付春正，王 暉，Alireza Asem，郭慧芳，錢彬彬，劉文茹，沈春陽

(1.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北 承德 067000；2.海南熱帶海洋學(xué)院(海南三亞)水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南 三亞 572000；3.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；4.唐山金名學(xué)校，河北 唐山 063000)

外來物種入侵是指生物物種由原產(chǎn)地通過人為或非人為的方式遷移到新的生態(tài)環(huán)境的過程。外來物種的入侵不僅會(huì)影響當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境的生物多樣性，還會(huì)影響當(dāng)?shù)氐纳锶郝浣Y(jié)構(gòu)。雖然只有約1%的外來物種會(huì)在新的生態(tài)環(huán)境中成功定殖，但這些成功定殖的外來物種將會(huì)給當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境帶來深遠(yuǎn)的影響和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。外來物種適應(yīng)新環(huán)境的能力主要取決于該物種的遺傳多樣性，在入侵新的生態(tài)環(huán)境過程中，外來物種很可能由于入侵種群個(gè)體數(shù)量較少引發(fā)遺傳漂變，進(jìn)而造成外來物種種群遺傳多樣性降低，甚至可能會(huì)造成外來物種的入侵失敗。因此，外來物種的遺傳多樣性是其能否在新的環(huán)境中成功入侵和擴(kuò)張的一個(gè)重要因素。

鹵蟲(Brine Shrimp)又名豐年蟲，是一種小型甲殼動(dòng)物，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，鰓足亞綱(Branchiopoda)，無甲目(Anostraca)，鹵蟲科(Artemiidae)，鹵蟲屬()。鹵蟲具有獨(dú)特的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，可以在高鹽(7.0～340 g/L)和復(fù)雜離子成分等極端環(huán)境條件下生存，因此主要棲息于高鹽生境中，如內(nèi)陸鹽湖、沿海鹽場(chǎng)、鹽池和瀉湖等，在世界各大陸的鹽湖、鹽田、海洋等高鹽水域均具有廣泛的分布。鹵蟲廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，是幼魚、幼蝦的理想開口飼料。二十一世紀(jì)初，伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國年需鹵蟲卵超過2 000 t(粗品)，而當(dāng)時(shí)我國年產(chǎn)鹵蟲卵僅為 1 200～1 500 t(粗品)。自1950年起，美國主要鹵蟲產(chǎn)區(qū)(大鹽湖和舊金山灣)的鹵蟲，開始被出口到世界各地的漁業(yè)孵化場(chǎng)用于幼魚、幼蝦的養(yǎng)殖。舊金山鹵蟲()具有較高的繁殖率和較強(qiáng)的適應(yīng)性，被許多國家及地區(qū)引入以滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的需求，除美洲大陸外，亞歐大陸的諸多區(qū)域也有舊金山鹵蟲的分布。

為滿足我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展需求，舊金山鹵蟲于1991年首次被引種至我國渤海灣地區(qū)，包括：輕工業(yè)部制鹽研究所實(shí)驗(yàn)場(chǎng)、塘沽鹽場(chǎng)、漢沽鹽場(chǎng)和南堡鹽場(chǎng)，使當(dāng)?shù)佧u蟲產(chǎn)量提高了30%～100%。歷時(shí)20余年，舊金山鹵蟲已遍及我國東部多個(gè)沿海地區(qū)，其不僅存在于渤海灣地區(qū)，在黃海地區(qū)及東海地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)舊金山鹵蟲分布。前人的研究多只利用形態(tài)學(xué)特征、同工酶遺傳標(biāo)記、微衛(wèi)星分子標(biāo)記等研究不同鹵蟲品種、品系的群體多樣性及遺傳分化，目前尚未有研究報(bào)道利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ(:Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ)基因研究入侵至中國渤海灣地區(qū)的舊金山鹵蟲種群的遺傳多樣性及遺傳分化。本研究通過對(duì)河北省唐山市曹妃甸區(qū)南堡鎮(zhèn)銀海食鹽有限公司鹽田的舊金山鹵蟲種群的線粒體基因序列進(jìn)行測(cè)序，分析該種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，并與美國的舊金山鹵蟲大鹽湖種群(The Great Salt Lake)和舊金山灣種群(San Francisco Bay)的基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，從而了解入侵至中國渤海灣地區(qū)的舊金山鹵蟲在新環(huán)境下的種群遺傳分化及適應(yīng)性變化，為進(jìn)一步將舊金山鹵蟲引入至我國其它地區(qū)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與基因組DNA提取

本研究使用的舊金山鹵蟲樣本，計(jì)20個(gè)，采集于河北省唐山市曹妃甸區(qū)南堡鎮(zhèn)銀海食鹽有限公司(39°06′N， 118°36′E)(以下簡稱舊金山鹵蟲南堡種群)(圖1)。按照Chelex-100(Bio-Rad, USA)基因組DNA提取方法提取鹵蟲基因組DNA。

1.2 COI基因序列擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增線粒體基因引物為1 / 2COI _ Fol、F：5’-ATT CTA CGA ATC ACA AGG ATA TTG G-3’、R：5’-TAC ACT TCA GGA TGG CCA AAA AAT CA - 3’，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包括2 × EasyTaqPCR SuperMix 10 μL，ddHO 8 μL，正反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序獲得的基因序列利用MEGA v7.0.26采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算序列堿基組成、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)等參數(shù)。利用核苷酸BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)驗(yàn)證測(cè)序樣本為舊金山鹵蟲。利用Network program v5.0.0.3中的median-joining算法進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)分析，檢測(cè)樣本的遺傳分化，從而確定舊金山鹵蟲南堡種群與美國大鹽湖種群及舊金山灣種群的遺傳分化關(guān)系。舊金山鹵蟲大鹽湖種群及舊金山灣種群的線粒體基因序列下載自NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore，表1)。利用軟件Arlequin v3.5計(jì)算每個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型比(Hr)、核苷酸(基因)多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(k)、期望雜合度、群體遺傳分化指數(shù) (FST)和分子方差分析AMOVA。

表1 美國大鹽湖和舊金山灣的舊金山鹵蟲COI基因序列GenBank登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列特征

本研究共測(cè)序獲得20條基因序列，利用核苷酸BLAST比對(duì)，確定本研究采集的20個(gè)鹵蟲樣本均為舊金山鹵蟲。舊金山鹵蟲南堡種群樣本的基因序列具有9個(gè)變異位點(diǎn)，包括簡約信息位點(diǎn)7個(gè)、自裔位點(diǎn)2個(gè)。而舊金山鹵蟲大鹽湖種群樣本的基因序列具有11個(gè)變異位點(diǎn)，包括簡約信息位點(diǎn)7個(gè)、自裔位點(diǎn)4個(gè)；舊金山鹵蟲舊金山灣種群樣本的基因序列含有7個(gè)變異位點(diǎn)，包括簡約信息位點(diǎn)6個(gè)、自裔位點(diǎn)1個(gè)。

2.2 種群遺傳多樣性

舊金山鹵蟲南堡種群、大鹽湖種群及舊金山灣種群的遺傳多樣性信息見表2。相比于舊金山鹵蟲大鹽湖種群和舊金山灣種群，舊金山鹵蟲南堡種群具有較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，這表明，相比于美國本土的舊金山鹵蟲種群，入侵并定殖于中國唐山市南堡地區(qū)的舊金山鹵蟲種群具有更豐富的遺傳多樣性。

表2 三個(gè)鹵蟲種群的遺傳多樣性信息

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

基于舊金山鹵蟲南堡種群、大鹽湖種群及舊金山灣種群共計(jì)86個(gè)樣本的基因序列共檢測(cè)到10種單倍型，其中H1、H2和H3為主要單倍型，分別占總數(shù)的34.88%(30個(gè)樣本)、32.56%(28個(gè)樣本)和22.10%(19個(gè)樣本)，見圖1、表3。舊金山鹵蟲南堡種群樣本分布在6個(gè)單倍型中，主要單倍型為H3型(55.00%)，見圖1、表4。H3型分別由57.89%的南堡種群樣本、10.52%的大鹽湖種群樣本和31.59%的舊金山灣種群樣本組成(見圖1、表5)。舊金山鹵蟲大鹽湖種群樣本分布在6個(gè)單倍型中，主要單倍型為H2型(72.40%)。H2型分別由75.00%的大鹽湖種群樣本、10.72%的南堡種群樣本和14.28%的舊金山灣種群樣本組成(見圖1、表4、表5)。舊金山灣種群分布在4個(gè)單倍型中，主要單倍型為H1型(70.27%)。H1型分別由86.66%的舊金山灣種群樣本、10.00%南堡種群樣本和3.34%大鹽湖種群樣本組成(見圖1、表4、表5)。

表3 三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)單倍型分析的樣本數(shù)量及比例

表4 三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)包含的單倍型、樣本數(shù)量及比例

表5 三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)單倍型分析內(nèi)各種群樣本的數(shù)量及比例

圖1 基于COI基因序列構(gòu)建的三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

舊金山鹵蟲南堡種群、大鹽湖種群及舊金山灣種群三個(gè)種群兩兩之間均存在顯著的遺傳分化(= 0.000 1)，南堡種群和大鹽湖種群的遺傳分化指數(shù)值(F)最低，為0.29；大鹽湖種群和舊金山灣種群的遺傳分化指數(shù)值()最高，為0.56(見表6)。三個(gè)舊金山鹵蟲種群的分子方差分析(AMOVA)表明，舊金山鹵蟲的遺傳變異主要來源于種群內(nèi)部個(gè)體之間，占總變異的55.01%，種群之間的遺傳變異占44.99%(見表7)。

表6 三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)間遺傳分化指數(shù)(FST，對(duì)角下方)及顯著性檢驗(yàn)(P，對(duì)角上方)

表7 三個(gè)舊金山鹵蟲種群(南堡種群、大鹽湖種群和舊金山灣種群)分子方差分析(AMOVA)

3 討論與結(jié)論

3.1 舊金山鹵蟲南堡種群的遺傳多樣性

外來物種在被引入至新環(huán)境后，通常由于奠基者效應(yīng)或者種群定殖過程中的群體遺傳瓶頸效應(yīng)等因素，會(huì)導(dǎo)致引入種群的遺傳多樣性較低。如越南永州地區(qū)引入的舊金山鹵蟲種群，相比于種源地舊金山灣的舊金山鹵蟲種群，其表現(xiàn)出更低的種內(nèi)遺傳變異和更少的單倍型多樣性。然而相比于美國大鹽湖地區(qū)的舊金山鹵蟲種群，亞洲地區(qū)引入的舊金山鹵蟲種群表現(xiàn)出相對(duì)較高的遺傳多樣性。地中海鹵蟲的引入種群中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn)，相比舊金山鹵蟲種源地種群(大鹽湖種群和舊金山灣種群)，引入并定殖于中國渤海灣地區(qū)的南堡種群表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性。在新環(huán)境中引入并定殖的種群可能是由于自身具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和生理可塑性，在不同選擇壓力的作用下，引入種群的遺傳分化模式受到一定影響，進(jìn)而表現(xiàn)出了相對(duì)較高的遺傳多樣性。

3.2 舊金山鹵蟲南堡種群的引種來源

線粒體基因組DNA具有進(jìn)化速率快、母系遺傳和缺乏重組的特征，因此線粒體基因組分子標(biāo)記對(duì)于分析在新環(huán)境中定殖的外來物種的來源和系統(tǒng)分化具有重要的作用。利用線粒體基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行的系統(tǒng)地理分析表明：地中海區(qū)域的入侵舊金山鹵蟲種群來源于美國的大鹽湖種群和舊金山灣種群，而亞洲引入的舊金山鹵蟲種群的定殖過程經(jīng)歷了多次種源引入，即首先由美國的種源地群體引入，而后又經(jīng)歷了歐洲群體的二次引入。本研究中，舊金山鹵蟲南堡種群、大鹽湖種群及舊金山灣種群共檢測(cè)到10種單倍型，其中H1、H2和H3為主要單倍型，分別以舊金山灣種群(86.66%)、大鹽湖種群(75%)和南堡種群(57.89%)為主。這一結(jié)果表明舊金山鹵蟲南堡種群并非來源于大鹽湖種群和舊金山灣種群。舊金山鹵蟲南堡種群與大鹽湖種群及舊金山灣種群具有顯著的群體遺傳分化指數(shù)F值也表明：舊金山鹵蟲南堡種群并非來源于大鹽湖種群和舊金山灣種群。舊金山鹵蟲南堡種群可能從其他舊金山鹵蟲入侵地區(qū)間接引入的，如東亞的湄公河三角洲(越南)和渤海灣(中國)地區(qū)，這些地區(qū)舊金山鹵蟲已經(jīng)完全商品化并可在水產(chǎn)養(yǎng)殖市場(chǎng)上購買獲得。

本研究通過利用河北省唐山市曹妃甸區(qū)南堡鎮(zhèn)銀海食鹽有限公司鹽田的舊金山鹵蟲種群的線粒體基因進(jìn)行測(cè)序，分析該種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，并與美國的大鹽湖種群和舊金山灣種群的線粒體基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)相比于美國本土的舊金山鹵蟲種群，入侵并定殖于中國唐山市南堡地區(qū)的舊金山鹵蟲種群具有更豐富的遺傳多樣性。而且舊金山鹵蟲南堡種群與美國大鹽湖種群和舊金山灣種群存在顯著的遺傳分化，表明舊金山鹵蟲南堡種群并非是從美國大鹽湖種群和舊金山灣種群直接引入的。與陸地、海洋及淡水環(huán)境相比，高鹽生境系統(tǒng)的物種種類和數(shù)量通常有限，這使得高鹽生境內(nèi)的生物多樣性更加脆弱，而外來物種的引入將對(duì)高鹽生境內(nèi)的生物多樣性帶來更大的威脅。舊金山鹵蟲作為渤海灣區(qū)域高鹽生境的外來物種，對(duì)于渤海灣的高鹽環(huán)境有較好的適應(yīng)，表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性，因此后續(xù)研究可將舊金山鹵蟲作為高鹽生境中入侵生物的模式生物，研究外來物種對(duì)高鹽生境的生物效應(yīng)，尤其是研究舊金山鹵蟲的引入對(duì)于高鹽生境內(nèi)其它生物遺傳變異模式的影響。