陳賦秋雪，唐思琪*，袁昊，馬子軒，陳坦, ，楊婷, ，張冰, ，劉穎,

1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中央民族大學(xué)北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081

人類活動(dòng)產(chǎn)生的塑料制品在環(huán)境中暴露，經(jīng)風(fēng)化等作用后，破碎成尺寸小于5 mm的塑料稱為微塑料（Richard et al.，2004；Law et al.，2014），常見聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）等材質(zhì)（Cole et al.，2011；侯軍華等，2020）。微塑料粒徑小、質(zhì)量輕，能在外力作用下遠(yuǎn)距離遷移，在水體、土壤、大氣等介質(zhì)中普遍檢出（Alimi et al.，2018；邵媛媛等，2020），可進(jìn)入生物體（Chae et al.，2018；任欣偉等，2018）。每年進(jìn)入農(nóng)業(yè)用地中的微塑料量極大，可能超過海洋中微塑料的總量（Nizzetto et al.，2016）。農(nóng)膜的廣泛應(yīng)用是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中土壤微塑料的主要來源之一（任欣偉等，2018；胡桂林，2019）。

土壤是人類農(nóng)業(yè)活動(dòng)的重要介質(zhì)，作物的生長(zhǎng)不可避免地受到土壤環(huán)境中微塑料等各種物質(zhì)的影響。微塑料可改變土壤的物理、化學(xué)和生物特性，直接或間接影響植物的生長(zhǎng)（Wan et al.，2019；Shi et al.，2022）。已有研究表明，100 nm的聚苯乙烯微塑料降低了蠶豆（Vicia faba）根系生物量和過氧化氫酶活性，對(duì)其植株生長(zhǎng)有抑制作用（Jiang et al.，2019）。亞微米級(jí)球狀微塑料被植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累，可隨蒸騰作用和營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸從根部轉(zhuǎn)移到莖、葉等上部器官（Li et al.，2020），進(jìn)入細(xì)胞連接或細(xì)胞壁孔隙，造成細(xì)胞破損，影響營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸及植株生長(zhǎng)（李連禎等，2019），從而影響作物代謝、發(fā)育特性，進(jìn)而影響作物和土壤生態(tài)環(huán)境，甚至可能在作物中生物富集，通過食物鏈威脅人體健康（Kong et al.，2018；駱永明等，2018）。在作物萌發(fā)及生長(zhǎng)初期，種子各項(xiàng)生理活動(dòng)活躍，對(duì)外界環(huán)境敏感，且與作物幼苗后續(xù)生長(zhǎng)密切相關(guān)，觀察種子萌發(fā)和早期幼苗生長(zhǎng)情況是目前評(píng)估高等植物生理毒性的重要方法（Gong et al.，2001）。分析微塑料對(duì)不同作物萌發(fā)和生長(zhǎng)初期的影響，對(duì)認(rèn)識(shí)微塑料的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及毒性具有重要意義。

農(nóng)業(yè)環(huán)境中的微塑料已引起廣泛關(guān)注，目前關(guān)于微塑料對(duì)萌發(fā)和生長(zhǎng)初期農(nóng)作物影響方面的研究尚待深入。由于具有良好的化學(xué)性能和較低的價(jià)格，PS常被用于如農(nóng)膜等各種產(chǎn)品的生產(chǎn)，因此也已成為當(dāng)前土壤生態(tài)系統(tǒng)中最常見的污染物之一（Dong et al.，2020）。因此，本文以農(nóng)膜常用材料PS為例，選擇中國(guó)種植面積廣、產(chǎn)量大的主要糧食作物小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、谷子（Setaria italica）及重要經(jīng)濟(jì)作物花生（Arachis hypogaea）、向日葵（Helianthus annuus），觀測(cè) 5 μm聚苯乙烯微塑料（5 μm-MPs）懸浮液中幾種作物種子發(fā)芽及污染土壤中幼苗生長(zhǎng)情況，分析微塑料對(duì)作物種子及幼苗生理生化指標(biāo)的影響，為揭示微塑料對(duì)作物的生態(tài)毒性作用機(jī)制積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥種子、花生、玉米、向日葵、谷子種子分別選購(gòu)魯豐濟(jì)麥22、山東紅皮花生、水果玉米中農(nóng)甜488、美國(guó)矮向日葵、黃谷小米黃金谷21。土培基質(zhì)購(gòu)自黑龍江楊曉東育苗基質(zhì)加工廠生產(chǎn)，由有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土、木屑、細(xì)椰糠、珍珠巖、蛭石等混合制備，微塑料含量極少，含水率25%—30%，可溶性有機(jī)碳（DOC）、可溶性全氮（DTN）、可溶性硝態(tài)氮（DNN）、可溶性銨態(tài)氮（DAN）、可溶性有機(jī)氮（DON）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 (120.00±13.79)、(91.43±13.46)、(38.87±2.97)、(10.33±4.61)、(42.27±15.72)mg·kg?1。5 μm-MPs 粉末購(gòu)自蘇州瑞納新材料科技有限公司，聚苯乙烯材質(zhì)，標(biāo)稱粒度5 μm。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒選用北京索萊寶科技有限公司的BC0170型SOD活性檢測(cè)試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子發(fā)芽試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參考Sjollema et al.（2016）、連加攀等（2019）、廖苑辰等（2019）、劉鎣鎣等（2019）報(bào)道。種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)選用5種作物種子（小麥、花生、玉米、向日葵、谷子），設(shè)置7個(gè)外加5 μm-MPs質(zhì)量濃度梯度（0、2、5、10、20、50、100 mg·L?1），3個(gè)重復(fù)。分別將0.4、1、2、4、10、20 mg 5 μm-MPs及2滴Tween 20溶液稀釋于200 mL超純水中，超聲水浴制備各質(zhì)量濃度梯度的5 μm-MPs懸浮液。將經(jīng)過去離子水浮選和1.5% H2O2溶液浸泡后的參試種子用去離子水反復(fù)沖洗并浸泡6 h后，均勻置于鋪有兩層濾紙并以去離子水潤(rùn)濕的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿10粒（谷子種子體積過小，每皿50粒）。培養(yǎng)皿中分別加入10 mL 0、2、5、10、20、50、100 mg·L?1微塑料懸浮液（超純水配置），在25 ℃無光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，從第3天開始打開培養(yǎng)皿每天補(bǔ)充1—2 mL去離子水以補(bǔ)償蒸發(fā)水分。

第3、5、7天分別觀測(cè)發(fā)芽數(shù)和芽長(zhǎng)。小麥胚根長(zhǎng)度超過2 mm記為發(fā)芽，玉米露白超過0.5 mm記為發(fā)芽，花生及向日葵胚根突破種皮且長(zhǎng)度超過種子的一半記為發(fā)芽，谷子萌發(fā)露白即視為發(fā)芽。種子的發(fā)芽情況及活力指數(shù)的計(jì)算公式如下：

式中：

Rg——發(fā)芽率；

N7——7 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)；

N——供試種子總數(shù)；

Ig——發(fā)芽指數(shù)，單位為d?1；

Gt——t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；

t——對(duì)應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

Iv——活力指數(shù)，單位為 g·d?1；

m7——第7天的苗干質(zhì)量，單位為g；

tg——平均發(fā)芽時(shí)間，單位為d；

F——種子在第t天的新發(fā)芽數(shù)；

Ri——抑制率；

C7——7 d內(nèi)對(duì)照組發(fā)芽數(shù)。

1.2.2 土培試驗(yàn)

土培試驗(yàn)采用盆栽。選用3種作物種子（小麥、玉米、花生），設(shè)置4個(gè)外加5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（0、20、50、100 mg·kg?1，以土壤鮮質(zhì)量計(jì)），每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行重復(fù)，按1.2.1方法配制懸浮液，在花盆內(nèi)加入約 3.75 kg土壤與懸浮液攪拌均勻，以超純水調(diào)節(jié)土壤含水率至約40%，制成微塑料梯度污染土壤。種子預(yù)處理方法同種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)方法，播種于土壤約1 cm深處，每盆15粒，室溫、自然光照下培養(yǎng)，每隔1天澆1次去離子水保持土壤濕度大體穩(wěn)定（約40%）。

種子發(fā)芽破土后每隔2天記錄幼苗生長(zhǎng)情況，在第1片葉片達(dá)到約3 cm寬后每隔4 d用葉綠素測(cè)定儀（北京金科利達(dá)，TYS-4N型）測(cè)量葉片葉綠素相對(duì)含量SPAD值、氮含量。在加入5 μm-MPs懸浮液前及33 d土培試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理從各平行組分別取 10 g土壤樣品混合均勻得到混合土壤樣品。以 0.01 mol·L?1CaCl2溶液浸提法（固液比1?10，平衡時(shí)間2 h）處理混合土壤樣品得到浸出液，按照HJ 501—2009、HJ 668—2013等標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定混合土壤樣品浸出液的DOC、DTN；按標(biāo)準(zhǔn)方法NY/T 1116—2014測(cè)定混合土壤樣品中的DNN、DAN，以差值法計(jì)算可DON含量。在種植33 d時(shí)，稱取鮮質(zhì)量0.2 g作物葉片研缽粉碎加入25 mL 80%丙酮充分浸泡 10 min，離心（4800 r·min?1，10 min）后取上清液，使用酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x，美國(guó)Molecular Devices）測(cè)定663 nm（葉綠素a）、645 nm（葉綠素b）處的吸光度，計(jì)算葉綠素a和葉綠素b含量。平行組中分別取等量葉片，剪碎混勻后稱量0.1 g（鮮質(zhì)量），以SOD試劑盒法測(cè)定樣品中SOD的活性。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用顯著性差異分析統(tǒng)計(jì)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 水培條件下5 μm-MPs對(duì)作物發(fā)芽的影響

微塑料往往通過土壤水直接與植物作用，在作物生長(zhǎng)初期，種子對(duì)土壤水更敏感。種子發(fā)芽試驗(yàn)可直觀反映微塑料對(duì)種子發(fā)芽的影響，是通過觀察作物種子發(fā)芽情況來評(píng)估生理毒性的重要方法。以微塑料 2、5 mg·L?1為低質(zhì)量濃度，10、20 mg·L?1為中質(zhì)量濃度，50、100 mg·L?1為高質(zhì)量濃度。

萌發(fā)期的種子對(duì)外界環(huán)境因子敏感，種子發(fā)芽率和抑制率可以反映種子的萌發(fā)能力。如圖 1a、b所示，綜合兩個(gè)指標(biāo)可知，各質(zhì)量濃度5 μm-MPs處理組中小麥發(fā)芽均受抑制；玉米、向日葵除部分高質(zhì)量濃度（玉米為 100 mg·L?1，向日葵為 50 mg·L?1）表現(xiàn)為促進(jìn)外其余質(zhì)量濃度均表現(xiàn)為抑制；谷子為5 μm-MPs低質(zhì)量濃度無影響，中高質(zhì)量濃度發(fā)芽得到促進(jìn)。水培中5 μm-MPs對(duì)上述4種作物萌發(fā)能力的影響盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上不顯著，但趨勢(shì)大多與微塑料可抑制或延緩種子發(fā)芽的報(bào)道一致（紀(jì)紅等，2021）。各質(zhì)量濃度處理組中花生萌發(fā)能力均受到抑制，且表現(xiàn)為5 μm-MPs質(zhì)量濃度越大，發(fā)芽受到的抑制越明顯，20、50、100 mg·L?1處理組中花生的萌發(fā)能力受到顯著抑制（P<0.05），100 mg·L?1處理組花生發(fā)芽率最低 (43.33%±5.77%)，抑制率達(dá)到125.56%。綜上所述，不同作物種子萌發(fā)對(duì)微塑料的敏感度存在差異。

發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)體現(xiàn)種子活力，這兩個(gè)指標(biāo)越大則種子活力越強(qiáng)，種子在試驗(yàn)條件下生長(zhǎng)情況越好。如圖1c、d所示（谷子苗干質(zhì)量過小，未測(cè)算活力指數(shù)），小麥表現(xiàn)為50 mg·L?1質(zhì)量濃度處理組種子發(fā)芽指數(shù)顯著降低，其余質(zhì)量濃度無顯著差異；花生種子活力表現(xiàn)為中高質(zhì)量濃度處理組（20—100 mg·L?1）顯著降低，且 5 μm-MPs質(zhì)量濃度越高種子活力降低幅度越大，在100 mg·L?1時(shí)達(dá)到最低，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別僅為 5.51 d?1、31.34 g·d?1；玉米、谷子、向日葵種子活力對(duì)微塑料不敏感，除向日葵在部分處理組（5—20 mg·L?1）得到促進(jìn)外其余均抑制，但各質(zhì)量濃度處理組均無顯著影響?？傮w上，水培條件下花生對(duì)較高質(zhì)量濃度微塑料更敏感，發(fā)芽率、活力指數(shù)等指標(biāo)在中高質(zhì)量濃度都顯著降低。文獻(xiàn)報(bào)道20 nm PS塑料在質(zhì)量濃度 200 mg·L?1時(shí)對(duì)大豆（Glycine max）種子活力抑制最強(qiáng)，100 nm PS微塑料在高質(zhì)量濃度（1000 mg·L?1）時(shí)對(duì)種子活力抑制程度最強(qiáng)（吳佳妮等，2020），在高質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)大豆種子活力的抑制程度較大的結(jié)果與本研究花生種子活力指數(shù)的結(jié)果類似。其余作物種子活力受影響程度與微塑料的質(zhì)量濃度未表現(xiàn)一致相關(guān)性，對(duì)微塑料的敏感程度也不同。

種子平均發(fā)芽時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)芽越慢，種子對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的適應(yīng)越難。如圖1e所示，5 μm-MPs暴露下小麥平均發(fā)芽時(shí)間主要表現(xiàn)為低、中質(zhì)量濃度抑制，高質(zhì)量濃度促進(jìn)；花生主要表現(xiàn)為低、高質(zhì)量濃度抑制，中質(zhì)量濃度促進(jìn)；玉米主要表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度促進(jìn)，中質(zhì)量濃度抑制，高質(zhì)量濃度抑制減弱；向日葵則在50 mg·L?1時(shí)促進(jìn)，其余質(zhì)量濃度均抑制；谷子表現(xiàn)為 2、10、100 mg·L?1時(shí)抑制，其余質(zhì)量濃度促進(jìn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，水培條件下 5 μm-MPs對(duì) 5種作物的平均發(fā)芽時(shí)間影響均不顯著（P>0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道的聚甲基丙烯酸甲酯微塑料對(duì)小麥種子平均發(fā)芽時(shí)間無顯著影響的結(jié)果相似（連加攀等，2019）。

5 μm-MPs對(duì)作物水培7 d芽長(zhǎng)的影響如圖1f所示（因芽長(zhǎng)過短未測(cè)量谷子）。小麥主要表現(xiàn)為5 μm-MPs質(zhì)量濃度越高，芽長(zhǎng)越短，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著性差異?；ㄉ?00 mg·L?1時(shí)受到抑制并具有顯著性差異（P<0.05），其余處理無顯著規(guī)律。玉米在 10 mg·L?1時(shí)受到抑制，其余處理均得到促進(jìn)，向日葵的芽長(zhǎng)在各處理下均為促進(jìn)，但上述趨勢(shì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上不顯著。各作物種子芽長(zhǎng)對(duì)微塑料的敏感程度不同，其中花生芽長(zhǎng)對(duì)微塑料較敏感，花生芽長(zhǎng)在 100 mg·L?15 μm-MPs處理下受到顯著抑制。

圖1 不同質(zhì)量濃度微塑料暴露下5種作物的發(fā)芽情況Figure 1 Germination of 5 species of crops exposed to microplastics of different mass concentrations

綜合以上指標(biāo)可知，5種作物中花生種子的萌發(fā)對(duì)微塑料更敏感。微塑料影響種子萌發(fā)及活性的機(jī)制與水培條件較相關(guān)的可能主要有兩種，（1）微塑料的積累使種子表面孔隙物理性堵塞。微塑料具有疏水性，粒徑小、比表面積大，易附著于種子上，堵塞種子孔隙，抑制植物種子的水分吸收（李瑞靜等，2021），進(jìn)而影響種子萌發(fā)及活性。如Bosker et al.（2019）發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯熒光微塑料可在水芹（Lepidium Sativum）種衣殼的孔隙中積累。（2）微塑料進(jìn)入種子的細(xì)胞內(nèi)部，影響種子的生理活動(dòng)。如粒徑超過植物細(xì)胞壁孔徑的納米級(jí)塑料微珠可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入煙草（Nicotiana tabacum）BY-2細(xì)胞（cv.Bright Yellow 2）（Liu et al.，2009；Vera et al.，2012）?？紤]到實(shí)驗(yàn)中選用 5 μm-MPs的粒度，導(dǎo)致本研究結(jié)果的原因更可能以前者為主，花生對(duì)微塑料的敏感可能是由于花生某些結(jié)構(gòu)比其余4種作物更易于吸附或積累微塑料，表面孔隙的堵塞影響了花生種子吸收水分，進(jìn)而影響其活性、萌發(fā)及芽長(zhǎng)。文獻(xiàn)報(bào)道，0、0.1%、0.5%、1%、2%的PE微塑料（13、58、178 μm）均不同程度抑制了玉米和黃瓜（Cucumis sativus）種子的活力指數(shù)及芽長(zhǎng)，且與粒徑相比，微塑料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是植物種子發(fā)芽的影響更顯著（劉曉紅等，2022）。本研究中微塑料質(zhì)量濃度越大，花生發(fā)芽及活性受到的抑制越強(qiáng)，更可能是由于高質(zhì)量濃度下微塑料的團(tuán)聚行為對(duì)種子吸水的機(jī)械阻礙更大所致。

2.2 土培條件下 5 μm-MPs對(duì)作物生長(zhǎng)特性的影響

2.2.1 株高

土培實(shí)驗(yàn)結(jié)果可更好地反映作物的實(shí)際生長(zhǎng)情況，株高是反映土培效果的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)，如圖 2所示。小麥在土培 15 d時(shí)各質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5 μm-MPs下的幼苗株高均受到顯著抑制（P<0.05），且隨5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大受到的抑制減弱，處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20 mg·kg?1時(shí)受到的抑制最強(qiáng)[僅為(15.17±3.67) cm，較空白組抑制了10.82%]；在土培30 d時(shí)，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs處理下株高均受到抑制，且隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高抑制作用先增大后減小，在50 mg·kg?1時(shí)抑制最強(qiáng)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上各處理無顯著性差異（P>0.05）。廖苑辰等（2019）報(bào)道土培中5 μm PS對(duì)小麥株高有抑制作用，且在土壤中微塑料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50、100 mg·kg?1時(shí)對(duì)小麥株高均無顯著影響，這與本文土培中小麥株高的結(jié)果趨勢(shì)相似。對(duì)于玉米，除 50 mg·kg?15 μm-MPs在種植第15天和第30天時(shí)對(duì)幼苗株高有促進(jìn)作用外，其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為抑制作用，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抑制作用不顯著（P>0.05）。花生在土培 15 d時(shí)，幼苗株高在處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg·kg?1時(shí)受到抑制，其余處理受到促進(jìn)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上各處理影響均不顯著（P>0.05）；在土培30 d時(shí)，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs下株高均受抑制，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著影響（P>0.05）。

圖2 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米、花生的株高Figure 2 Plant heights of wheat, corn and peanut under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

就培養(yǎng)時(shí)間而言，土培條件下不同生長(zhǎng)時(shí)期中作物幼苗的株高對(duì)5 μm-MPs的敏感程度不同。微塑料在種植期間第15天對(duì)幼苗株高影響的顯著性頻次數(shù)據(jù)比第30天的大，生長(zhǎng)前期的微塑料影響機(jī)制可能主要為通過堵塞植物根部通道影響植物營(yíng)養(yǎng)水分傳遞，進(jìn)而影響株高，但細(xì)胞損傷可能可逆，隨著作物的生長(zhǎng)，作物幼苗對(duì)微塑料的抗性有所提高，削弱了微塑料的抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道，相比質(zhì)量濃度，PE微塑料對(duì)玉米株高有更顯著的粒徑效應(yīng)（劉曉紅等，2022）。本研究中較多質(zhì)量濃度下5 μm-MPs對(duì)作物株高的影響不顯著，符合前述文獻(xiàn)報(bào)道的規(guī)律，推測(cè)影響機(jī)制可能為根部的物理堵塞。

2.2.2 葉片葉綠素

植物葉綠素的含量反映了植物光合能力的強(qiáng)弱，是植物生理水平的重要指征，葉綠素儀能夠在種植過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物葉面的SPAD值并以此表示植物葉片葉綠素的相對(duì)含量。培養(yǎng)過程中花生葉片較小無法檢測(cè)其SPAD值，因此只檢測(cè)了小麥及玉米葉面SPAD值變化。如圖3a所示，小麥葉片的SPAD值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，各處理組中SPAD 值除 21 d 的 20 mg·kg?1和 50 mg·kg?1處理外，其余均低于對(duì)照組，在第17天的 50 mg·kg?1處理下顯著偏低（P<0.05）。Lian et al.（2020）報(bào)道0.1 mg·L?1和 1 mg·L?1的 PS 納米塑料可顯著提高小麥的SPAD值，這與本研究結(jié)果有差異，推測(cè)納米級(jí)別和微米級(jí)別微塑料對(duì)植物的影響機(jī)制不同（Tan et al.，2018），微塑料對(duì)植物生長(zhǎng)的影響與微塑料粒徑關(guān)系密切。如圖3b所示，培養(yǎng)過程中玉米葉片SPAD值隨種植時(shí)間呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，除第29天的100 mg·kg?1、第33 天的 20、100 mg·kg?1處理外，其余均低于對(duì)照組。在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，僅第33天的20 mg·kg?1處理顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。SPAD 值表示植物葉片葉綠素相對(duì)含量，上述SPAD值變化情況反映了作物葉面葉綠素含量變化趨勢(shì)，本研究結(jié)果說明不同作物的葉片葉綠素含量對(duì) 5 μm-MPs的敏感程度不同，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，作物對(duì)微塑料脅迫的反應(yīng)也有變化。文獻(xiàn)報(bào)道聚氯乙烯（PVC）微塑料在7 d內(nèi)對(duì)大豆幼苗光合效率影響不大，更長(zhǎng)時(shí)間則表現(xiàn)出微塑料低質(zhì)量分?jǐn)?shù)抑制，中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)恢復(fù)的趨勢(shì)（安菁等，2021），這與本文玉米葉片葉綠素含量結(jié)果在時(shí)間上的變化趨勢(shì)相似，可能是由于植物體內(nèi)葉綠素合成等相關(guān)轉(zhuǎn)化過程因植物更易于利用或吸收低濃度微塑料所致（廉宇航等，2022）。葉片的光合作用與葉片氮含量有關(guān)，通常葉片氮會(huì)分配到葉綠體中參與光合作用（Evans，1989；Warren et al.，2022）。小麥葉片葉綠素含量與葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)有一定相似性，而玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與葉綠素含量變化趨勢(shì)無一致性，印證了微塑料對(duì)不同作物的葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素含量影響機(jī)理可能存在差異。

圖3 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米生理指標(biāo)變化Figure 3 Changes of physiological indexes of wheat and corn under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

培養(yǎng)33 d時(shí)，如表1所示，相比對(duì)照組，5 μm-MPs各處理組小麥葉片的葉綠素 a質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低，20、100 mg·kg?1處理下葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著減少（P<0.05），其中 20 mg·kg?1處理最低（2.97 mg·g?1）；葉綠素 b 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨 5 μm-MPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加先降低后恢復(fù)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。玉米葉片葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比對(duì)照組均顯著下降（P<0.05），隨5 μm-MPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加均呈先降低后升高趨勢(shì)，其中20 mg·kg?1處理時(shí)葉綠素a及葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小，分別僅為 2.07 mg·g?1和 4.66 mg·g?1。5 μm-MPs使兩種作物的葉綠素a/b比值均降低，小麥在 20 mg·kg?1處理出現(xiàn)最小值（0.60），玉米在 50、100 mg·kg?1時(shí)均出現(xiàn)最小值（0.42）。黑藻（Hydrilla verticillata）在3 μm聚苯乙烯不同濃度脅迫下葉綠素總含量、葉綠素a和葉綠素a/b比值均顯著降低（張晨等，2021），與本文結(jié)果一致，與總?cè)~綠素含量受影響的機(jī)理類似，這也可能是因?yàn)槲⑺芰线M(jìn)入到植物體內(nèi)，抑制了葉綠素a、b的合成代謝途徑。文獻(xiàn)報(bào)道玉米的幼苗的根體積和根表面積與PE微塑料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（劉曉紅等，2022），本研究中高于 20 mg·kg?15 μm-MPs處理對(duì)小麥及玉米葉片葉綠素的脅迫效應(yīng)反而下降也可能與此有關(guān)，即較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料的團(tuán)聚作用削弱了微塑料與植物根系的接觸。

表1 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of chlorophyll a and chlorophyll b in wheat and corn under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

2.2.3 SOD活性

SOD是植物體中抗氧化作用的主要酶類，可清除生物體內(nèi)自由基，其活性水平體現(xiàn)了植物受外界逆境影響的程度（徐榮樂等，2010）。當(dāng)外界逆境超過承受閾值后，植物體內(nèi)的活性氧含量將超過正常的歧化能力，而對(duì)組織和細(xì)胞多種功能膜及酶系統(tǒng)造成破壞，抑制植物葉片內(nèi)的SOD活性（謝勇等，2021），SOD的活性下降幅度越大說明植物SOD體系受到的抑制越強(qiáng)。由圖3e可知，各處理組中小麥和玉米葉片SOD活性均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），但小麥的SOD活性隨5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升而先增加后減少，在20 mg·kg?1處理達(dá)到最小，與對(duì)照組相比下降了 35.5%；而玉米的 SOD活性隨著 5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升呈持續(xù)上升趨勢(shì)，20 mg·kg?1處理顯著抑制SOD活性且達(dá)到最小值（P<0.05），與對(duì)照組相比下降了50.6%。

5 μm-MPs暴露引起了小麥、玉米葉片SOD活性的顯著下降，5 μm-MPs的脅迫對(duì)兩種作物的抗氧化體系產(chǎn)生了不同程度的負(fù)面影響，20 mg·kg?1處理對(duì)兩者造成的負(fù)面影響更大。已有研究發(fā)現(xiàn)隨著PVC微塑料（<15 μm）質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，大豆的SOD濃度會(huì)顯著提高（安菁等，2021），這與本文中小麥、玉米SOD活性的變化趨勢(shì)不同，可能與不同作物抗氧化系統(tǒng)抗刺激和抗逆能力的差異有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道通過基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，塑料可以直接作用于根部誘導(dǎo)抗氧化活性相關(guān)基因的下調(diào)（孫曉東，2019），該機(jī)制可能是微塑料抑制植物 SOD活性的原因。

2.3 土培中碳、氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

葉片中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是反映植物生長(zhǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)。由于培養(yǎng)過程中花生葉片較小，無法檢測(cè)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，僅檢測(cè)小麥和玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化（圖3c、d）。小麥幼苗在生長(zhǎng)過程中，葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)除第21天的 20 mg·kg?1處理高于對(duì)照組外，其余均低于對(duì)照組；第29天在 100 mg·kg?1處理受到顯著抑制（P<0.05），相比對(duì)照組抑制率為8.43%，其余時(shí)間及處理下均無顯著影響（P<0.05）。玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在各時(shí)間、各 5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組均受到抑制，第29天在各5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組下均受到顯著抑制（P<0.05），抑制率在16%—23%之間，其余均無顯著影響（P<0.05）。有研究表明蔥（Allium fistulosum）暴露在聚酯纖維微塑料中其葉片中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低（de Souza Machado et al., 2019），5 μm-MPs在小麥及玉米幼苗的生長(zhǎng)中也可能存在類似機(jī)制。

微塑料會(huì)影響土壤中的可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而土壤的可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與植物生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系。如表2所示，種植小麥、玉米、花生的土壤在幼苗培養(yǎng)周期結(jié)束后，其 DOC、DTN、DNN、DAN、DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)相較培養(yǎng)前增加，而隨著土壤中5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，土壤中DNN質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降，其余4種指標(biāo)均上升。100 mg·kg?15 μm-MPs脅迫下，玉米土壤DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)最多，達(dá)到35.5 mg·kg?1。這與高質(zhì)量分?jǐn)?shù)聚丙烯微塑料可顯著增加土壤DON與DOC的報(bào)道相似（Liu et al.，2017）。

表2 培養(yǎng)前后作物土壤中可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fractions of some elements in crop soil before and after culture

土壤、微塑料、植物三者是相互作用、相互影響的（馮雪瑩等，2021），一方面高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的微塑料在土壤中可能刺激作物中某些酶的活性（陳熹等，2020；劉玲等，2021），進(jìn)而導(dǎo)致土壤中的碳元素和氮元素等主要營(yíng)養(yǎng)元素或其他微量營(yíng)養(yǎng)元素含量積累變化（Fei et al.，2020），而土壤環(huán)境營(yíng)養(yǎng)元素的變化可進(jìn)一步導(dǎo)致植物的株高、葉面氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)等生長(zhǎng)特性指標(biāo)的改變，如廉宇航等（2022）報(bào)道的0.1%的PE微塑料處理下大豆根部Fe含量升高，從而引起大豆葉綠素含量升高；另一方面微塑料通過影響植物生長(zhǎng)過程改變了土壤物質(zhì)的含量，如Zang et al.（2020）在研究PVC微塑料引起的植物-土壤系統(tǒng)中14C分配的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)污染會(huì)引起微生物活性和根系分泌物周轉(zhuǎn)率增加，從而使土壤中 DOC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。將土壤中氮磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)結(jié)合葉面氮含量變化趨勢(shì)看，僅玉米葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在添加微塑料后呈下降趨勢(shì)外，其余指標(biāo)變化趨勢(shì)并不具有一致性。玉米土壤氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與吾蘭（2021）的研究結(jié)果相似，該研究認(rèn)為植物吸收氮肥的主要形態(tài)是NO3?，微塑料增強(qiáng)了土壤中促進(jìn)NO3?轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性，因此微塑料積累可能會(huì)通過降低土壤有效養(yǎng)分而間接影響玉米生長(zhǎng)。而小麥的葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤DOC、DTN、DAN、DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)不一致，有研究認(rèn)為高等植物發(fā)達(dá)的根系增加了與微塑料顆粒相互作用的可能性（Sander et al.，2019），從而減少植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

目前研究認(rèn)為土培中微塑料影響作物生長(zhǎng)的機(jī)制可能有6種（Gabriela et al.，2017；Li et al.，2020；紀(jì)紅等，2021）：（1）尖銳、鋒利的微塑料可通過機(jī)械損傷降低植物細(xì)胞根長(zhǎng)和根細(xì)胞活力；（2）堵塞根部通道，控制植物營(yíng)養(yǎng)及水分傳遞；（3）微塑料可直接進(jìn)入細(xì)胞連接或細(xì)胞壁孔隙，造成植物細(xì)胞的破損，影響植物正常的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸；（4）改變土壤結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)，影響植物養(yǎng)分吸收及傳遞；（5）影響土壤-根系體系中的微生物；（6）污染物協(xié)同作用或轉(zhuǎn)運(yùn)有害物質(zhì)（劉沙沙等，2022；謝潔芬等，2022）。從培養(yǎng)時(shí)間看，土培中5 μm-MPs在種植第30天對(duì)作物除株高外的其余指標(biāo)的影響大于第15天，結(jié)合上述機(jī)制假說，5 μm-MPs對(duì)土培作物各監(jiān)測(cè)生理指標(biāo)的影響應(yīng)是多種機(jī)制綜合作用產(chǎn)生的。本研究中微塑料可能隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)伴隨土壤生物運(yùn)動(dòng)機(jī)械損傷而降低植物根細(xì)胞活性，同時(shí)也可能因比表面積較大，吸附于植物根細(xì)胞表面，發(fā)生物理堵塞根部通道，影響植物根對(duì)水及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而抑制植物光合作用及 SOD活性，而對(duì)光合作用的影響表現(xiàn)為抑制作物葉綠素的含量及葉面氮含量。而由于作物種類不同，其結(jié)構(gòu)、代謝途徑也有差異，因此影響的主導(dǎo)機(jī)制和作用方式也存在一定差異，微塑料對(duì)不同作物及同種作物的不同指標(biāo)影響程度也不盡相同。

3 結(jié)論

5 μm-MPs質(zhì)量濃度在 0—100 mg·L?1范圍內(nèi)，經(jīng)7 d種子發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）5 μm-MPs對(duì)小麥、玉米、向日葵、谷子的種子發(fā)芽能力和種子活力無顯著影響，對(duì)花生顯著抑制，質(zhì)量濃度越大抑制越顯著，100 mg·L?1處理與對(duì)照組相比發(fā)芽抑制率達(dá)到125.56%，抑制效果明顯。（2）與對(duì)照組相比，5 μm-MPs對(duì)5種作物種子的平均發(fā)芽時(shí)間均無顯著影響。

5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 0—100 mg·kg?1范圍內(nèi)，經(jīng)33 d土培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，（1）株高上，5 μm-MPs對(duì)玉米、小麥、花生3種作物大體表現(xiàn)為抑制，種植第15天未表現(xiàn)相同顯著影響趨勢(shì)，第30天時(shí)對(duì)3種作物均無顯著影響。（2）不同處理均可顯著誘導(dǎo)小麥、玉米葉片SOD活性下降，20 mg·kg?1處理下兩者葉片SOD相比對(duì)照組活性下降最大。（3）高質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs對(duì)小麥葉綠素表現(xiàn)為顯著抑制，中低質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)玉米葉綠素表現(xiàn)為顯著抑制；但均使兩者葉綠素a/b比值降低。（4）相比對(duì)照組，含有5 μm-MPs的土壤氮含量在種植后顯著增加，但5 μm-MPs處理組中小麥、玉米的葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在種植期間均偏低。