葛兆悅，袁善奎，張小軍，侯玉霞

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100125；3.中農(nóng)立華生物科技股份有限公司，北京 100052; 4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

農(nóng)藥從原藥加工成制劑產(chǎn)品后，其有效成分的粒徑在產(chǎn)品穩(wěn)定性、靶標(biāo)生物活性和持留期方面起著至關(guān)重要的作用。農(nóng)藥懸浮劑是原藥與助劑等分散在水中經(jīng)研磨后制得的懸浮液體，有效成分以固體微粒形式穩(wěn)定的分散在水中，微粒的粒徑通常在4μm以下，被認(rèn)為是高效、環(huán)保的水基化劑型。一般來說，農(nóng)藥粒徑減小，粒徑分布變窄，分散性和滲透性更好，生物活性越高，從而間接影響到制劑產(chǎn)品對環(huán)境非靶標(biāo)有益生物的毒性及對靶標(biāo)的生物活性，但農(nóng)藥制劑粒徑細(xì)化對設(shè)備要求高、研磨時(shí)間長、能耗也增加。因此，在實(shí)際農(nóng)藥懸浮劑劑型產(chǎn)品研發(fā)過程中，應(yīng)從經(jīng)濟(jì)性、安全性、有效性等方面綜合考慮設(shè)計(jì)粒徑大小。

本研究以3μm、1μm和300nm等不同粒徑的10%戊唑醇懸浮劑為試驗(yàn)材料，通過比較其對蜜蜂、家蠶、斑馬魚、大型溞和羊角月芽藻5種非靶標(biāo)有益生物的毒性，以及在離體條件下對赤霉菌、稻瘟病菌和小麥白粉病菌的抑菌活性和活體上黃瓜白粉病的防治效果，綜合分析粒徑大小對戊唑醇懸浮劑生態(tài)毒性和抑菌活性的影響，旨在為開發(fā)經(jīng)濟(jì)、高效和環(huán)保的農(nóng)藥懸浮劑提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑 300nm、1μm 、3μm粒徑的10%戊唑醇懸浮劑，所用助劑均為TAMOL DN、Sokalan CP-9 、1,2-丙二醇、SAG 1522、黃原膠、卡松等；95%戊唑醇原藥。

1.1.2 供試非靶標(biāo)有益生物 意大利成年工蜂，購自中國農(nóng)科院蜜蜂研究所；家蠶，蠶卵購自山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司，品種為菁松×皓月；斑馬魚，購自北京宏大高峰水族用品經(jīng)營部；大型溞和羊角月芽藻，購自中國科學(xué)院水生生物研究所。

1.1.3 供試植物病原菌 小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌、黃瓜白粉病菌菌株均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 供試植物品種 小麥品種為淮麥33，黃瓜品種為北京刺瓜。

1.2 非靶標(biāo)生物毒性測試方法

1.2.1 蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參照GB/T 31270.10[1]方法，用50%蔗糖水將供試藥劑配制不同濃度藥液，將貯蜂籠內(nèi)的蜜蜂引入試驗(yàn)籠中，飼喂器中加入試驗(yàn)藥液，供蜜蜂攝食。試驗(yàn)溫度25±2℃，相對濕度50%～70%，光照條件為黑暗，試驗(yàn)開始后24、48h觀察并記錄蜜蜂中毒癥狀及死亡數(shù)。

1.2.2 家蠶急性毒性試驗(yàn) 參照GB/T 31270.11[2]浸葉法，供試用蠶為二齡起蠶，試驗(yàn)溫度均為25±1℃，相對濕度70%～80%，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，試驗(yàn)開始后24、48、72和96h觀察并記錄家蠶中毒癥狀及死亡數(shù)。

1.2.3 大型溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn) 參照GB/T 31270.13[3]靜態(tài)法，試驗(yàn)水溫20±1℃，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，試驗(yàn)周期48h。試驗(yàn)開始后24、48h觀察并記錄大型溞的中毒癥狀和受抑制數(shù)。

1.2.4 斑馬魚急性毒性試驗(yàn) 參照GB/T 31270.12[4]靜態(tài)法，試驗(yàn)水溫24±1℃，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，每隔48h更換一次試驗(yàn)藥液，試驗(yàn)周期96h。試驗(yàn)開始后24、48、72和96h觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀及各處理的死亡數(shù)。

1.2.5 藻類生長抑制試驗(yàn) 參照GB/T 31270.13[5]方法，將綠藻染毒后放入智能人工氣候箱，培養(yǎng)溫度22±1℃，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，試驗(yàn)周期72h。試驗(yàn)開始后24、48、72h，用分光光度法測定各處理藻液細(xì)胞濃度。

1.2.6 大型溞繁殖試驗(yàn) 參照GB/T 21828-2008[6]方法，試驗(yàn)開始后每48h更換試驗(yàn)藥液，試驗(yàn)水溫20±1℃，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，試驗(yàn)周期21d內(nèi)，每24h觀察記錄產(chǎn)溞數(shù)，并取出新生幼溞。

1.3 對植物病原菌的活性測定方法

1.3.1 小麥赤霉菌的室內(nèi)毒力測定 采用菌絲生長速率法，將直徑5mm的小麥赤霉菌菌餅接種在含有系列梯度供試藥劑的PDA平板中心，于25℃培養(yǎng)96h，十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算生長抑制率。

1.3.2 稻瘟病菌的室內(nèi)毒力測定 采用菌絲生長速率法，將直徑5mm的稻瘟病菌菌餅接種在含有系列梯度供試藥劑的PDA平板中心，于25℃黑暗培養(yǎng)7d，十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算生長抑制率。

1.3.3 小麥白粉病菌的室內(nèi)毒力測定 采用離體葉段法[7]，室內(nèi)盆栽的健康小麥長至一葉一心后，剪取2cm長第一葉上部葉段，系列梯度藥液浸濕，晾干后放置在含相應(yīng)濃度供試藥劑和50mg/L苯并咪唑的固體瓊脂培養(yǎng)基表面，用抖落孢子法接種，置于恒溫培養(yǎng)箱，溫度18℃，光照/黑暗時(shí)間比16/8h，培養(yǎng)7d，按發(fā)病情況分級標(biāo)準(zhǔn)記錄病情，計(jì)算相應(yīng)的病情指數(shù)和防治效果。

1.3.4 黃瓜白粉病的防治效果測定 采用盆栽測定法[8]，黃瓜兩片真葉展開后，使用噴霧器將系列梯度藥液均勻噴灑于盆栽黃瓜葉片正面，至藥液剛好不下滴，自然晾干。 24h后收集新鮮病葉上的黃瓜白粉，配制濃度為4.0×104個(gè)/mL孢子懸浮液，均勻噴灑于盆栽黃瓜葉片。室內(nèi)溫度25℃培養(yǎng)至對照明顯發(fā)病，參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺菌劑防治黃瓜白粉病》調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算相應(yīng)的病情指數(shù)和防治效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 22.0處理試驗(yàn)結(jié)果。急性毒性試驗(yàn)分別計(jì)算供試藥劑對試驗(yàn)生物的半致死劑量(LD50)、半致死濃度(LC50)、抑制效應(yīng)濃度(EC50)，及95%置信區(qū)間，比較各藥劑之間毒性的差異顯著性。大型溞繁殖試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(P<0.05)，得出不同藥劑處理下產(chǎn)溞總數(shù)的無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)、最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)。室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)分別計(jì)算供試藥劑對病原菌生長半抑制效應(yīng)濃度(EC50)或防治效果及95%置信區(qū)間，比較各藥劑之間室內(nèi)抑菌活性的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對非靶標(biāo)生物的毒性

2.1.1 急性毒性 供試藥劑對非靶標(biāo)生物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(表1～5)。結(jié)果表明，在3個(gè)不同粒徑的10%戊唑醇懸浮劑，300nm 粒徑對蜜蜂急性經(jīng)口毒性為中毒(其他為低毒)，對家蠶急性毒性均為低毒，對大型溞、斑馬魚急性毒性均為中毒，總體上表現(xiàn)出對上述4種生物隨著粒徑變小毒性升高的趨勢。3種制劑對羊角月芽藻生長抑制毒性均為中毒，表現(xiàn)出粒徑變小毒性降低的趨勢，1μm和300nm粒徑10%戊唑醇懸浮劑 顯著低于3μm粒徑10%戊唑醇懸浮劑。

表1 對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性

表2 對家蠶的急性毒性

表3 對大型溞的急性活動(dòng)抑制毒性

表4 對斑馬魚的急性毒性

表5 對羊角月芽藻的生長抑制毒性

2.1.2 對大型溞的繁殖毒性 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間各個(gè)母溞的產(chǎn)溞總數(shù)，以供試藥劑對21d大型溞繁殖量(每只非意外死亡的親溞所產(chǎn)幼溞總數(shù))的影響作為評價(jià)指標(biāo)，基于設(shè)計(jì)濃度，得到供試藥劑處理的大型溞21d產(chǎn)溞總數(shù)NOEC為0.393mg a.i./L，LOEC為0.492mg a.i./L，不同粒劑的10%戊唑醇懸浮劑對大型溞的繁殖無顯著差異。

2.2 對植物病原菌的抑制活性

2.2.1 離體抑菌活性 粒徑為3μm、1μm、300nm的3種10%戊唑醇懸浮劑對小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果(表6～8)。結(jié)果表明，戊唑醇對不同病原菌的活性不同。對于同一種病原菌，不同粒徑的戊唑醇懸浮劑的抑菌活性無顯著差異。

表6 對小麥赤霉菌的抑菌活性

表7 對稻瘟病菌的抑菌活性

表8 對小麥白粉病菌的抑菌活性

2.2.2 活體上的抑菌活性 在活體黃瓜小苗上，50mg a.i./L濃度的3μm、1μm、300nm10%戊唑醇懸浮劑處理的黃瓜白粉防治效果分別為22.2%、27.8%、16.7%，100mg a.i./L濃度處理的防治效果分別61.1%、61.1%、66.7%，未表現(xiàn)明顯的抑菌活性差異。

3 結(jié)論與討論

有效成分顆粒粒徑是農(nóng)藥制劑重要的物理參數(shù)之一。農(nóng)藥粒徑大小對其毒性的影響早有研究，主要針對溶解度低的原藥和粉劑，如百菌清原藥、吩噻嗪、硫磺粉等[9]，通常認(rèn)為水中溶解度增加、接觸幾率的提高是生物活性提高的原因。本研究中，蜜蜂急性經(jīng)口試驗(yàn)的劑量對應(yīng)的藥劑濃度最高，遠(yuǎn)高于戊唑醇在水中的溶解度，粒徑大小對分散性能的影響最為顯著，相應(yīng)地由于對水生生毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度較低，粒徑大小的影響在溶解的過程中被削弱，所以導(dǎo)致毒性差異小或無顯著差異。與其他非靶標(biāo)生物相比，懸浮劑粒徑大小對藻類的毒性影響呈現(xiàn)不同趨勢，即粒徑越小，對藻類毒性越低，這可能是粒徑越大對藻細(xì)胞的物理吸附性越強(qiáng)，從而影響其生長。

農(nóng)藥顆粒粒徑也會(huì)影響其藥效，如早已證實(shí)顆粒粒徑在微米范圍內(nèi)，幾微米的農(nóng)藥顆粒殺菌、殺蟲活性遠(yuǎn)高于十幾微米或幾十微米的農(nóng)藥顆粒[9]。本章研究中，300nm～3μm范圍內(nèi)，粒徑大小對戊唑醇懸浮劑在離體條件下小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌的抑制活性以及在黃瓜活體上黃瓜白粉病的防治效果也無明顯影響，但更小粒徑的制劑也可能會(huì)對藥效產(chǎn)生較為顯著的影響。

綜上所述，本研究證明對于10%戊唑醇懸浮劑，在300nm～3μm粒徑范圍內(nèi)，粒徑變化對非靶標(biāo)生物的毒性有一定的影響，但對植物病原菌的活性方面沒有造成顯著影響，該制劑在300nm甚至100nm以下是否會(huì)對毒性和抑菌活性造成顯著影響尚待進(jìn)一步研究。近年來，納米農(nóng)藥已成為研究的熱點(diǎn)，農(nóng)藥制劑納米化之后是否會(huì)提高其對環(huán)境生物的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)值得關(guān)注，在實(shí)際產(chǎn)品開發(fā)中涉及有效成分粒徑范圍時(shí)應(yīng)綜合考慮提高藥效和改變環(huán)境安全性方面的影響。