沈丹丹 沈川 程義 侯立新,*

(1 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測重點實驗室，重慶 401121；2 重慶綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401420)

阿莫西林/克拉維酸鉀組成的復(fù)方制劑最早由Beecham公司(現(xiàn)為葛蘭素史克公司)于1981年4月3日在英國上市，劑型為片劑，商品名Augmentin，規(guī)格為0.375 g(阿莫西林/克拉維酸：250 mg / 125 mg)。目前國內(nèi)阿莫西林/克拉維酸鉀復(fù)方制劑獲批的劑型有7種，本次國家評價性抽樣品種包括片劑、分散片、顆粒劑及膠囊劑4種劑型，片劑、分散片與顆粒劑現(xiàn)行標準為《中國藥典》2020年版二部(ChP2020)[1-3]，膠囊劑現(xiàn)行標準為注冊標準[4]，國外藥典美國藥典(USP43)[5]及英國藥典(BP2021)[6]均收載了復(fù)方制劑的質(zhì)量標準。按照法定標準檢驗，發(fā)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)均未對克拉維酸鉀引入的雜質(zhì)進行有效控制，不能反映產(chǎn)品中雜質(zhì)的真實含量，存在一定的安全性風險。目前國外藥典均僅對復(fù)方制劑中阿莫西林引入的雜質(zhì)進行了控制，相關(guān)文獻[7-8]也只研究了阿莫西林的雜質(zhì)來源及歸屬問題，而復(fù)方制劑中克拉維酸鉀的雜質(zhì)譜研究仍為空白。

本次評價的阿莫西林/克拉維酸鉀復(fù)方制劑共涉及3個組分比例(包括2:1、4:1、7:1)，存在規(guī)格多(共涉及9個規(guī)格)、主成分的量差異大的問題，因此可能存在主成分紫外吸收差異大的問題，特別是對于積分面積較小的主成分克拉維酸，其有關(guān)物質(zhì)容易被忽視。本研究針對阿莫西林/克拉維酸鉀復(fù)方制劑中雜質(zhì)控制不全面的問題，結(jié)合BP2021阿莫西林[9]和克拉維酸鉀[10]的雜質(zhì)譜，建立能同時測定制劑中阿莫西林和克拉維酸鉀的有關(guān)物質(zhì)HPLC檢查方法，重點分析克拉維酸鉀的雜質(zhì)歸屬和降解途徑，對未開展本品一致性評價的企業(yè)提供處方工藝及質(zhì)量研究基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器

沃特世液相色譜系統(tǒng)：美國Waters e2695型高效液相色譜儀， Waters 2489型紫外檢測器，Waters色譜工作站。德國Bruker Impact Ⅱ液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。Mettler Toledo XP 205十萬分之一電子天平。

1.2 藥品與試劑

阿莫西林雜質(zhì)A～雜質(zhì)M對照品、N-新戊酰阿莫西林對照品均來源于Toronto Research Chemicals；克拉維酸雜質(zhì)A對照品(Toronto Research Chemicals，批號：P840815，含量：98%)；克拉維酸雜質(zhì)B對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221202，含量：99.77%)；克拉維酸雜質(zhì)C對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221203，含量：97.96%)；克拉維酸雜質(zhì)D對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221204，含量：95.49%)；克拉維酸雜質(zhì)G對照品(Quality Control Chemicals Inc.，批號：QC221207，含量：98.28%)；來自國內(nèi)3個生產(chǎn)企業(yè)的11批克拉維酸鉀-微晶纖維素混粉(1:1)、2個生產(chǎn)企業(yè)的9批阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1、4:1、7:1)、4個生產(chǎn)企業(yè)的12批阿莫西林原料及23個生產(chǎn)企業(yè)的226批制劑均為2020年度國家評價性抽驗樣品；1批阿莫西林克拉維酸鉀片參比制劑[Glaxo Smith Kline，規(guī)格為0.375 g(阿莫西林/克拉維酸：250 mg/125 mg)，批號860950]；磷酸二氫鈉及磷酸均為分析純，甲醇為色譜純。

2 方法

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(YMC ODSAQ C18，4.6 mm×250 mm，5 μm )；以緩沖液[取磷酸二氫鈉7.8 g，加水1000 mL使溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(3.7±0.1)]為流動相A，以甲醇-緩沖液(90:10,V/V)為流動相B，按表1梯度洗脫；柱溫35℃；自動進樣器6 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為220和275 nm；進樣體積20 μL。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗溶液(1)

取阿莫西林雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、N-新戊酰阿莫西林對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，加水適量超聲使溶解后(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，用水定量稀釋制成含各雜質(zhì)約0.1 mg/mL的溶液，作為雜質(zhì)對照品貯備溶液(1)；阿莫西林雜質(zhì)F適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解后，用水定量稀釋制成含雜質(zhì)F約0.1 mg/mL的溶液，作為雜質(zhì)對照品貯備溶液(2)；另取克拉維酸對照品、克拉維酸雜質(zhì)D、克拉維酸雜質(zhì)G對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中各約含0.1 mg的溶液，作為雜質(zhì)對照品貯備溶液(3)。取阿莫西林雜質(zhì)J對照品約7.5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，精密加入上述雜質(zhì)對照品貯備溶液(1)、(2)及(3)各0.4 mL，加水適量超聲使溶解，保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃，并用水稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液(1)。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗溶液(2)

取克拉維酸雜質(zhì)A、雜質(zhì)B及雜質(zhì)C對照品各適量，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中各約含0.1 mg的溶液。精密量取0.5 mL，置20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液(2)。

2.2.3 供試品溶液

取本品的細粉或內(nèi)容物適量(約相當于阿莫西林75 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%，超聲使溶解后(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，用水稀釋至刻度，搖勻，離心取上清液。臨用新配。

2.2.4 對照品溶液

取阿莫西林及克拉維酸對照品各適量，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林約0.017 mg、克拉維酸約0.005 mg的溶液。此溶液可在6℃保持穩(wěn)定20 h。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”及“2.2.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

2.4 降解試驗

經(jīng)調(diào)研各企業(yè)處方工藝，目前國內(nèi)原料投料主要以克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)和阿莫西林克拉維酸鉀混粉2種方式，故本文中降解試驗重點考察了克拉維酸鉀的雜質(zhì)降解途徑。

(1)未降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(2)強酸降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，加入0.2 mol/L鹽酸溶液1.0 mL，搖勻，放置10 min，加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(3)強堿降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，在50℃水浴加熱1 h，冷卻至室溫，用0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(4)強氧化降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，加水至量瓶容積的70%(保持超聲水浴的溫度在10℃～15℃)，超聲使溶解后，加入1%過氧化氫溶液1.0 mL，放置10 min，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法進行空白試驗。

(5)高溫降解試驗：取克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，分別置10 mL量瓶中，置烘箱中105℃條件下加熱1 h，取出冷卻至室溫，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(6)強光降解試驗：取在4000 Lx下光照5 d的克拉維酸鉀-微晶纖維素(1:1)、阿莫西林克拉維酸鉀混粉(2:1)各適量(約相當于克拉維酸7.5 mg)，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

2.5 影響因素試驗

(1)高溫試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，40℃條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(2)高濕試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，在溫度20℃、相對濕度(70%±5%)條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

(3)光照試驗：取29個不同廠家的制劑及參比制劑各適量，去除外包裝，分別置開口的稱量瓶中，在(4500±500) Lx下光照5和10 d，照“2.2.3”項下配制供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

檢測波長220 nm下，系統(tǒng)適用性溶液(1)的色譜圖見圖1(A)，結(jié)果見表2，阿莫西林雜質(zhì)D1與阿莫西林雜質(zhì)B的分離度大于1.5，阿莫西林雜質(zhì)E1與克拉維酸雜質(zhì)G的分離度大于1.0；檢測波長275 nm下，系統(tǒng)適用性溶液(2)的色譜圖見圖1(B)，結(jié)果見表3，色譜峰出峰順序為：克拉維酸雜質(zhì)A、克拉維酸雜質(zhì)B、克拉維酸雜質(zhì)C。

表2 系統(tǒng)適用性溶液(1)測定結(jié)果(220 nm)Tab.2 The results of system suitability solution (1)(220 nm)

表3 系統(tǒng)適用性溶液(2)測定結(jié)果(275 nm)Tab.3 The results of system suitability solution (2)(275 nm)

3.2 克拉維酸鉀雜質(zhì)譜的分析

3.2.1 降解試驗

降解試驗結(jié)果(表4～5)表明，克拉維酸鉀對酸、堿、氧化均不穩(wěn)定，堿性條件主要降解產(chǎn)生雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D，酸性條件和氧化條件主要產(chǎn)生其他未知雜質(zhì)；阿莫西林對酸、堿及氧化均不穩(wěn)定，主要降解產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)J、雜質(zhì)K。降解試驗典型色譜圖見圖2。

表4 克拉維酸鉀的雜質(zhì)譜分析(220 nm)Tab.4 The results of the impurity profile of potassium clavulanate(220 nm)

3.2.2 影響因素試驗

結(jié)果表明，在高溫和高濕條件下，參比制劑與國內(nèi)仿制產(chǎn)品的阿莫西林和克拉維酸鉀均不穩(wěn)定，特別是高濕條件，典型色譜圖見圖3，克拉維酸鉀非常容易降解。在220 nm下，主要檢出阿莫西林的降解雜質(zhì)為阿莫西林雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F和雜質(zhì)K；在275 nm下，主要檢出克拉維酸鉀的降解雜質(zhì)為克拉維酸鉀雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C。

3.3 水活度與克拉維酸鉀雜質(zhì)的相關(guān)性研究

采用冷鏡露點法測定樣品水活度，水活度反應(yīng)了制劑中含自由水的量度值。不同企業(yè)水活度測定值與克拉維酸鉀的雜質(zhì)測定結(jié)果見圖4～7。結(jié)果表明，克拉維酸鉀雜質(zhì)的含量與水活度值大小呈正相關(guān)，證明水分含量中的自由水是直接影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

本研究對檢測波長進行了考察，采用PDA全波長190～400 nm掃描雜質(zhì)對照品，結(jié)果表明：(1)阿莫西林及阿莫西林雜質(zhì)均在190～300 nm范圍內(nèi)有一定吸收；(2)克拉維酸鉀、克拉維酸鉀雜質(zhì)D及克拉維酸鉀G均在190～240 nm范圍內(nèi)有一定吸收，且克拉維酸鉀在240 nm后基本沒有吸收；(3)克拉維酸鉀雜質(zhì)A、克拉維酸鉀雜質(zhì)B及克拉維酸鉀雜質(zhì)C均在210和275 nm處有最大吸收，在220～250 nm吸收很弱；(4)綜合各雜質(zhì)的紫外吸收差異，確定以雙波長測定阿莫西林克拉維酸鉀雜質(zhì)，以220 nm檢測波長測定阿莫西林雜質(zhì)及克拉維酸鉀雜質(zhì)D、克拉維酸鉀雜質(zhì)G，以275 nm檢測波長測定克拉維酸鉀雜質(zhì)A、克拉維酸鉀雜質(zhì)B、克拉維酸鉀雜質(zhì)C，從而達到一個色譜系統(tǒng)同時測定與控制兩個主成分的雜質(zhì)。

表5 克拉維酸鉀的雜質(zhì)譜分析(275 nm)Tab.5 The results of the impurity profile of potassium clavulanate(275 nm)

4.2 色譜條件的比對

國內(nèi)外藥典僅ChP2020與BP2021復(fù)方制劑質(zhì)量標準中收載了有關(guān)物質(zhì)檢測項目，均采用梯度洗脫(梯度時間均約為60 min)，但流動相組成及檢測波長均不相同(ChP2020為230 nm，BP2021為254 nm)，說明國內(nèi)外藥典色譜條件均不能有效控制在220～250 nm吸收很弱的克拉維酸鉀雜質(zhì)A、雜質(zhì)B及雜質(zhì)C，存在一定安全性風險的問題。因此，本研究建立了以雙波長測定紫外吸收差異較大的各雜質(zhì)含量，主要優(yōu)勢為：①能同時測定阿莫西林與克拉維酸鉀的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)；②各雜質(zhì)分離度更好；③測定的雜質(zhì)個數(shù)及雜質(zhì)總量更高，更能真實反映產(chǎn)品雜質(zhì)水平。

4.3 克拉維酸鉀雜質(zhì)降解途徑

通過對企業(yè)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)目前克拉維酸鉀合成工藝主要有兩種，一種以發(fā)酵液中的鏈霉菌棒狀體通過發(fā)酵合成克拉維酸叔丁胺，另一種直接以克拉維酸叔丁胺為起始物料。當克拉維酸鉀的β-內(nèi)酰胺環(huán)與水或其他親核基團反應(yīng)時，酰胺鍵的水解可能導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)的開環(huán)，β-內(nèi)酰胺基水解后可能發(fā)生一系列反應(yīng)。降解試驗及影響因素結(jié)果表明：在酸性條件下，克拉維酸鉀主要在220 nm下降解產(chǎn)生未知雜質(zhì)，主要未知雜質(zhì)RRT分別為0.28、0.63和1.09；在堿性條件下，在220 nm下產(chǎn)生克拉維酸鉀雜質(zhì)D，在275 nm主要下產(chǎn)生克拉維酸鉀雜質(zhì)A、克拉維酸鉀雜質(zhì)B和克拉維酸鉀雜質(zhì)C；在氧化條件下，主要在220 nm下降解產(chǎn)生未知雜質(zhì)；高溫及高濕條件下，主要降解產(chǎn)生克拉維酸鉀雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C。結(jié)合克拉維酸鉀的合成工藝，本研究推測了克拉維酸鉀的雜質(zhì)譜，即克拉維酸鉀雜質(zhì)G是路線一的發(fā)酵副產(chǎn)物，并非降解雜質(zhì)，而雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C和雜質(zhì)D為主要降解雜質(zhì)。

4.4 水活度與雜質(zhì)的相關(guān)性

克拉維酸鉀雜質(zhì)的含量與水活度值大小呈正相關(guān)，說明本品對高濕極為敏感，提示國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴格控制環(huán)境濕度，選擇密封性好、防潮功能強的包裝材料，以避免在生產(chǎn)、貯存過程中吸收水，或者避免水活度在不同成分或者包裝系統(tǒng)中遷移，以保證產(chǎn)品的持續(xù)穩(wěn)定性。ChP2020規(guī)定本品均應(yīng)在涼暗處干燥保存(遮光并不超過20℃)，原研制劑說明書中規(guī)定在25℃以下的溫度下存放，并存放在原始包裝中以防潮，因此建議國內(nèi)說明書應(yīng)考慮到開封后的防潮能力和產(chǎn)品質(zhì)量，以保證產(chǎn)品的安全性。

4.5 小結(jié)

目前國內(nèi)外藥典收載的阿莫西林克拉維酸鉀復(fù)方制劑質(zhì)量標準均缺失克拉維酸鉀雜質(zhì)的有效控制方法，而本品存在穩(wěn)定性差、極容易降解產(chǎn)生雜質(zhì)的問題，現(xiàn)行標準不能滿足本品的有關(guān)物質(zhì)檢查，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不可控，容易引起安全性風險。本研究建立了以雙波長同時測定阿莫西林及克拉維酸鉀雜質(zhì)的HPLC方法，該方法靈敏度高，分離效果好，能同時測定兩個活性成分的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，并且能對兩個活性成分引入的雜質(zhì)分別進行歸屬與控制。本研究中克拉維酸鉀在酸性及氧化條件下產(chǎn)生的較大未知雜質(zhì)還有待進一步研究。