蘇熠，程誠(chéng)，王琪

（南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，江蘇 南京210044）

1 引言

近年來(lái)，假單胞菌屬在生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)方面具有廣闊發(fā)展前景，在動(dòng)植物和人類(lèi)病原體醫(yī)學(xué)研究方面具有重要意義，因此受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[1]。假單胞菌是重要的植物生長(zhǎng)促生菌之一，其能夠快速生長(zhǎng)，并在根際表現(xiàn)出良好的定殖能力[2]；能夠產(chǎn)生抗生素、鐵載體和多糖，具有抑制土壤病原體的巨大潛力[3]。假單胞菌屬可以利用各種基質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并能在各種對(duì)于其他細(xì)菌來(lái)說(shuō)很艱難的條件下生存。一些假單胞菌菌株可以通過(guò)產(chǎn)生葡萄糖酸從黑云母、長(zhǎng)石和磷酸鹽等礦物中溶解鉀和磷以及其他元素[4～7]，而分泌有機(jī)酸是根際細(xì)菌溶解含磷礦物的主要途徑[4]。由于質(zhì)子的分泌，植物根際環(huán)境通常呈酸性，pH值較非根際土壤低2個(gè)單位[8]。另外，一些經(jīng)過(guò)基因工程改造的假單胞菌已經(jīng)應(yīng)用于醛酸的高效生產(chǎn)，在食品、化妝品和制藥行業(yè)廣泛應(yīng)用[9～11]。

產(chǎn)酸假單胞菌對(duì)酸的耐受性，不僅能夠促使其更有效地風(fēng)化礦物[12]，而且在其適應(yīng)酸性環(huán)境過(guò)程中也起重要作用。微生物內(nèi)部環(huán)境的酸化會(huì)增加細(xì)胞外滲透性，破壞細(xì)胞質(zhì)中生物大分子的結(jié)構(gòu)[13]。此外，細(xì)胞質(zhì)酸化會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞內(nèi)酶的活性，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解并導(dǎo)致DNA損傷[14]，因此細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的pH值通常接近中性[15]。假單胞菌已知和潛在的耐酸機(jī)制包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性、外排泵、堿性化合物的合成、能量代謝、DNA損傷修復(fù)、生物膜。深入理解假單胞菌菌株的耐酸機(jī)制，將有助于進(jìn)一步深入了解根際周?chē)参锖臀⑸镏g的相互作用與機(jī)制，且能為微生物菌肥的研發(fā)與應(yīng)用、土壤有益元素活化、食品防腐工藝開(kāi)發(fā)以及藥物研發(fā)等提供新的技術(shù)途徑。

2 耐酸機(jī)制

2.1 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性

當(dāng)細(xì)菌暴露于酸性環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜可能會(huì)發(fā)生一系列變化，包括囊泡形成、磷脂成分變化和細(xì)胞膜通透性降低[16～18]。研究表明，外部酸性環(huán)境可以作為細(xì)菌細(xì)胞壁應(yīng)激的信號(hào)[13]，誘導(dǎo)細(xì)胞壁修復(fù)酶的合成，防止細(xì)胞壁降解。

參與細(xì)胞壁和膜合成的物質(zhì)會(huì)對(duì)酸性環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)。如，青霉素結(jié)合蛋白（MrcA）是參與細(xì)胞壁肽聚糖（PNG）合成的主要酶，為構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌薄壁組織的重要成分[19]。脂多糖（LPS）是膜的主要成分，對(duì)膜的穩(wěn)定性起著重要作用。Kelly等[19]發(fā)現(xiàn)，在革蘭氏陰性細(xì)菌遭受酸脅迫時(shí)，負(fù)責(zé)PNG水解，催化細(xì)胞壁聚糖鏈斷裂的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶和裂解轉(zhuǎn)糖苷酶數(shù)量降低。

參與膜穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)在假單胞菌的耐酸性中也起著重要作用。當(dāng)暴露于高濃度對(duì)香豆酸時(shí)，ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體中的Ttg2ABC基因缺失會(huì)損害惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）KT2440的正常生長(zhǎng)[20]。據(jù)報(bào)道，這種轉(zhuǎn)運(yùn)體參與了抵抗其他脅迫的過(guò)程，如氧化脅迫、重金屬和抗生素以及甲苯[21]。外膜脂蛋白（VacJ）與大腸桿菌（Escherichia.coli）和志賀氏菌（Shigella flexneri）的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)，也被認(rèn)為與惡臭假單胞菌對(duì)于對(duì)香豆酸和藥物的耐性有關(guān)[20]。在細(xì)胞膜將被破壞時(shí)，VacJ在維持外膜穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[22，23]，并且其缺失會(huì)導(dǎo)致外膜滲透性增加[23]。此外，乳酸（LBA）暴露后，熒光假單胞菌的機(jī)械敏感性離子通道蛋白上調(diào)。這種蛋白質(zhì)是滲透安全閥，可以防止細(xì)胞在低滲透性的休克期間因?yàn)槟B透屏障的短暫損傷而破裂[13]。

2.2 外排泵

外排泵能繞過(guò)周質(zhì)去除細(xì)胞中的有毒物質(zhì)，有效提高細(xì)胞在有毒環(huán)境中的存活率[24]。通過(guò)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和相關(guān)基因的刪除，Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，在添加黑云母的條件下，具有高效礦物風(fēng)化功能的生氮假單胞菌（P.azotosomes）菌株F77中編碼NADH脫氫酶的基因（包括nuoE、nuoF和nuoI）顯著上調(diào)。NADH脫氫酶和其他NADH-泛素氧化還原酶可以將H+泵出細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)部的pH值[25]，從而緩解酸的脅迫效應(yīng)。

超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MFS）可促進(jìn)各種底物（包括離子、糖磷酸鹽、藥物、氨基酸和肽）在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)膜上移動(dòng)[26]。Ma等[27]證實(shí)了惡臭假單胞菌菌株KT2440中的MFS2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因簇PP_1271、PP_1272和PP_1273在耐受丙酸（PA）過(guò)程中的作用。PA是一種廣泛使用的食品防腐劑，對(duì)微生物生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。因此，PA對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制也是對(duì)其高效微生物發(fā)酵生產(chǎn)的巨大挑戰(zhàn)。PP_1271、PP_1272和PP_1273的過(guò)表達(dá)不僅促進(jìn)了菌株KT2440在丙酸鈉環(huán)境下正常生長(zhǎng)，而且還增加了PA產(chǎn)量，這可能是MFS2轉(zhuǎn)運(yùn)體向細(xì)胞外不斷運(yùn)輸PA導(dǎo)致的[27，28]。

能識(shí)別多種藥物的藥物外排泵稱(chēng)為多藥外排泵，能通過(guò)內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)從細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)中向細(xì)胞外泵出多種抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌能同時(shí)耐受多種藥物[29，30]。乳酸是一種多功能有機(jī)酸，天然存在于酸奶等發(fā)酵乳制品中，廣泛用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品。當(dāng)暴露于LBA時(shí)，熒光假單胞菌（P.fluorescens）中的耐藥-結(jié)瘤-分裂（RND）型多藥外排泵數(shù)量上調(diào)。RND外排泵的表達(dá)受外界應(yīng)激因素的影響，如活性氧[31]。因此，外排泵可能是一種通用的菌體自我保護(hù)機(jī)制的一種，以對(duì)抗酸脅迫引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 堿性化合物的生成

細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生堿性化合物（包括脲酶、腐胺、亞精胺和NH3+）來(lái)抵消細(xì)胞質(zhì)的酸化[32]。尿素酶能特定催化尿素水解成氨（NH3）和二氧化碳（CO2），從而中和細(xì)菌微生境中的酸。已有報(bào)道表明，提高尿素酶活性是幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacter pylori）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的主要耐酸機(jī)制[31]，其催化產(chǎn)生的NH3可以作為緩沖液離開(kāi)菌體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，以NH4+的形態(tài)進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)空間。精氨酸脫胺酶（ADI）能將精氨酸分解為鳥(niǎo)氨酸、NH3和CO2。這些堿性化合物有助于提高細(xì)胞pH值來(lái)應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境[33～35]。例如，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）通過(guò)ADI途徑產(chǎn)生NH4+，以獲得ATP來(lái)對(duì)抗酸脅迫[36]。

研究發(fā)現(xiàn)，生氮假單胞菌（P.azotoformans）F77主要通過(guò)生成葡萄糖酸和降低培養(yǎng)基的pH值來(lái)加速黑云母風(fēng)化[12]。在培養(yǎng)基中添加黑云母的條件下，當(dāng)菌株F77受到酸脅迫時(shí)，負(fù)責(zé)編碼堿性物質(zhì)（如NH3、腐胺和亞精胺）的基因，包括ureD、ureC、ureaA、ureB、urgeG、ureJ、potF和orf02258顯著上調(diào)。生理試驗(yàn)結(jié)果也表明，在黑云母存在的低pH值條件下，F(xiàn)77菌株細(xì)胞內(nèi)NH3+的產(chǎn)生會(huì)增加。

2.4 能量代謝

由于耐酸菌株需要從細(xì)胞中運(yùn)送額外的質(zhì)子來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的pH值，因此，跨膜質(zhì)子能量是細(xì)菌很重要的耐酸機(jī)制之一[37]。H+-ATP酶是一種由多個(gè)亞基組成的酶，具有質(zhì)子轉(zhuǎn)移膜通道的功能[38]，通過(guò)產(chǎn)生ATP為細(xì)胞在酸性環(huán)境中維持生存提供能量。這種酶可以利用質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)消耗底物水平磷酸化產(chǎn)生的ATP將質(zhì)子從細(xì)胞中排出。因此，較高的H+-ATP酶和能量積累有利于細(xì)菌菌株維持pH值穩(wěn)態(tài)[39]。當(dāng)生氮假單胞菌和嗜熱乳桿菌（Lactobacillus thermophilus）分別處于低pH值環(huán)境時(shí)，H+-ATP酶的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)[12，40]。

編碼成熟細(xì)胞色素c系統(tǒng)的基因ccmCDEF和編碼硫氧化還原蛋白的基因dsbE對(duì)細(xì)菌耐受香豆酸意義重大。當(dāng)暴露于對(duì)香豆酸時(shí)，ccmF和ccmC的缺失顯著抑制了惡臭假單胞菌KT2440的正常生長(zhǎng)。細(xì)胞色素c成熟系統(tǒng)可以促進(jìn)血紅素基團(tuán)附著在周質(zhì)中的脫細(xì)胞色素c上，使c型細(xì)胞色素在細(xì)胞呼吸和ATP合成中發(fā)揮重要功能[41]。缺乏對(duì)香豆酸耐受性的功能操縱子，會(huì)使細(xì)胞表現(xiàn)出高能量需求或膜電位的破壞現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放[42]。此外，大腸桿菌中參與能量代謝的基因（如nuo和cyo操縱子）相對(duì)豐度的增加，也證明能量代謝在由游離脂肪酸引起的應(yīng)激中起著重要作用[43]。

2.5 DNA損傷修復(fù)

乳糖酸（LBA）是一種多功能有機(jī)酸，天然存在于酸奶等發(fā)酵乳制品中，廣泛用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品[44]。LBA使食品中的主要腐敗菌熒光假單胞菌（P.fluorescens）具有良好的抗菌活性。Li等[13]應(yīng)用全理論片段離子質(zhì)譜（SWATH-MS）對(duì)熒光假單胞菌進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LBA可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累在P.fluorescens中引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)抗氧化酶/解毒酶對(duì)抗活性氧。ROS誘導(dǎo)的氧化損傷可能導(dǎo)致DNA損傷。為了應(yīng)對(duì)DNA損傷帶來(lái)的不利影響，細(xì)胞中形成了各種修復(fù)機(jī)制[45]。在P.fluorescens中，負(fù)責(zé)多聚磷酸（polyP）合成的多磷酸激酶（PPK）經(jīng)-LBA處理顯著上調(diào)。PolyP在各種應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)、運(yùn)動(dòng)和生物膜形成中起著關(guān)鍵作用[46，47]。此外，PPK可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，或刺激對(duì)高溫、酸和氧化條件敏感的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶MetA的抑制性變性聚集體的降解，來(lái)保護(hù)腸沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica）免受弱有機(jī)酸脅迫[48]。LBA暴露后，分別介導(dǎo)核苷酸和堿基切除修復(fù)的常見(jiàn)DNA修復(fù)蛋白——UvrABC系統(tǒng)蛋白C（UvrC）和外脫氧核糖核酸酶Ⅲ（ExoⅢ）在P.fluorescens上調(diào)?？偟膩?lái)說(shuō)，酸脅迫導(dǎo)致DNA損傷，而PPK、UvrC和ExoⅢ被誘導(dǎo)產(chǎn)生來(lái)修復(fù)DNA損傷。

2.6 生物膜

生物膜是自然界微生物相互聚集的一種形式，是在細(xì)菌、細(xì)菌接觸表面以及細(xì)菌增殖中形成了具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的群體，在這個(gè)群體的共同作用下，細(xì)菌粘附在接觸表面并產(chǎn)生了大量胞外聚合物（EPS）[49]。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏和酸脅迫，粘附在生物膜中的細(xì)菌將繼續(xù)進(jìn)化并向相鄰細(xì)胞傳播耐藥性，導(dǎo)致群體對(duì)不利環(huán)境的總體耐藥性顯著提高[50，51]。如生物膜內(nèi)的P.fluorescensNCM90也比游離細(xì)胞更耐酸性電解水[52]。

在被細(xì)菌包裹的生物膜中通常有大量的EPS。這些EPS是一種有效的物理屏障，可以防止酸性物質(zhì)的滲透或氫離子的消耗[51]，以確保細(xì)菌在生物膜中能正常生長(zhǎng)。

此外，生物膜的最內(nèi)層通常沒(méi)有可消耗的氧氣，形成了厭氧環(huán)境。同時(shí)，一些細(xì)胞會(huì)可逆地進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)或低生長(zhǎng)代謝狀態(tài)[53]，在營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)受限等應(yīng)激反應(yīng)時(shí)降低對(duì)外部酸性環(huán)境的敏感性[54]。存活的菌株會(huì)降低生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)生長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間，增加細(xì)菌膜的合成，從而細(xì)胞的耐受性增強(qiáng)[55]。

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是一種細(xì)胞間信號(hào)傳遞過(guò)程，使細(xì)菌能夠集體控制基因表達(dá)，從而協(xié)調(diào)一些僅在高種群密度下才能產(chǎn)生的活動(dòng)。S-核糖同型半胱氨酸酶（LuxS）介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)LuxS酶的活性產(chǎn)生一種自動(dòng)誘導(dǎo)劑-2（AI-2）的通用信號(hào)分子，一般出現(xiàn)在革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，用于種內(nèi)和種間通信。LuxS介導(dǎo)的QS可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的重要生理特性，如毒力基因表達(dá)[56]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[57]、生物膜形成[58，59]、對(duì)酸和氧化應(yīng)激的耐受性[60，61]等。乳酸桿菌中，細(xì)胞的AI-2活性增加，luxS基因轉(zhuǎn)錄顯著增加[62]，這表明luxS通過(guò)AI-2活性介導(dǎo)的群體感應(yīng)可能參與酸脅迫應(yīng)激反應(yīng)。QS在假單胞菌生物膜的形成中也有重要作用。如，銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）生物膜中胞外DNA（eDNA）的形成受QS系統(tǒng)控制[63]。因此，QS也可能在假單胞菌的耐酸性中發(fā)揮潛在作用。

生物膜，尤其是較厚的生物膜，可能為細(xì)菌細(xì)胞提供一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，以充分表達(dá)其適應(yīng)性生存機(jī)制。由于三維結(jié)構(gòu)、高細(xì)胞密度和擴(kuò)散障礙，生物膜內(nèi)不同位置的細(xì)菌細(xì)胞可能無(wú)法同時(shí)感受到相同程度的pH值。首先感受到pH值脅迫的細(xì)胞可能會(huì)迅速處理信息，并通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)系統(tǒng)將信號(hào)傳遞給群體中的其他成員，啟動(dòng)針對(duì)pH值脅迫的協(xié)調(diào)保護(hù)反應(yīng)去應(yīng)對(duì)可能致命的酸。與需要達(dá)到信號(hào)分子和細(xì)胞密度的臨界濃度的游離細(xì)胞不同，生物膜可以讓信號(hào)分子在局部環(huán)境中快速積累，從而更快地啟動(dòng)協(xié)調(diào)活動(dòng)[64，65]。此外，在生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)階段或代謝活動(dòng)方面，生活在生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞的生理狀態(tài)是混雜的。這允許細(xì)胞以不同的方式對(duì)壓力做出反應(yīng)。顯然，生物膜內(nèi)的菌體細(xì)胞相對(duì)于游離細(xì)胞，有更多的時(shí)間、足夠的信號(hào)分子濃度和較高的群體密度來(lái)適應(yīng)外部環(huán)境[66]。

3 總結(jié)與討論

假單胞菌在自然環(huán)境中面臨各種生物、非生物脅迫，在自然壓力的選擇下，假單胞菌進(jìn)化出多種適應(yīng)性機(jī)制，表現(xiàn)出豐富的代謝多樣性。假單胞菌在溶解土壤礦物、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防控植物病原菌、生物修復(fù)污染物等方面具有重要意義。高通量測(cè)序技術(shù)和模式生物脅迫機(jī)制的建立推動(dòng)了對(duì)重要生物脅迫機(jī)制的分析，但是目前關(guān)于假單胞菌耐酸機(jī)制的研究仍然有限，有待進(jìn)一步深入研究。

現(xiàn)有關(guān)于假單胞菌的研究多采用菌株全基因組分析結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析等多組學(xué)技術(shù)，通過(guò)比較假單胞菌在有/無(wú)酸脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組或蛋白組的變化，篩選與酸脅迫相關(guān)功能基因或蛋白，并結(jié)合q-RT PCR、基因敲除對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。但是，相關(guān)功能基因?qū)賳伟砩匦约按x物的影響仍缺乏深入、系統(tǒng)的研究。今后的研究不僅需要利用多組學(xué)技術(shù)發(fā)掘與假單胞菌耐酸相關(guān)的候選基因，更要投入大量精力揭示潛在的耐酸基因功能。