張靖雯，楊江華*，張效偉，2

(1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.江蘇省環(huán)境保護(hù)化學(xué)品安全與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

0 前言

人類活動(dòng)產(chǎn)生的環(huán)境污染、棲息地破壞、土地類型的改變等對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的物種組成產(chǎn)生巨大影響[1]，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性下降，生態(tài)功能和服務(wù)受損。環(huán)境管理中，高效準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)物種多樣性對(duì)及時(shí)了解水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況至關(guān)重要[2-3]。目前，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中生物組成的了解主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)物種調(diào)查方法，即先將物種從環(huán)境中分離，再根據(jù)其特定的分類學(xué)特征鑒別物種，整個(gè)過(guò)程極其耗時(shí)、耗力，并嚴(yán)重依賴鑒定專家的物種鑒定經(jīng)驗(yàn)。DNA宏條形碼技術(shù)作為一種準(zhǔn)確、高效的新型生物監(jiān)測(cè)手段，主要利用環(huán)境中殘存的生物DNA序列識(shí)別物種，在河流、湖泊、海洋等生態(tài)系統(tǒng)的生物監(jiān)測(cè)中被廣泛應(yīng)用[4-7]。盡管DNA宏條形碼技術(shù)被越來(lái)越多的學(xué)者所接受，但是由于缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化操作流程，導(dǎo)致跨實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果難以橫向?qū)Ρ?，?yán)重阻礙了該技術(shù)在環(huán)境管理中的應(yīng)用，因此亟須針對(duì)不同生物類群建立統(tǒng)一規(guī)范的DNA宏條形碼分析方法。

浮游動(dòng)物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是物質(zhì)和能量從初級(jí)生產(chǎn)者(藻類)到更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)(魚(yú)類)物種傳遞的紐帶，對(duì)維持水生生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義[8]。浮游動(dòng)物生活周期短，對(duì)環(huán)境因子(如物化參數(shù)、污染脅迫等)較為敏感，是水生生態(tài)健康狀況的重要指示生物[9-10]。目前，依賴形態(tài)學(xué)物種鑒定的生物調(diào)查是淡水生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)健康評(píng)估的重要依據(jù)。但傳統(tǒng)調(diào)查難以辨別處于發(fā)育早期，分類特征尚未形成的橈足類浮游動(dòng)物，無(wú)法準(zhǔn)確反映浮游動(dòng)物群落的物種組成。而DNA宏條形碼技術(shù)主要基于物種間特定DNA序列差異來(lái)區(qū)分物種，采樣便捷、準(zhǔn)確性高，被廣泛應(yīng)用在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的諸多研究中[11]，如新物種發(fā)現(xiàn)、生物多樣性評(píng)估[12]、生物捕食關(guān)系分析[13]及食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)特征分析等[14]，也為浮游動(dòng)物群落組成的精準(zhǔn)調(diào)查提供了新的機(jī)遇。

雖然DNA宏條形碼基本檢測(cè)單位是DNA分子，這與傳統(tǒng)調(diào)查以生物體為基本檢測(cè)單位明顯不同，但是 DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)中的樣品采集方法主要參照傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)調(diào)查的采樣方法[15-18]，即先用浮游生物網(wǎng)富集，之后提取富集獲得的混合組織的DNA，進(jìn)而進(jìn)行高通量測(cè)序和物種組成分析。該過(guò)程中究竟富集多大體積的水樣才能較準(zhǔn)確地反映浮游動(dòng)物群落的多樣性與完整性還存在爭(zhēng)議[19-22]。也有學(xué)者直接采用過(guò)濾水樣的方式開(kāi)展浮游動(dòng)物多樣性研究[23-24]，但這種簡(jiǎn)單的采樣方式獲得的浮游動(dòng)物多樣性的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性不明確。因此，本研究重點(diǎn)探討不同的采樣方法對(duì)浮游動(dòng)物DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)結(jié)果的影響，為規(guī)范化的流域水生生物DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)位及樣本采集

調(diào)查點(diǎn)位位于南京市棲霞區(qū)羊山湖(118°57′E, 32°6′N(xiāo))。樣品采集設(shè)置4～5個(gè)平行樣，分別采用直接過(guò)濾法和網(wǎng)富集法采樣。

(1) 直接過(guò)濾法：直接利用過(guò)濾器過(guò)濾(濾膜孔徑為5 μm)不同體積(100，200，500和1 000 m L)的水樣，過(guò)濾后收集濾膜用于后續(xù)DNA提取。

(2) 網(wǎng)富集法：先用標(biāo)準(zhǔn)25#浮游生物網(wǎng)過(guò)濾一定體積(5，10，20和1 000 L)的水樣，對(duì)浮游動(dòng)物進(jìn)行初步富集濃縮，濃縮后的樣本再用孔徑為5 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，最后收集濾膜用于后續(xù)DNA提取。過(guò)濾體積基于水泵的流速和過(guò)濾時(shí)間換算。

1.2 核酸提取與擴(kuò)增

采用E.Z.N.A. water DNA kit 水樣提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)提取濾膜DNA。具體操作為：將濾膜裝入5 mL無(wú)菌管中，加入0.2 mg的無(wú)菌玻璃珠，加入1 mL裂解液，用MoBio Vortex-Genie2渦旋振蕩儀(美國(guó)MoBio公司)均質(zhì)10 min，之后按照試劑盒操作說(shuō)明提取DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體系為50 μL，由37.8 μL 雙蒸水, 2 μL DNA，1 μL擴(kuò)增引物，5 μL 10倍PCR高保真PCR緩沖溶液(High Fidelity PCR buffer)，2 μL 50 mmol/L的硫酸鎂，1 μL 10 mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP mix)，0.2 μL Platinum Taq DNA 聚合酶組成(美國(guó)Invitrogen公司)[13]。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 °C 預(yù)變性30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，95 °C變性10 s， 48 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，72°C延伸5 min。PCR結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，用核酸純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化，用Qubit(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行核酸定量。

1.3 高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析

不同樣本擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物被稀釋到10-2g/L 并等體積混合。用Ion Torrent PGM測(cè)序?qū)Ｓ迷噭┖?美國(guó)Lifetech公司)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序文庫(kù)測(cè)序前，用磁珠純化去除文庫(kù)中的雜質(zhì)和短片段(< 100 bp)；純化后的測(cè)序文庫(kù)用2100生物分析儀(美國(guó)Agilent公司)檢測(cè)合格后稀釋到100 pmol/L的濃度，用Ion Torrent PGM測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。

測(cè)序結(jié)束后利用Mothur fastq.info命令將測(cè)序輸出的原始FASTQ文件轉(zhuǎn)為FASTA文件和Qual質(zhì)量值文件[25]。利用QIIME軟件[26]刪除測(cè)序質(zhì)量低于Q20和引物中出現(xiàn)3個(gè)堿基以上錯(cuò)配的序列。利用UCHIME[27]識(shí)別并去除PCR過(guò)程中產(chǎn)生的嵌和子序列[28]。利用USEARCH軟件[29]對(duì)序列進(jìn)行聚類，并形成可操作分類單元(OTUs)。利用SAP和BLAST+軟件的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行OTUs序列[30]的比對(duì)和注釋，其中序列間的相似性>90%，且后驗(yàn)概率>60%的序列被注釋到種水平。序列注釋數(shù)據(jù)庫(kù)包括自建的本土物種數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI GenBank中公開(kāi)的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[31-33]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 采樣方法和體積對(duì)浮游動(dòng)物宏條形碼OTUs/序列注釋的影響

不同采樣方法和體積對(duì)浮游動(dòng)物宏條形碼測(cè)序結(jié)果的影響見(jiàn)圖1(a)—(e)，采樣體積以L為單位， 0.1～1 L為直接過(guò)濾水樣體積，5～1 000 L為浮游生物網(wǎng)富集過(guò)程中的過(guò)水體積。由圖1(a)和(b)可見(jiàn)，直接過(guò)濾法中，DNA宏條形碼測(cè)序獲得的總OTUs數(shù)量和注釋到浮游動(dòng)物OTUs數(shù)量均隨過(guò)濾體積的增加而增加；網(wǎng)富集法中，總OTUs隨著采樣體積的增加而下降，在采樣體積為5和1 000 L時(shí)，浮游動(dòng)物OTUs的數(shù)量較大。由圖1(c)可見(jiàn)，直接過(guò)濾法中，隨著過(guò)濾體積的提高，不能被注釋的未知DNA序列占比也逐漸增多，當(dāng)過(guò)濾水樣體積為1 L時(shí)，有超過(guò)40%的DNA序列無(wú)法被數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確注釋；網(wǎng)富集法中，隨著浮游動(dòng)物網(wǎng)過(guò)水體積的增加，不能夠被注釋的序列占比下降，在采樣體積為1 000 L時(shí)，僅有不到5%的未知序列。由圖1(d)可見(jiàn)，直接過(guò)濾法中，隨著采樣體積的不斷加大，浮游動(dòng)物序列占總序列的比例也逐漸下降，當(dāng)過(guò)濾水樣體積達(dá)到1 L時(shí)，浮游動(dòng)物僅占總序列的10%左右；網(wǎng)富集法中，浮游動(dòng)物所占總序列的比例隨著過(guò)水體積的增加而逐漸增加，在采樣體積為1 000 L時(shí)，有超過(guò)90%的序列都為浮游動(dòng)物。由圖1(e)可見(jiàn)，與直接過(guò)濾法相比，網(wǎng)富集法能發(fā)現(xiàn)更多的浮游動(dòng)物種類，尤其是能檢出更多枝角類和橈足類，而對(duì)于部分小型浮游動(dòng)物輪蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，直接過(guò)濾水樣對(duì)其檢出效果更好。

圖1 不同采樣方法和體積對(duì)浮游動(dòng)物宏條形碼測(cè)序結(jié)果的影響

2.2 采樣體積對(duì)浮游動(dòng)物多樣性的影響

采樣體積對(duì)浮游動(dòng)物多樣性的影響見(jiàn)圖2(a)—(d)。由圖2可見(jiàn)，直接過(guò)濾法中，大型浮游動(dòng)物(主要為枝角類和橈足類)的多樣性隨著過(guò)濾體積的增加而增加，其中大型浮游動(dòng)物多樣性在過(guò)濾體積為1 L時(shí)達(dá)到最大值；隨著過(guò)濾體積的增加，枝角類的多樣性有所增加，而橈足類的多樣性變化不明顯；小型浮游動(dòng)物輪蟲(chóng)的多樣性隨著過(guò)濾體積的增加而有所下降。網(wǎng)富集法中，大型浮游動(dòng)物的多樣性在富集5 L水樣時(shí)達(dá)到最大，10和20 L時(shí)小型浮游動(dòng)物多樣性則大幅降低，而在過(guò)濾體積達(dá)到1 000 L時(shí)多樣性再次上升，并與5 L富集體積下的多樣性基本保持一致；枝角類多樣性與中大型浮游動(dòng)物的多樣性變化趨勢(shì)基本一致；橈足類的多樣性受采樣體積的影響較小，但在采樣體積達(dá)到1 000 L時(shí)監(jiān)測(cè)的重復(fù)性更好；小型浮游動(dòng)物輪蟲(chóng)在富集體積達(dá)到1 000 L時(shí)，其多樣性達(dá)到最大值。

圖2 采樣體積對(duì)浮游動(dòng)物多樣性的影響

2.3 采樣體積對(duì)重復(fù)樣本中OTUs檢出率的影響

重復(fù)樣本的檢出率是反映采樣方法穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。浮游動(dòng)物OTUs在重復(fù)采樣時(shí)的檢出率見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，直接過(guò)濾法中，隨著過(guò)濾體積的增加，檢出率>75%的浮游動(dòng)物OTUs的數(shù)量逐漸增加，在總OTUs中的占比也呈上升趨勢(shì)，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性在不斷提高。網(wǎng)富集法中，富集體積為5 L時(shí)，4個(gè)重復(fù)樣本中檢出率>75%的OTUs占比為82%，在過(guò)水體積為10 和20 L時(shí)，這一比例分別為73%和69%，當(dāng)富集水樣體積達(dá)到1 000 L時(shí)，該比例增長(zhǎng)到 87%。由此說(shuō)明選擇1 000 L的富集體積得到的浮游動(dòng)物多樣性監(jiān)測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性最高。

圖3 浮游動(dòng)物OTUs在重復(fù)采樣時(shí)的檢出率

3 討論

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)生物監(jiān)測(cè)中，結(jié)合浮游動(dòng)物的體型大小與分布特點(diǎn)，通常用直接過(guò)濾法獲取小微型浮游動(dòng)物(如輪蟲(chóng))，用網(wǎng)富集法獲取大型浮游動(dòng)物(如橈足類和枝角類)[34]。傳統(tǒng)調(diào)查中采樣的目的是要捕獲足夠量的生物個(gè)體，以便后續(xù)依據(jù)生物的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類鑒定[35]。而DNA宏條形碼技術(shù)是通過(guò)檢測(cè)DNA分子來(lái)判斷生物存在與否，可利用有機(jī)體的組織、殘片或游離DNA，不需要獲取到生物個(gè)體[36]，因此，DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)并不能完全遵循傳統(tǒng)的采樣方式，需要結(jié)合環(huán)境DNA的自身特點(diǎn)進(jìn)行采樣。

3.1 小型浮游動(dòng)物

直接過(guò)濾水樣對(duì)小型浮游動(dòng)物的監(jiān)測(cè)效果更好。在直接過(guò)濾小體積水樣時(shí)，能捕獲到分布相對(duì)均勻且數(shù)量較多的小型浮游動(dòng)物(如輪蟲(chóng))，DNA的檢出效果更好，而對(duì)于數(shù)量較少的大型浮游動(dòng)物來(lái)說(shuō)，如橈足類，往往并不能直接富集到[34]，DNA的檢出效果也較差。而在采用網(wǎng)富集法時(shí)，由于25#浮游動(dòng)物網(wǎng)的孔徑會(huì)遺漏一些個(gè)體較小的輪蟲(chóng)，在富集體積不足時(shí)導(dǎo)致檢出的輪蟲(chóng)數(shù)量要低于直接過(guò)濾法。但是，對(duì)小型輪蟲(chóng)的遺漏可以通過(guò)增大過(guò)水體積來(lái)彌補(bǔ)不足，當(dāng)富集體積達(dá)到1 000 L時(shí)，檢出的輪蟲(chóng)多樣性與直接過(guò)濾1 L水樣時(shí)所檢測(cè)出的輪蟲(chóng)多樣性基本一致。但是，綜合考慮采樣效率和經(jīng)濟(jì)性時(shí)，采用直接過(guò)濾1 L水樣的方法更適于小型浮游動(dòng)物的檢測(cè)。

3.2 大型浮游動(dòng)物

浮游生物網(wǎng)富集對(duì)大型浮游動(dòng)物的監(jiān)測(cè)效果更好。對(duì)于大型浮游動(dòng)物而言，由于其在水體中數(shù)量少、密度低，須先用浮游動(dòng)物網(wǎng)進(jìn)行富集濃縮再進(jìn)行DNA宏條形碼的檢測(cè)。實(shí)際上，由于自然水體中“自由DNA”的存在，使得在直接過(guò)濾水樣中也能檢測(cè)出某些大型浮游動(dòng)物的OTUs。其中枝角類的多樣性隨浮游動(dòng)物網(wǎng)富集體積增加而顯著變化，富集體積為5 L時(shí)所檢測(cè)出的枝角類種數(shù)最多，該過(guò)濾體積比較適合枝角類多樣性的檢測(cè)。對(duì)于橈足類，網(wǎng)富集法所得到的物種多樣性高于直接過(guò)濾法，該結(jié)論與以往的研究結(jié)果相一致。Djurhuus等[17]比較了不同的環(huán)境DNA樣品來(lái)源對(duì)浮游動(dòng)物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)富集法相較于直接過(guò)濾法獲得的大型浮游動(dòng)物橈足類的物種數(shù)目更多。本研究中，當(dāng)富集體積達(dá)到1 000 L時(shí)，檢測(cè)出的橈足類多樣性最高，平行樣間的重復(fù)性也較好。然而，在現(xiàn)實(shí)采樣中，定量富集1 000 L的做法可操作性差，且大體積富集會(huì)降低枝角類的檢測(cè)效率，因此建議浮游動(dòng)物網(wǎng)的最佳富集體積為5～10 L。

4 展望

本研究建立了適合于浮游動(dòng)物DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)技術(shù)的采樣方法，初步實(shí)現(xiàn)了該采樣方法的標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)也為DNA宏條形碼技術(shù)在淡水水體生物多樣性監(jiān)測(cè)方面的靈活運(yùn)用提供了技術(shù)支撐。但是，浮游動(dòng)物在水中的分布受光、熱、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，不同水體類型(河流、湖泊、水庫(kù))中的浮游動(dòng)物分布也不同[37]，如海水中浮游動(dòng)物存在明顯分層[38]，河流的流速、沿岸排污口會(huì)對(duì)浮游動(dòng)物產(chǎn)生巨大影響等[39]，尤其是在開(kāi)展物種定量監(jiān)測(cè)時(shí)，采樣方法則顯得尤為重要[40]。因此在未來(lái)的浮游動(dòng)物DNA宏條形碼監(jiān)測(cè)中，要考慮上述各方面影響對(duì)浮游動(dòng)物分布的綜合作用，針對(duì)不同水體類型確定合理的采樣深度、采水方式、采樣體積等。作為一種新型監(jiān)測(cè)方法，規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化是DNA宏條形碼技術(shù)業(yè)務(wù)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。除采樣方法需要標(biāo)準(zhǔn)化外，標(biāo)志基因和擴(kuò)增引物[41]、評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選和建立[42]、生物信息學(xué)分析方法等都需要統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[43]，以提高物種監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性及監(jiān)測(cè)結(jié)果的可比性。