gè)鑒定點(diǎn)之間的r值分別為0.12、0.04和0.05，遼寧沈陽(yáng)不同年度間（2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年）抗性的相關(guān)系數(shù)分別為0.50、0.65和0.53，吉林梨樹(shù)（或公主嶺）不同年度間相關(guān)系數(shù)分別為0.07、0.76和0.00，表明遼寧沈陽(yáng)鑒定點(diǎn)3年間的結(jié)果以及2019與2020年吉林公主嶺的結(jié)果具有較強(qiáng)的相關(guān)性，其他各點(diǎn)的相關(guān)性弱，鑒定結(jié)果差異大。3個(gè)年度間鐮孢莖腐病的綜合抗性相關(guān)性分析顯示，2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年的r值分別為0.40、0.74和0.72，表明年度間的綜合抗性結(jié)果相關(guān)性較高（圖6—圖7）。綜合6個(gè)環(huán)境下的鑒定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，5份種質(zhì)（冀資 C32、遼 785、遼 2235、吉資 1034和 16SD088）在各年各點(diǎn)均對(duì)鐮孢莖腐病表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，是不可多得的抗鐮孢莖腐病資源（表5）。

圖6 不同玉米種質(zhì)接種禾谷鐮孢莖腐病的莖髓部癥狀Fig.6 The symptom of maize stem pith tissues caused by Gibberella stalk rot

圖7 2018—2020年玉米種質(zhì)在不同環(huán)境下對(duì)鐮孢莖腐病抗性鑒定的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between maize resistance to GSR at different environments during 2018-2020

表5 2018—2020年抗鐮孢莖腐病精準(zhǔn)鑒定中表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的玉米種質(zhì)Table 4 Five maize germplasm with stable resistance to Gibberella stalk rot from precision identification during 2018-2020

2.5 玉米種質(zhì)對(duì)2種莖腐病抗性的相關(guān)性分析

對(duì) 690份玉米種質(zhì)的腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的綜合抗性進(jìn)行相關(guān)性分析（圖8），發(fā)現(xiàn)這些種質(zhì)對(duì) 2種莖腐病抗性的相關(guān)系數(shù)為 0.44，表明上述材料對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性存在中等水平的相關(guān)性，由此推測(cè)部分種質(zhì)對(duì)這兩種莖腐病具有相似的抗病機(jī)制，但大部分種質(zhì)對(duì)這兩種病害的抗性存在差異。在上述 690份資源中，遼 2235和16SD088對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病均表現(xiàn)出較好的抗性，將為玉米抗莖腐病育種和品種抗性改良提供重要的抗源材料。

圖8 玉米種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病與鐮孢莖腐病抗性的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between PSR and GSR resistance in 690 maize germplasm

3 討論

玉米是中國(guó)主要的糧食作物和飼料作物，保障玉米安全生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，不斷提高產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)于促進(jìn)玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展和保障中國(guó)糧食安全具有重要意義。腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病是玉米生長(zhǎng)中后期的重要病害，生產(chǎn)上尚無(wú)針對(duì)該病害的有效防控手段，利用抗性品種無(wú)疑是控制莖腐病最為理想的措施。鑒于玉米莖腐病對(duì)生產(chǎn)為害的嚴(yán)重性以及品種抗性的重要性，在國(guó)家玉米新品種審定標(biāo)準(zhǔn)中，在中國(guó)所有玉米生態(tài)區(qū)，對(duì)高感莖腐病的品種實(shí)行一票否決，即玉米新品種的莖腐病田間自然發(fā)病和人工接種鑒定均未達(dá)到高感，否則不予以審定，因此，抗病性已成為玉米新品種不可或缺的特性。近年來(lái)，玉米種質(zhì)和品種的抗病性鑒定與抗病品種的推廣得到了社會(huì)的廣泛認(rèn)可，玉米育種工作者、育種企業(yè)和種植戶對(duì)于品種抗病的重要性認(rèn)識(shí)不斷提高。玉米種質(zhì)資源是抗病育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，精準(zhǔn)鑒定和篩選出具有不同遺傳背景且在不同環(huán)境條件下均對(duì)莖腐病表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的種質(zhì)，對(duì)于促進(jìn)玉米抗病育種具有重要意義。

3.1 玉米種質(zhì)對(duì)莖腐病的自然發(fā)病鑒定與評(píng)價(jià)

本研究首次通過(guò)大規(guī)模多年多點(diǎn)的田間自然發(fā)病鑒定與多年多點(diǎn)的人工接種鑒定相結(jié)合的方式，精準(zhǔn)鑒定和評(píng)價(jià)了玉米種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性水平。在2016—2018年，對(duì)2 004份具有廣泛遺傳背景的玉米種質(zhì)進(jìn)行了多環(huán)境（黃淮、京津冀、東北和西北）的田間自然發(fā)病鑒定，初步篩選出在田間自然發(fā)病條件下對(duì)莖腐病抗性較好的種質(zhì)508份以及對(duì)其他病害綜合抗性好的種質(zhì)，結(jié)合農(nóng)藝性狀的田間綜合表現(xiàn)，挑選出部分對(duì)莖腐病或其他常見(jiàn)病害抗性較好或綜合性狀比較優(yōu)異的代表性種質(zhì)690份，進(jìn)行了3年共6個(gè)環(huán)境的人工接種精準(zhǔn)鑒定，最終篩選出對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病具有穩(wěn)定抗性的玉米種質(zhì)各24和5份。

綜合分析玉米田間自然發(fā)病與人工接種抗性鑒定的數(shù)據(jù)表明，與人工接種鑒定相比，田間自然發(fā)病鑒定確實(shí)存在許多不確定性，如不能保證同一批次的材料都感染病原菌、在不同環(huán)境可能存在不同種病原、病原菌侵染與玉米敏感生育期能否吻合、發(fā)病條件不進(jìn)行任何人工干預(yù)、田間環(huán)境條件完全不可控等，導(dǎo)致表型受環(huán)境影響更大，對(duì)莖腐病而言尤為如此；人工接種則能保證被鑒定材料均能接種上特定病原菌，并且在接種后于鑒定圃創(chuàng)造適宜莖腐病病原菌侵染和擴(kuò)展的環(huán)境條件，誘導(dǎo)該病害的發(fā)生和發(fā)展。本研究表明，在自然發(fā)病中對(duì)莖腐病表現(xiàn)較好抗性的材料，在人工接種后，大多表現(xiàn)出感病癥狀，而通過(guò)人工接種鑒定出的抗性種質(zhì)，在自然發(fā)病中均對(duì)相應(yīng)病害表現(xiàn)抗病，這種情況不難理解，因?yàn)榻臃N物的單位體積病原菌濃度通常大大高于土壤中該病菌的自然濃度，且接種后鑒定圃中的環(huán)境條件適于莖腐病發(fā)生，無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致莖腐病發(fā)生加重。盡管如此，由于自然發(fā)病是在多年多環(huán)境下進(jìn)行的，其發(fā)病條件與大田生產(chǎn)品種所處的環(huán)境完全一致，在某種意義上講，自然發(fā)病鑒定的結(jié)果更接近于田間真實(shí)的抗性水平，因此，自然發(fā)病鑒定的結(jié)果具有一定的參考價(jià)值[29]。

3.2 玉米種質(zhì)抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定方法比較分析

本研究建立和完善了玉米種質(zhì)抗莖腐病精準(zhǔn)鑒定的新方法-莖基部注射法，利用該方法，對(duì)690份玉米代表性種質(zhì)進(jìn)行了抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準(zhǔn)鑒定，明確了上述種質(zhì)對(duì)腐霉和鐮孢莖腐病的真實(shí)抗性水平，篩選出20余份對(duì)莖腐病具有穩(wěn)定抗性的材料。關(guān)于玉米莖腐病接種鑒定的方法，腐霉莖腐病以往通常采用土壤根埋接種（土埋傷根接種）法進(jìn)行鑒定[5,14,16-18]，也有通過(guò)播種時(shí)埋菌接種結(jié)合成株期傷莖根埋接種鑒定[15]和苗期接種鑒定的報(bào)道[30]。而鐮孢莖腐病的鑒定，則通過(guò)土壤根埋接種法[26,31-33]、針扎玉米基部第一莖節(jié)注射孢子懸浮液[22,24]或帶菌牙簽接種[25]等方法進(jìn)行，其中土壤根埋接種法應(yīng)用廣泛。與莖基部注射法相比，土壤根埋菌法操作較為簡(jiǎn)單，接近田間植株發(fā)病的實(shí)際情況，比較直觀，缺點(diǎn)是接種物用量大，接種和調(diào)查評(píng)價(jià)的操作相對(duì)較為粗放，接種時(shí)很難做到定量，且不能保證被鑒定的每株玉米都能接種上病原菌，調(diào)查時(shí)采用手捏莖基部是否變軟來(lái)確定發(fā)病株，導(dǎo)致不同調(diào)查人之間容易出現(xiàn)一定誤差；后者直接將定量的接種物注入玉米基部莖稈中，能確保被鑒定的每株材料均能定量接上病原菌，發(fā)病更為充分，而調(diào)查時(shí)剖開(kāi)每株材料莖稈，根據(jù)病斑區(qū)域大小確定發(fā)病面積和病情等級(jí)，提高抗性評(píng)價(jià)精度，可有效用于種質(zhì)資源的抗性鑒定評(píng)價(jià)，結(jié)果更為可靠，但鑒定過(guò)程涉及莖基部鉆孔、注射和凡士林封口以及逐株剖稈調(diào)查等試驗(yàn)程序，工作量大且耗時(shí)費(fèi)力。總之，上述2種莖腐病的接種鑒定方法，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，玉米根際土壤埋菌法適用于玉米新品種的抗莖腐病鑒定與評(píng)價(jià)，莖基部注射接種法則更適合于種質(zhì)資源抗莖腐病的精準(zhǔn)鑒定。

3.3 玉米種質(zhì)對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性精準(zhǔn)鑒定與相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)腐霉莖腐病3年共6個(gè)環(huán)境的抗性鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行的相關(guān)性分析表明，6個(gè)環(huán)境條件下的腐霉莖腐病抗性鑒定結(jié)果之間均存在較強(qiáng)的相關(guān)性，每年2個(gè)鑒定點(diǎn)之間的鑒定評(píng)價(jià)結(jié)果一致性較高，年度間的抗性評(píng)價(jià)結(jié)果也具有較高的一致性，尤其是不同年度間2個(gè)環(huán)境的綜合抗性情況更是趨于一致。然而，本研究中的690份代表性種質(zhì)對(duì)鐮孢莖腐病的反應(yīng)，在同一年份的2個(gè)鑒定點(diǎn)之間表現(xiàn)出很大的差異，吉林梨樹(shù)和公主嶺的玉米種質(zhì)發(fā)病程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同年遼寧沈陽(yáng)的同批次材料，在吉林梨樹(shù)和公主嶺鑒定點(diǎn)表現(xiàn)抗病或中抗的一些種質(zhì)，在遼寧沈陽(yáng)均表現(xiàn)出感病或高感，相關(guān)性分析也顯示出同一年度2個(gè)鑒定點(diǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果的相關(guān)性非常低，且3年均是如此，可能與2個(gè)鑒定點(diǎn)的不同人員接種操作、環(huán)境條件差異以及接種后的田間管理方式和精細(xì)程度密切相關(guān)，然而，不同年度間2個(gè)環(huán)境的鐮孢莖腐病綜合抗性均具有較高的一致性，表明多年多點(diǎn)鑒定對(duì)于篩選抗莖腐病的種質(zhì)具有重要意義，只有在不同環(huán)境條件、不同病害選擇壓力下均表現(xiàn)出抗病的材料，才是真正具有穩(wěn)定抗性種質(zhì)的資源。

4 結(jié)論

對(duì) 2 004份遺傳背景豐富的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行了 3年多環(huán)境的莖腐病田間自然發(fā)病抗性鑒定，篩選出 508份種質(zhì)在各鑒定點(diǎn)均對(duì)自然發(fā)病條件下的莖腐病表現(xiàn)出較為穩(wěn)定抗性。建立和完善了玉米抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準(zhǔn)鑒定的新方法-莖基部注射法，并利用該方法對(duì) 690份代表性玉米種質(zhì)進(jìn)行了3年共6個(gè)環(huán)境的腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病抗性精準(zhǔn)鑒定，發(fā)現(xiàn)這些種質(zhì)對(duì) 2種莖腐病的抗性具有中等水平的正相關(guān)性，篩選出對(duì)腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病具有穩(wěn)定抗性的玉米種質(zhì)各24和5份，其中2份材料對(duì)2種莖腐病同時(shí)表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，是開(kāi)展玉米抗莖腐病育種或?qū)χ髟云贩N進(jìn)行抗性改良的重要抗源。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李春輝副研究員提供了玉米材料的種子和雜種優(yōu)勢(shì)類群數(shù)據(jù)，在此表示感謝。