鄧智丹，肖 俊，李 華,*，向 海，于 輝,，韋金兌，束靖婷

（1.佛山科學技術(shù)學院，廣東省動物分子設(shè)計與精準育種重點實驗室，廣東佛山 528225；2.廣東天農(nóng)食品集團有限公司，廣東清遠 511827；3.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，江蘇揚州 225125)

公雞的早熟性和晚熟性主要以羽毛成熟性以及體成熟等進行評估。性早熟主要通過鳴叫和雞冠性狀來判別，體成熟與體重相關(guān)。本研究對種公雞進行了早熟性及晚熟性的品種比較選育，以求得到最大體重及最佳肉質(zhì)的上市日齡，增加經(jīng)濟價值。雞冠作為雞重要的第二性征，其發(fā)育程度與性腺發(fā)育有密切聯(lián)系，在接近性成熟時，體重與雞冠和性腺發(fā)育顯著相關(guān)。目前，生長曲線的擬合主要集中在體重增長規(guī)律方面，對于體重與局部生長的雞冠和睪丸生長發(fā)育的關(guān)聯(lián)分析較少。因此，本研究應(yīng)用Logistic、Gompertz和Bertalanffy 3種曲線模型擬合清遠麻公雞的體重和雞冠生長發(fā)育規(guī)律，比較分析公雞H組和L組的體重及雞冠生長發(fā)育模式的差異，找到影響早熟和晚熟群體體重和雞冠的生長拐點及兩者間的關(guān)聯(lián)，并通過組織學觀察和實時熒光定量PCR（qRT-RCR）技術(shù)探討雞冠和睪丸發(fā)育的相關(guān)性。前人研究表明，Ly1抗體反應(yīng)基因（）、熱休克蛋白家族A成員4樣基因（）、神經(jīng)外營養(yǎng)蛋白2基因（）和內(nèi)咖肽A3基因（）與雄性哺乳動物中的生殖細胞或睪丸發(fā)育有關(guān)，其是否與高矮冠組的公雞性腺發(fā)育有關(guān)，尚值得進一步研究。本研究旨在探討早熟和晚熟公雞性成熟前發(fā)育規(guī)律，為進一步深入解析性早熟和性成熟的遺傳機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗雞群為廣東天農(nóng)食品集團股份有限公司提供的清遠麻快羽（K系）公雞95只，在7周齡分為高冠組（42只，冠高介于22～29 mm為H組）和矮冠組（53只，冠高介于10～17 mm為L組），H組的冠高比L組高9.97 mm。實驗種公雞飼養(yǎng)和免疫條件與企業(yè)種公雞飼養(yǎng)和免疫條件相同。光照條件明期（Light）和暗期（Dark）時長比值為1 L:1 D；飼料營養(yǎng)水平：代謝能為10.71 MJ/kg，粗蛋白13.00%，鈣1.10%，總磷0.59%。

1.2 指標測定方法 在7～20周齡，每周測定實驗雞群的雞冠高度和體重，測定參照《NY/T 823.2004家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》執(zhí)行。

1.3 組織學分析 11周齡時分別對H組和L組公雞各解剖30只，稱睪丸重量，采集睪丸在4%多聚甲醛溶液中固定10 d。標本經(jīng)石蠟包埋切片處理，采用蘇木精-伊紅染色方法染色，制片后在光學顯微鏡100×倍數(shù)下進行觀察。

1.4 統(tǒng)計方法與擬合曲線模型 應(yīng)用Excel 2016、SPSS 20.0和Prism 8.0.1對清遠麻公雞體重和冠高進行Logistic、Gompertz和Bertalanffy 3種模型的相關(guān)計算和圖形擬合。

1.5 引物設(shè)計與合成 參照qRT-PCR SYBR Green I法引物設(shè)計要求，根據(jù)GenBank中雞的、基因序列，用軟件Primer Express 3.0設(shè)計引物，并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 基因引物序列信息

1.6 反轉(zhuǎn)錄PCR 以RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：5×RTase Reaction Buffer Mix II 2 μL，Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer（50 μM）0.5 μL，Random 6 mers Primer（100 μM）0.5 μL，Total RNA 0.5 μL，RNase free water 6 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min；85℃5 s，4℃保持至程序結(jié)束，共1個循環(huán)。

1.7 實時熒光定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用SYBR Green Ⅰ法進行熒光實時定量PCR反應(yīng)，以基因作為內(nèi)參基因進行數(shù)據(jù)的標準化處理，反應(yīng)體系：2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μM），cDNA模板1 μL，加ddHO補足至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，擴增后經(jīng)融解曲線檢測特異性。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)?；蛳鄬Ρ磉_量采用2法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 清遠麻公雞體重生長曲線及擬合分析 在7～20周齡，整個生長階段H組和L組的累計生長曲線表明了體重增長規(guī)律的一致性（圖1a），H組和L組體重生長變化在絕對生長曲線上發(fā)現(xiàn)4個生長低峰和3個生長高峰，接近性成熟時，生長速率降低（圖1b）。從相對生長曲線來看，7～12周齡時2組相對生長率均呈現(xiàn)下降趨勢，并在13周齡出現(xiàn)明顯的生長峰谷（圖1c）。

對清遠麻公雞體重曲線擬合分析（表2和圖1a）表明：Gompertz和Bertalanffy模型的擬合值（）均優(yōu)于Logistic模型，且H組和L組體重Gompertz擬合值與實際值之差的波動范圍小于Bertalanffy，因此可以確定清遠麻公雞體重的最優(yōu)擬合模型為Gompertz曲線。在Gompertz模型中，H組和L組的體重增長拐點時間均為8周齡左右，但L組拐點體重大于H組。在7～20周齡，2組間體重差異不顯著。

表2 清遠麻公雞體重3種曲線模型擬合相關(guān)參數(shù)值

圖1 清遠麻公雞K系不同周齡體重生長發(fā)育曲線及Gompertz模型擬合

2.2 清遠麻公雞雞冠生長曲線分析 7～20周齡期間，雞冠的累積生長曲線表明：H組和L組雞冠高度差異逐漸減小，部分矮冠公雞后期出現(xiàn)補償生長的現(xiàn)象（圖2a），其呈現(xiàn)由陡到平緩的“S”型曲線上升，該結(jié)果與體重生長規(guī)律一致；雞冠的絕對生長值在10～11周齡出現(xiàn)一谷一峰（圖2b），但公雞雞冠生長發(fā)育仍然保持較高的生長水平，在公雞接近性成熟時，雞冠生長速度放緩（圖2b和2c）。

圖2 清遠麻公雞K系不同周齡雞冠生長發(fā)育曲線

對清遠麻公雞冠高度曲線擬合分析（表3、表4）表明：Gompertz和Bertalanffy模型擬合度較優(yōu)，但H組和L組冠高Gompertz擬合值與實際值之差與Bertalanffy相差無幾，結(jié)合體重曲線擬合分析，確定Gompertz曲線為最優(yōu)擬合模型。雞冠生長的拐點時間H組和L組的組間差均約為2周，其中最佳的Gompertz擬合模型的拐點時間分別約為7周和9周。H組公雞的冠高在7～13周齡極顯著大于L組，在14～16周齡顯著大于L組，在17～20周齡與L組差異不顯著。

表3 清遠麻公雞雞冠3種曲線模型擬合相關(guān)參數(shù)值

表4 清遠麻公雞雞冠高度實測值與擬合值

2.3 清遠麻公雞11周齡體重、雞冠和睪丸發(fā)育的分析

2.3.1 H組和L組公雞相關(guān)性狀的比較及關(guān)聯(lián)性分析11周齡的公雞，其雞冠絕對生長值出現(xiàn)峰值（圖2），此時H組和L組的體重差異不顯著（圖3a），冠高H組極顯著高于L組（圖3b），且睪丸重是L組的4.3倍（圖3c）。

圖3 11周齡清遠麻公雞H組和L組的相關(guān)性狀顯著性及相關(guān)系數(shù)分析

公雞的體重與雞冠相關(guān)差異均不顯著，睪丸重和雞冠高度呈現(xiàn)極顯著的強正相關(guān)，表明雞冠和睪丸的生長發(fā)育具有重要的關(guān)聯(lián)性。

2.3.2 H組和L組睪丸組織的形態(tài)變化 11周齡的矮冠公雞睪丸的生精小管較小，管腔中央形成較大空腔，管壁細胞松散且數(shù)量較少（圖4a）。與L組相比較，H組生精小管形態(tài)完整發(fā)育較好，生精上皮細胞層數(shù)多，管壁厚、管徑大，基膜與管壁完整（圖4b），表明H組公雞不僅雞冠高度和表型優(yōu)于L組，睪丸發(fā)育程度也優(yōu)于矮冠公雞。

圖4 11周齡雞高冠和矮冠公雞睪丸曲精細管發(fā)育

2.4 候選基因表達結(jié)果 利用qRT-PCR對8周齡高矮冠公雞的睪丸差異表達分析中差異倍數(shù)較大的候選基因（）進行表達分析。和在L組表達量極顯著高于H組；在L組表達量顯著高于H組（圖5），表明這4個候選基因可能與雞冠和睪丸發(fā)育有關(guān)。

圖5 候選基因在8周齡H組和L組睪丸中的表達

3 討 論

生產(chǎn)中，早熟和晚熟公雞的選育主要根據(jù)打鳴、雞冠大小、羽毛成熟度等來判斷，除通過雞冠表型直接判斷外，借助最優(yōu)的生長曲線模型能更準確預(yù)測雞冠生長和性成熟的早晚，合理選育不同發(fā)育類型的種公雞。生長曲線能綜合不同時期的測定數(shù)據(jù)，直觀地分析禽類生長發(fā)育的基本規(guī)律，為家禽選育中綜合經(jīng)濟指標的制定提供依據(jù)，其模型準確性受樣本大小、環(huán)境、年齡和記錄時間長短等影響，如超過90%則能較為準確地預(yù)測生長期的增長規(guī)律。

本研究對清遠麻公雞體重和冠高的擬合均表明了Gompertz模型最優(yōu)，這與劉雙艷等人的結(jié)論一致。H組體重及冠高拐點均早于L組，盡管L組拐點體重較H組稍大，但整個生長期組間體重差異不顯著，L組是否可望培育成體重偏大的雞，值得進一步大群體實驗予以驗證。一般而言，上市日齡越短，其肉質(zhì)越嫩，脂肪沉積較低，因此慢速型雞較快速型雞的肌肉更具風味。生產(chǎn)中，H組和L組公雞可分別育成早熟系和晚熟系，這可避免育種成本的浪費。H組和L組11周齡的雞冠高度和睪丸總重差異顯著，且兩者呈極顯著強正相關(guān)，并從組織學上得到了印證，這與季從亮等的結(jié)論相似。

本研究表明公雞的雞冠局部生長與體重生長規(guī)律相似，但早期性征發(fā)育與體重相關(guān)性較小，間接表明對公雞早熟性的選育影響體重較小。由于體重生長拐點為8周齡，因此本研究采集8周齡H組和L組公雞睪丸進行熒光定量驗證分析，并且選擇與睪丸或精細胞發(fā)育相關(guān)的基因作為候選基因，并對這4個候選基因進行了初步分析。其中，基因與男性生殖細胞有關(guān)，和基因與精子的質(zhì)量有關(guān)，在睪丸中優(yōu)先表達，其均未見在公雞中報道。本研究結(jié)果表明，這些基因與公雞睪丸發(fā)育有關(guān)，但其是否與公雞雞冠的發(fā)育相關(guān)，尚需通過閹雞實驗進一步驗證。性成熟是多基因調(diào)控的生理過程，需通過早期雞冠發(fā)育程度將公雞群體細分為早熟性和晚熟性品種，從而探尋雞冠-體重-睪丸間發(fā)育規(guī)律與聯(lián)系，為后續(xù)精準解析優(yōu)質(zhì)雞性早熟過程提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

7～20周齡性成熟早的H組公雞的雞冠表型優(yōu)于性成熟晚的L組，其組間體重增長差異不顯著；Gompertz模型對清遠麻雞公雞冠高和體重擬合效果最優(yōu)。在11周齡，H組與L組體重差異不顯著，但2組冠高和睪丸總重差異顯著，雞冠高度和睪丸總重呈極顯著正相關(guān)。公雞性成熟前發(fā)育規(guī)律以及4個候選基因表達與睪丸發(fā)育存在一定的聯(lián)系，這些條件均可為早熟性和晚熟性品系選育提供一定的理論基礎(chǔ)。