紀(jì) 濤,任建政,李正華,陳小龍

(1.武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院，陜西 西安710054；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安710068)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)作為一種原發(fā)性惡性腫瘤，起源于人體骨骼形成和發(fā)展過程，發(fā)病人群一般為青少年，全球年發(fā)病人數(shù)高達(dá)4～5萬，且呈逐年上升趨勢[1-2]。臨床中針對骨肉瘤患者，常采用放療和化療等保守方法治療，必要時(shí)需要進(jìn)行手術(shù)切除。盡管在一定程度上緩解了病情發(fā)展，但是復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者尚不能得到徹底治愈[3-4]。所以，尋找新穎、廉價(jià)高效的藥物用于臨床治療骨肉瘤顯得極為迫切。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PTL)是一種倍半萜類化合物，單體可從菊科植物中提取獲得，具有顯著的抗炎癥和抗腫瘤作用，因其來源豐富、價(jià)格低廉、獲取成本低、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)而廣受科研工作者的青睞[5]。然而，PTL對骨肉瘤的作用及分子機(jī)制尚不清楚。本研究檢測PTL對體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞活性和凋亡的作用，通過細(xì)胞和分子水平探究PTL促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用及信號通路，為臨床防治骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PTL(批號552337)購自北京百靈威科技有限公司，人骨肉瘤細(xì)胞(U2OS細(xì)胞)購自上海信裕生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，血清購自美國康寧公司，Bax(批號A00183)、Caspase 3(批號BA2142)、Bcl-2(批號A00040-2)單克隆抗體均購自武漢博士德公司，Cleaved-Caspase 3(批號ab32042)購自英國Abcom公司，TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(批號QIA33)抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，轉(zhuǎn)膜儀(型號：TY-201-01)購自南京中科通儀公司，Real time RCR儀(型號qTOWER 2.0)購自德國耶拿公司，拍照顯微鏡(型號XSP-63)購自寧波湛京公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PTL對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響：骨肉瘤細(xì)胞用α-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素)，細(xì)胞復(fù)蘇后，待細(xì)胞鋪滿瓶底，加入胰酶，消化2 min，之后加入培養(yǎng)基終止，離心并重懸細(xì)胞，得到濃度為1×104/ml的細(xì)胞懸液。使用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，使用PTL濃度以此為0、5、10、20、40 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，10 μl CCK-8反應(yīng)液逐孔加入，培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞吸光度(波長設(shè)置為490 nm)。

1.2.2 流式細(xì)胞雙重染色法檢測細(xì)胞凋亡：向T-25培養(yǎng)中加入5 ml培養(yǎng)液(細(xì)胞濃度為1×105/ml)，實(shí)驗(yàn)分為：對照組(0 μmol/L PTL組)；PTL組(5、10、20、40 μmol/L)，培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，收集細(xì)胞，細(xì)胞與FITC-AnnexinV+ PI反應(yīng)液，避光孵育10 min，然后上機(jī)，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：將潔凈的玻片置入6孔板，用吸管吸取賴氨酸對玻片進(jìn)行涂抹處理，放入培養(yǎng)箱過夜，次日加入濃度為104/ml的細(xì)胞懸液，每孔2 ml，待細(xì)胞貼壁后，換用含PTL(20 μmol/L)或不含PTL的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，步驟參看TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。

1.2.4 蛋白印跡法檢測Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3蛋白表達(dá)：待細(xì)胞(105/孔)貼壁后，換用含PTL或不含PTL的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，置于冰上，每管加入RIPA裂解液300 μl，經(jīng)離心，變性得到蛋白樣品。使用伯樂電泳設(shè)備進(jìn)行SDS電泳和半干轉(zhuǎn)，最終蛋白完整地轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜經(jīng)過PBST浸泡和洗滌，用5%脫脂牛奶封閉1 h，用一抗稀釋液稀釋抗體得到 Bcl-2(1∶1500)、Bax(1∶1500)、GAPDH(1∶3000)、Cleaved-Caspase 3(1∶1500)和Caspase 3(1∶1000)一抗稀釋液，抗體完全浸沒PVDF膜后，在搖床上4 ℃孵育過夜，次日，將膜用PBST洗滌3次后，加入顯色液，使用伯樂ECL成像儀顯色，拍照，用Image Lab6.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.5 Real time PCR檢測Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3 mRNA表達(dá)：細(xì)胞處理分組和步驟與1.2.4一致。培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)基，用1 ml Trizol裂解細(xì)胞5 min，收集至離心管，經(jīng)過離心沉淀等步驟，得到RNA，用DEPC處理過的純水溶解RNA。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒，將反應(yīng)液、引物和cDNA模板按照比例混勻并加入96孔板，使用德國耶拿Qtower96G熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測并分析。各基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 PTL對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響 見圖1。CCK-8結(jié)果表明，PTL濃度為5、10 μmol/L時(shí)，對骨肉瘤細(xì)胞活性沒有顯著抑制作用(均P>0.05)。隨著PTL濃度梯度增加，當(dāng)PTL濃度為20、40 μmol/L時(shí)，PTL對骨肉瘤細(xì)胞活性的抑制作用明顯增加，與對照組相比，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，但20、40 μmol/L PTL對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2 PTL對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 見表2(圖2)。10、20 μmol/L的PTL對細(xì)胞凋亡無顯著影響(均P>0.05)。隨著濃度的增加，PTL(20、40 μmol/L)顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，但20、40 μmol/L PTL對骨肉瘤細(xì)胞的促凋亡作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，因此，在本研究中，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用20 μmol/L PTL。采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，PTL顯著促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組間細(xì)胞凋亡率比較(%)

注：與對照組相比，*P<0.05

2.3 PTL對骨肉瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 見圖3、4。結(jié)果顯示，20 μmol/L PTL 顯著上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白水平表達(dá)(均P<0.05)，顯著抑制抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)(均P<0.05)。Caspase 3作為細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，20 μmol/L PTL顯著促進(jìn)Caspase 3 mRNA和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)，且促進(jìn)Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值上調(diào)(P<0.05)，最終致使骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，與對照組相比，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05

注：與對照組相比，*P<0.05

3 討 論

文獻(xiàn)[6]報(bào)道，PTL具有優(yōu)異的抗癌活性，且對正常細(xì)胞無不良反應(yīng)。大量研究[7]證明，PTL對多種腫瘤細(xì)胞均具有抗腫瘤作用。本研究通過細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度的PTL(5、10 μmol/L)對骨肉瘤細(xì)胞活力無顯著影響，20、40 μmol/L PTL可以有效促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 μmol/L為工作濃度。通過Western blot和Real time PCR檢測PTL對骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響。

凋亡，是由眾多細(xì)胞內(nèi)外信號通路參與調(diào)控，各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和凋亡信號傳導(dǎo)通路傳至細(xì)胞內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄激活，激活靶基因產(chǎn)生效應(yīng)，引起凋亡，是由調(diào)控細(xì)胞，維持細(xì)胞新陳代謝的重要機(jī)制[8]。細(xì)胞凋亡可以由不同的刺激物誘導(dǎo)，例如細(xì)胞毒性藥物、輻射和缺氧應(yīng)激。藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)[9]。Bcl-2具有抗凋亡的功能，Bax具有促凋亡的功能[10-12]，它們均屬于Bcl-2家族蛋白。細(xì)胞凋亡的走向取決于Bax/Bcl-2比值。本研究中，PTL顯著促進(jìn)促凋亡Bax，并抑制Bcl-2的表達(dá)，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比例升高，引發(fā)細(xì)胞凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道，Caspase 系列酶激活在Fas 引發(fā)的外源性凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[13]， Caspase 8 的活化是反應(yīng)的起始酶，Caspase 8的活化作為中間酶激活下游酶Caspase 9和Caspase 3[14]。Caspase 3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，也是最著名的細(xì)胞凋亡標(biāo)志物之一，是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，Caspase 3一旦被激活,預(yù)示著細(xì)胞凋亡的發(fā)生將不可逆轉(zhuǎn)[15-17]，Cleaved-Caspase 3是Caspase 3蛋白水解產(chǎn)物。Caspase 3一旦被水解活化，就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核切割特定的底物。本研究中，用PTL處理骨肉瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)相比對照組，處理組細(xì)胞凋亡百分比顯著增加，而Western blot和Real time PCR結(jié)果也顯示Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值上調(diào)，該結(jié)果從分子水平證實(shí)PTL促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

有文獻(xiàn)報(bào)道，PTL可通過上調(diào) Bax 和降低Bcl-2 mRNA 表達(dá)誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞PC-3發(fā)生凋亡[18],也有研究顯示，PTL通過促進(jìn) HepG2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。也有研究表明PTL通過誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞周期產(chǎn)生阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，PTL的抗腫瘤作用可能抑制了STAT3/E2F1信號通路[20]，本研究證實(shí)PTL通過增加Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，在后續(xù)研究中，需要進(jìn)一步從活性氧和細(xì)胞周期方面對PTL的促凋亡作用進(jìn)行深入研究。

本研究證實(shí)PTL下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax表達(dá)、最終導(dǎo)致Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比例上調(diào),引發(fā)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此，本研究為PTL用于臨床治療骨肉瘤提供了理論依據(jù)。