楊宇辰，鄢貴龍， ，楊依晶，姚佳怡，王志倩

1. 淮陰師范學院生命科學學院（淮安 223300）；2. 江蘇省食品質(zhì)量安全與營養(yǎng)功能評價重點建設試驗室（淮安 223300）

近年來，鑒于環(huán)境污染問題日益嚴重和石化資源的不可再生性，尋找一種可持續(xù)再生的工業(yè)綠色原材料成為人們的研究熱點[1-2]，而世界上分布最廣、存量最大的可再生資源木質(zhì)纖維素成為人們的理想原料來源。然而，木質(zhì)纖維素復雜的結(jié)構(gòu)形成了很強的生物化學利用屏障，它導致了木質(zhì)纖維素分解困難，難于進一步利用[3-4]。為了降低這種抗性，使木質(zhì)纖維素易于分解，通常需要對木質(zhì)纖維素進行預處理，在預處理過程中通常使用化學或機械的方式來降低木質(zhì)纖維素復雜結(jié)構(gòu)，再進行水解，只有當這些聚合物被水解成低聚物或單體時，才能夠利用它們來生產(chǎn)人們所需的各種燃料、化學品和材料。

為了提高木質(zhì)纖維素的利用率，人們已經(jīng)對許多生物質(zhì)預處理方法進行了廣泛的研究，并開發(fā)出了各種有效的預處理方法[5-6]，如稀酸預處理[7]、稀堿預處理[8]、蒸汽爆破[9]、氨纖維爆破[10]等。但是這些方法在預處理過程中可能會產(chǎn)生大量的二次污染物，而且還會形成后續(xù)微生物發(fā)酵的抑制物[5]，因此研究人員不斷地尋找更優(yōu)的方法。近年出現(xiàn)的離子液體，可高效溶解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，為生物質(zhì)組分的分離提供了一種新方法。但是由于其存在制備成本高、有毒性和難回收等缺點，限制了離子液體在木質(zhì)纖維素預處理中的進一步應用[11-12]，因此探索新型綠色的木質(zhì)纖維素預處理方法是十分必要的，其中環(huán)境友好的低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）在生物質(zhì)高值化中的應用逐漸得到了國內(nèi)外研究人員的關注。

低共熔溶劑通常由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）之間相互作用形成，DESs是可再生的、易大量合成的新型綠色溶劑，并且具有低成本、低毒性和可生物降解等優(yōu)點，已經(jīng)在化學合成、電化學、提取分離、功能材料制造等方面有著廣泛的應用[13-14]。近年來，DESs在木質(zhì)纖維素的預處理中也有大量的研究報道[15-16]，結(jié)果表明，DESs可以高效、高純度地提取植物纖維中的木質(zhì)素，并可有效去除半纖維素，是一種較理想的木質(zhì)纖維素預處理溶劑。為了更好地利用DESs在木質(zhì)纖維素預處理中的應用，試驗以玉米芯為原料，考察不同的氯化膽堿（ChCl）類低共熔溶劑在玉米芯預處理中對其組分分離效果的影響，篩選出高效的預處理溶劑，為木質(zhì)纖維素的利用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

氯化膽堿、草酸、丙三醇、乳酸、乙二醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、木糖（國藥集團化學試劑有限公司）；纖維素酶Ctec2、半纖維素酶Htec2（諾維信生物技術有限公司）。

玉米芯，采集自江蘇淮安市，將其風干，粉碎后過0.600 mm篩，室溫儲存于密閉容器中。

1.2 主要儀器與設備

757 CRT紫外/可見分光光度計（上海精密科學儀器廠）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；MC-30S高壓滅菌器（日本ALP公司）；5410離心機（德國Eppendorf公司）；inifinte1260高效液相色譜（配備G1312C雙泵、G1322A脫氣機、G1362A RID檢測器、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱和Chemstation工作站，美國Agilent公司）。

1.3 低共熔溶劑的合成：

按表1的摩爾比分別稱取一定質(zhì)量的氯化膽堿和其他試劑加入三角瓶中，在80 ℃或常溫下使用磁力攪拌器攪拌至溶液清亮透明，即得各種低共熔溶劑。

表1 DES溶劑組成及其氫鍵供體pKa值

1.4 玉米芯低共熔溶劑預處理

將2.00 g粉碎的玉米芯與20.00 g DES混合，并在油浴中磁力攪拌處理所需時間后，冷卻至室溫，加入40 mL無水乙醇，混勻后過濾，濾餅再用40 mL無水乙醇洗滌抽濾2次，最后用50 mL純水洗滌抽濾1次，預處理后玉米芯冷凍干燥后備用。

1.5 酸水解

酸水解方法參考NERL方法[17]并進行了一定的修改。取100.0 mg預處理后的玉米芯于10 mL玻璃管中，再加入1 mL 72%硫酸，于30 ℃水浴鍋中水解1 h后，加28 mL純水混勻后置于滅菌鍋內(nèi)，于121 ℃水解1 h，取出冷卻后，上清液以分光光度法測定酸溶性木質(zhì)素，同時用HPLC測定糖含量，濾渣分析酸不溶性木質(zhì)素含量。

1.6 酶水解

取50.0 mg預處理后的玉米芯于2 mL離心管中，再加入1 mL酶液（酶液用pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制，纖維素酶、木聚糖酶濃度分別為15和7.5 mg蛋白/g生物質(zhì)），然后在旋轉(zhuǎn)混合器上于50 ℃恒溫水解72 h。反應結(jié)束后，沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫以10 000 r/min離心，上清水解液過濾后用HPLC測定水解液中各糖的含量。

1.7 糖含量的測定

水解液中糖含量采用高效液相色譜法。色譜條件：Biorad HPX-87H色譜柱，進樣量為20 μL，流動相為5 mmol/L稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，示差檢測器的溫度為35 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 DES預處理后玉米芯質(zhì)量及形態(tài)變化

以不同氫供體與氯化膽堿形成的DES處理粉碎后的玉米芯，在不同溫度條件下玉米芯的質(zhì)量回收率和形態(tài)變化分別見圖1和圖2。

圖1 不同溫度下DES預處理后玉米芯的回收率

圖2 不同溫度下DES預處理后玉米芯的形態(tài)變化

由圖1可以看出，對于草酸、甲酸、乳酸等酸類氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系，玉米芯預處理后的固體物質(zhì)回收率隨著反應溫度的升高而下降，這一結(jié)果可能意味著，更高的溫度會導致碳水化合物的更多降解和木質(zhì)素的更高去除率。其他的研究也獲得類似結(jié)果，酸類氫供體組成的DES體系對生物質(zhì)的溶解性更大，而且隨著溫度的升高固體物質(zhì)的得率下降[18-19]。由圖1也可發(fā)現(xiàn)，對于由酸性氫供體組成的氯化膽堿DES體系，隨著氫供體酸性的增強，固體物質(zhì)的回收率也有下降趨勢，這可能是由于相對低的酸度能更有效地破壞木質(zhì)素等大分子之間的連接[20]，從而將更多固體物質(zhì)溶解于DES體系中。圖2結(jié)果也進一步說明了這一可能結(jié)果。從圖2可以看出，隨著溫度的升高，預處理后的玉米芯顏色逐漸變深，在80 ℃時，預處理后的玉米芯顏色比未處理的變淺了，而當預處理溫度為140 ℃時，酸類為氫供體的氯化膽堿類DES處理玉米芯后，玉米芯顆粒被分散，而且顏色變黑，說明玉米芯中的物質(zhì)發(fā)生了較多的化學反應，生成了較多的深色成分，可能不利于其中糖類的利用。對于由乙二醇、甘油為氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系，隨著溫度的升高，玉米芯的損失量變化不明顯。據(jù)文獻報道，氯化膽堿與多元醇組成的DES體系，由于更多羥基的存在會形成更強的分子間氫鍵，其穩(wěn)定性更強，黏度更高，這需要更多的能量來降低其黏度并使其結(jié)構(gòu)松散，從而有利于滲透到木質(zhì)纖維素中并與之相互作用[21]。這一結(jié)果說明，由酸性氫供體與氯化膽堿組成的DES能較多地溶解玉米芯中的成分，而由醇類氫供體與氯化膽堿組成的DES對玉米芯中物質(zhì)的溶解性較弱。

2.2 DES預處理后玉米芯化學成分的變化

生物質(zhì)預處理的主要目的是去除木質(zhì)素和半纖維素等成分，盡可能保留纖維素成分，同時提高纖維素對酶的可水解性。因此，試驗考察了不同DES在80，100，120和140 ℃下對玉米芯預處理的效果，并分析了不同DES處理對玉米芯化學組成變化的影響，結(jié)果如圖3，圖4和圖5所示。

由圖3可以看出，不同組成的DES在不同溫度下處理玉米芯后，其成分含量有較大的區(qū)別。由草酸、甲酸、乳酸等氫鍵供體組成的DES體系預處理后，固體殘渣中的葡聚糖隨著處理溫度的升高有升高的趨勢，當溫度由80 ℃升至140 ℃時，甲酸、乳酸與氯化膽堿組成的DES處理玉米芯后，其葡聚糖分別由32.18%提高至53.21%，以及31.55%提高至55.19%，但是由草酸組成的DES在此溫度范圍內(nèi)殘渣葡聚糖變化不大，其值在48.43%～50.56%之間。殘渣中葡聚糖含量的提高可能是由于經(jīng)過預處理后，生物質(zhì)中木質(zhì)素、半纖維素等成分的脫除而引起的，這一結(jié)果可以從圖4和圖5中得出。由圖4和圖5可以看出，3種酸性DES隨著處理溫度的提高，葡聚糖對于原料的回收率在76.26%～93.10%之間，表明葡聚糖在DES預處理中相對穩(wěn)定[22]。與葡聚糖相比，木聚糖的回收率經(jīng)3種酸性DES處理后，隨著溫度的升高幾乎呈線性的降低，特別是在草酸組成的DES體系中回收率更低。在140 ℃時，木聚糖在草酸、甲酸和乳酸與氯化膽堿組成的DES體系處理后的回收率分別為2.14%，17.04%和24.94%，許多文獻[22-24]也報道了類似的結(jié)果。此外，對于3種酸組成的DES體系，木質(zhì)素的去除率和木聚糖的變化類似，隨著溫度的升高，木質(zhì)素的去除率明顯升高，其中酸可溶性木質(zhì)素的去除率均大于酸不溶性木質(zhì)素的去除率。然而，對于由乙二醇、甘油與氯化膽堿組成的DES體系，在80～140 ℃溫度范圍內(nèi)，預處理后玉米芯的組成變化不明顯，其葡聚糖的回收率均在90%以上，而木聚糖的回收率也在89%以上，雖然在140 ℃時，甘油組成的DES處理后酸可溶性木質(zhì)素的去除率達16.63%，乙二醇組成的DES處理后酸不溶性木質(zhì)素去除率達15.21%，但是因這兩種木質(zhì)素在玉米芯中含量相對較低，所以其對預處理后的玉米芯組成整體影響較小。Procentese等[25]報道對于甘油與氯化膽堿組成的DES體系，只有在高溫（150 ℃以上）下長時間處理，否則單獨用于生物質(zhì)預處理的效果不明顯，與此次試驗的結(jié)果相一致。

由圖3，圖4和圖5可以看出，溫度是影響DES處理生物質(zhì)效果的重要因素，提高溫度有利于降低DES體系的黏度，增強DES溶劑的滲透性，同時溫度的升高，DES溶劑的分子運動加劇，從而破壞木質(zhì)素、半纖維素和纖維素之間形成的復雜氫鍵網(wǎng)絡，溶解生物質(zhì)的部分木質(zhì)素、半纖維素和纖維素[21]。但是由于氯化膽堿與多元醇組成的DES體系存在更強的分子間氫鍵，其在試驗條件下對玉米芯進行預處理的效果并不明顯。

圖3 DES預處理后和未處理玉米芯部分成分含量

圖4 DES預處理后葡聚糖回收率

圖5 DES預處理后木聚糖、可溶性木質(zhì)素和酸不溶性木質(zhì)素去除率

研究結(jié)果表明，氯化膽堿為氫受體的DES體系，木聚糖的去除率及木質(zhì)素去除率與其氫供體的pKa值呈正相關性[26-28]。由圖4和圖5可以看出，隨著DES氫供體pKa值降低，DES體系酸度逐漸變?nèi)?，氫供體給出質(zhì)子的能力增強，因此其攻擊木質(zhì)素、半纖維素和纖維素之間形成的復雜氫鍵網(wǎng)絡能力也增強，從而提高了木聚糖、木質(zhì)素的去除能力，這一結(jié)論也與文獻報道相一致[20，26]。

從試驗結(jié)果來看，草酸、甲酸和乳酸為氫鍵供體與氯化膽堿組成的DES體系更適合于預處理玉米芯，用其預處理后，處理后的玉米芯可以獲得較高的葡聚糖含量，同時有效地降低了木質(zhì)素和木聚糖等半纖維素成分，有利于后續(xù)的酶解過程，提高酶解效率。

2.3 DES預處理后對玉米芯酶水解的影響

酶水解結(jié)果通常被認為是評價生物質(zhì)預處理效率的重要標準[19]。因此，對5種不同的DES預處理后的玉米芯與未處理玉米芯進行了酶水解試驗，測定了預處理后生物質(zhì)中葡聚糖酶水解率及原料中葡聚糖經(jīng)預處理后酶水解后的回收率。結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖7 DES預處理后原料葡聚糖酶水解回收率

由圖6可以看出，未處理玉米芯原料的酶水解率較低，只有13.07%，而經(jīng)過DES預處理后酶的水解率均有不同程度的提高，這可能是由于經(jīng)DES預處理后，去除了部分木質(zhì)素、半纖維素等成分，降低了纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使生物質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，提高了對酶的水解性能[29]。其中草酸和甲酸與氯化膽堿組成的DES溶劑在100 ℃預處理玉米芯后能獲得最高的酶水解率，分別為55.87%和47.54%。隨著溫度的升高，其水解率反而下降，這可能是因為在更高的溫度下，纖維素發(fā)生其它的化學反應，生成了一定的酶水解抑制物。這2種DES預處理后酶水解的葡萄糖對原料回收率也是在100 ℃時最高，與酶水解率變化趨勢相同。由乳酸、乙二醇及甘油與氯化膽堿的組成的3種DES溶劑，隨著預處理的溫度升高，其酶水解率和葡萄糖的回收率也隨之升高，Procentese等[25]也報道了類似的結(jié)果。但是乙二醇及甘油與氯化膽堿的組成的2種DES溶劑預處理后，其值變化不明顯。溫度由80 ℃提高至140 ℃時，其酶水解率由22.86%升高至32.33%，由19.07%升高至27.97%，相對較低的酶水解率可能是由其較低的木質(zhì)素和半纖維素等去除率引起的。乳酸與氯化膽堿組成的DES溶解預處理玉米芯后，其酶水解率和葡萄糖回收率均有明顯的提高，酶水解率由80 ℃的36.90%提高至140 ℃時的94.11%，葡萄糖回收率也由34.35%提高至85.00%，這一結(jié)果可能是由于溫度升高，木質(zhì)素和半纖維素等的去除率增加，從而提高了酶對纖維素的可及性，降低了木質(zhì)素等對酶的無效吸附，同時在較高溫度下預處理反應體系中沒有生成酶抑制物。由以上結(jié)果可以得出，ChCl-OA（1∶2）DES體系在140 ℃時預處理玉米芯可以獲得較高的酶水解率和葡萄糖回收率，是玉米芯預處理較好的一種綠色溶劑。

圖6 DES預處理后葡聚糖酶水解率

3 結(jié)論

DES作為生物質(zhì)預處理的潛在綠色溶劑正被日益關注著，然而在使用時還需針對不同生物質(zhì)原料進行DES溶劑體系的篩選和工藝優(yōu)化。試驗以預處理后生物質(zhì)組分變化及預處理后對酶水解效率的影響評價了5種以氯化膽堿為氫鍵受體的DES。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種有機酸為氫鍵供體的DES溶劑體系更適合處理玉米芯，而且溫度和氫鍵供體的pKa值對預處理結(jié)果有重要影響，木質(zhì)素和木聚糖等去除率隨著溫度升高而增大，pKa值的降低也有利于木質(zhì)素、木聚糖等半纖維素類物質(zhì)的去除。以乙二醇、甘油為氫鍵供體的氯化膽堿DES體系在140 ℃以下預處理玉米芯效果較差。試驗結(jié)果表明，氯化膽堿/乳酸組成的DES溶劑是玉米芯預處理的較好體系，它能有效地去除玉米芯中半纖維素和木質(zhì)素，同時保持很高的葡萄糖回收率。研究結(jié)果為發(fā)展一種具有更好的經(jīng)濟前景和環(huán)境友好型加工方法提供了一定的參考。